专利名称：鉴定马尔尼菲青霉菌的专用探针与基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定马尔尼菲青霉菌的专用探针与基因芯片。
背景技术：
随着艾滋病(AIDS)患者的不断增多，机会性真菌感染的发病亦在飞速增加，其中 由马尔尼菲青霉引起的侵袭性青霉病已经成为东南亚地区和我国广东、广西地区AIDS患 者的标志性机会性真菌感染。快速准确地鉴定这一重要病原菌，对于我国AIDS患者的综合 防治具有十分重要的意义。 传统用于马尔尼菲青霉菌感染的检查手段主要包括真菌镜检、培养、鉴定以及抗 真菌药物敏感性测定等，但是这些方法往往需时长，大约需要3-4周；而且检测的阳性率 低。快速、敏感、特异地检测马尔尼菲青霉菌，已成为临床上迫切需要解决的重要问题，这一 问题的解决，对于正确的诊断、合理选择敏感的药物并制定治疗方案具有十分重要的意义。
分子生物学相关的从临床标本中直接检测真菌的技术和方法正在不断发展中，最 为活跃的PCR技术较真菌培养等方法具有快速、敏感等特点，该技术可以扩增血清、血浆、 全血、尿液、痰液、支气管肺泡灌洗液和脓液等标本中的真菌成份。但是，目前仍然不能快 速、特异地检测临床标本中的马尔尼菲青霉菌。 导流杂交技术(Flow-through hybridization, US专利号6020187和5741647)是 将探针固定在质基体上，检测样品流经置于导流杂交装置的质基体时，耙序列与探针杂交 形成复合体，然后通过显色来检测杂交复合体从而反映出被检测样品中的核酸靶分子。这 项技术较传统的杂交方法具有特异性强、快速的特点，如果能够将这项技术与高通量低密 度基因芯片技术和灵敏性高的PCR技术结合起来，则可以在检测临床标本中的马尔尼菲青 霉菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定马尔尼菲青霉菌的专用探针与基因芯片。
本发明提供了一种鉴定马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的专用探针， 由如下8个DNA片段中的至少一个组成核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列4的4 个DNA片段和核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列4的反向互补序列的4个DNA片 段。以上8个DNA片段，均是根据马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)的保守序列设 计的，其中每个DNA片段，或每两个DNA片段、每三个DNA片段、每四个DNA片段，……，直 至全部DNA片段的组合，均可用于鉴定马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)。
本发明还保护用于鉴定马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的DNA芯片， 含有以上任一所述的专用探针。 本发明同时保护鉴定马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的装置，包括以 上任一所述的专用探针或以上任一所述的DNA芯片。所述装置还可包括序列表的序列5和 序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对。为了便于检测待测DNA与所述探针的杂交结果，
3所述引物对上可标记有生物素。 以上任一所述的专用探针、以上任一所述的DNA芯片或以上任一所述的装置均可应用于鉴定马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)。 本发明还保护一种鉴定马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的方法，是将待测菌株的rDNA的ITS区分别与所述专用探针杂交，如果结果为阳性，待测菌株为马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)，如果结果为阴性，待测菌株为非马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)。所述待测菌株的rDNA的ITS区具体可为以待测菌株的总DNA为模板，用序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对进行PCR扩增得到的。 本发明还保护一种检测样本中是否含有马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤
(1)以待测样本的总DNA为模板，用序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对进行PCR扩增，得到目标DNA ;(2)将目标DNA分别与序列表的序列l(PMl)至序列表的序列4 (PM2)所示DNA片段进行杂交，根据杂交结果评判如下如果序列1禾P /或序列2的杂交结果为阳性，所述样本中含有马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei);如果序列3和/或序列4的杂交结果为阳性，所述样本中可能含有马尔尼菲青霉菌。
本发明还保护一种检测样本中是否不含有马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤(1)以待测样本的总DNA为模板，用序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对进行PCR扩增，得到目标DNA ; (2)将目标DNA分别与序列表的序列1至序列表的序列4所示DNA片段进行杂交，根据杂交结果评判如下如果序列1和/或序列2的杂交结果不为阳性，所述样本中不含有马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei);如果序列3 (A-P-SPECl)和/或序列4(A-P-SPEC2)的杂交结果不为阳性，所述样本中不含有马尔尼菲青霉菌。
