一种鉴定不同烟草品种的引物组、试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，特别地，本发明涉及烟草生物技术领域，更特别 地，本发明涉及一组引物组、一种试剂盒、引物组或者试剂盒在鉴别烟草品种和/或确定不 同烟草品种亲缘关系中的用途、一种鉴别烟草品种的方法和一种确定不同烟草品种亲缘关 系的方法。
【背景技术】
[0002] 在烟叶生产和卷烟配料过程中对烟草品种进行鉴别是非常重要的，只有这样才能 保证卷烟原料品种的准确性。而当前使用的烟草品种鉴别方法主要依据田间农艺性状、初 烤烟叶外观等，鉴别较难而且不准确，特别是对外观性状差异较小的品种，根据形态特征和 农艺性状很难鉴别。因此，利用分子标记技术开发准确、简单、快速和高效的品种鉴别技 术对促进烟叶和卷烟生产具有重要意义。马林等[烟草品种的SCAR标记鉴别，《中国烟草 学报》2012年，第5期，79-84页]利用6对SCAR引物对12个烟草品种复烤叶片的基因组 DNA进行SCAR-PCR扩增分析，根据6个SCAR标记在不同烟草品种中的扩增差异，建立了 12 个烟草品种的分子ID和鉴别路线，虽然能将12个品种完全鉴别开来，但是鉴别路线非常繁 琐，导致鉴别效率低下。因此，开发一种高效并节约成本的鉴别方法是十分必要的。
[0003] 其次，烟草品种资源是烟草品种改良的物质基础，关系到烟草育种的成败。对烟草 品种资源进行亲缘关系与遗传多样性分析，可为品种资源在烟草育种中的利用提供重要的 生物学和遗传