本发明利用PCR法检测真菌最常用的靶序列之 一 -内转录间区(Internaltranscriptional space, ITS)，这是一个多拷贝的串联重复序歹lj，其28s、5. 8s和18s rDNA在种间具有保守性，故可以用于设计通用引物，然后进行PCR扩增；而ITS1和ITS2区具有可变性，因此可以进行种特异性探针的选择。本发明中将种特异性探针包被在低密度基因芯片膜上，然后将上述PCR产物通过基于导流杂交技术的检测平台，与低密度基因芯片膜上的种特异性探针进行导流杂交并显色，从而最终实现临床标本中马尔尼菲青霉菌的快速检测。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验
方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自
常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中所用的DNA片段如下 针对马尔尼菲青霉菌的核酸rDNA的ITS区的特异性探针
马尔尼菲青霉特异性探针PM1 (Penicillium marneffei) :5，-ACCGGGGCCACCCGGTCGCCG_3，；序列表的序列1。
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PM2(Penicilli咖marneffei) :5， -TGTGAACCCTGATGAAGATGGA-3';序列表的序列2。 A-P-SPEC1 :5， -TCCTCGAGCGTATGGGGCT-3';序列表的序列3。 A-P-SPEC2 :5， -CGGCTTGTGTGTTGGG-3';序列表的序列4。 将上述探针分别包被在基因芯片膜(硝酸纤维素膜)上。 扩增马尔尼菲青霉菌的rDNA的ITS区的引物对(引物上标记有生物素) Forward :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA-3';序列表的序列5 ; Reverse :5' -CGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCG-3';序列表的序列6。 以下实施例中所用的马尔尼菲青霉菌样本购自北京大学真菌和真菌病研究中心
菌种保藏中心，每个菌种样本的编号如下 马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei) :BMU3156。 非马尔尼菲青霉菌的致病性真菌 白念珠菌(Candida albicans) :ATCC24433 ;近平滑念珠菌(Candida parapsilosis) :ATCC22019 ; 实施例1、马尔尼菲青霉菌的检测 分别将含有马尔尼菲青霉菌的样本按照标准方法提取基因组DNA，然后用上述引物对(序列表的序列5和序列6)进行PCR反应(约1. 5小时)，之后将PCR产物与标记有不同探针(分别为序列1至序列4所示探针)的硝酸纤维素膜通过医用核酸分子杂交仪进行导流杂交反应，根据反应的结果判断被检测样本中的菌种，所需时间为3. 5小时。结果见表l。 表1马尔尼菲青霉菌的鉴定结果
样本检测结果
马尔尼菲青霉菌 (Penicilliummarneffei)PM1、PM2阳性 A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性
白念珠菌 (Candidaalbicans)PA1、PM2阴性 A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阴性
近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)PM1、PM2阴性 A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阴性 实施例2、混合菌中马尔尼菲青霉菌的检测 将含有马尔尼菲青霉菌和其它种的病原真菌的混合菌的样本按照标准方法提取基因组DNA，然后用上述引物对(序列表的序列5和序列6)进行PCR反应(约1. 5小时)，之后将PCR产物与标记有不同探针(分别为序列1至序列4所示探针)的硝酸纤维素膜通过医用核酸分子杂交仪进行导流杂交反应(约2小时)，根据反应的结果可以判断被检测样本中是否存在马尔尼菲青霉菌，总共所需时间为3. 5小时。结果见表2。
表2混合菌中马尔尼菲青霉菌的鉴定结果
5混合菌种标本中的菌种检测结果
马尔尼菲青霉菌、白念珠菌和近平滑念珠菌PM1、PM2阳性 A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性 序列表 <110>北京大学第一医院 〈120〉鉴定马尔尼菲青霉菌的专用探针与基因芯片 〈130〉CGGNARY92638 〈160>6 〈210>1 〈211>21 〈212>DNA <213>人工序列 〈220〉 〈223〉 〈400〉 1 accggggcca cccggtcgcc g 21 〈210>2 〈211>22 〈212>廳 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉 〈400>2 tgtgaaccct gatgaagatg ga 22 〈210>3 〈211〉 19 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉 〈400>3 tcctcgagcg tatggggct 19 〈210>4 〈211>16 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉5/5页<223><400>4cggcttgtgt gttggg〈210〉5<211>27〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>〈400>5tccgtaggtg aacctgcggaaggatca〈210>6<211>27〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>〈400〉6cgcttattga tatgcttaagttcagcg
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2权利要求
鉴定马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的专用探针，由如下8个DNA片段中的至少一个组成核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列4的4个DNA片段和核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列4的反向互补序列的4个DNA片段。
2. 用于鉴定马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的DNA芯片，含有权利要求1 所述专用探针。
3. 鉴定马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的装置，包括权利要求1所述专用 探针或权利要求2所述DNA芯片。
4. 如权利要求3所述的装置，其特征在于所述装置还包括序列表的序列5和序列表 的序列6所示核苷酸组成的引物对。
5. 如权利要求4所述的装置，其特征在于所述引物对上标记有生物素。
6. 权利要求1所述专用探针、权利要求2所述DNA芯片或权利要求3至5中任一所述 装置在鉴定马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)中的应用。
7. —种鉴定马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的方法，是将待测菌株的 rDNA的ITS区分别与权利要求1所述专用探针杂交，如果结果为阳性，待测菌株为马尔 尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)，如果结果为阴性，待测菌株为非马尔尼菲青霉菌 (Penicillium marneffei)。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于所述待测菌株的rDNA的ITS区是以待测菌 株的总DNA为模板，用序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对进行PCR 扩增得到的。
9. 一种检测样本中是否含有马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的方法，其特 征在于所述方法包括如下步骤(1) 以待测样本的总DNA为模板，用序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸组成 的弓I物对进行PCR扩增，得到目标DNA ;(2) 将目标DNA分别与序列表的序列1至序列表的序列4所示DNA片段进行杂交，根据 杂交结果评判如下如果序列1和/或序列2的杂交结果为阳性，所述样本中含有马尔尼菲 青霉菌(Penicillium marneffei);如果序列3和/或序列4的杂交结果为阳性，所述样本 中可能含有马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)。
10. —种检测样本中是否不含有马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的方法， 其特征在于所述方法包括如下步骤(1) 以待测样本的总DNA为模板，用序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸组成 的弓I物对进行PCR扩增，得到目标DNA ;(2) 将目标DNA分别与序列表的序列1至序列表的序列4所示DNA片段进行杂交，根据 杂交结果评判如下如果序列1和/或序列2的杂交结果不为阳性，所述样本中不含有马尔尼菲青霉菌 (Penicillium marneffei);如果序列3和/或序列4的杂交结果不为阳性，所述样本中不 含有马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定马尔尼菲青霉菌的专用探针与基因芯片。本发明提供的鉴定马尔尼菲青霉菌专用探针，由如下8个DNA片段中的至少一个组成核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列4的4个DNA片段和核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列4的反向互补序列的4个DNA片段。本发明还提供了含有所述专用探针的用于鉴定马尔尼菲青霉菌的DNA芯片。所述专用探针、DNA芯片或装置均可应用于鉴定马尔尼菲青霉菌。本发明中将种特异性探针包被在低密度基因芯片膜上，然后将待测菌株的rDNA的ITS区通过基于导流杂交技术的检测平台，与低密度基因芯片膜上的种特异性探针进行导流杂交并显色，从而最终鉴定出马尔尼菲青霉菌。本发明具有特异性强、快速的特点，可以在检测临床标本中的马尔尼菲青霉菌时发挥快速、特异的积极作用。
文档编号C12N15/11GK101705300SQ20091023722
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月5日 优先权日2009年11月5日
发明者刘伟, 李若瑜, 许辉 申请人:北京大学第一医院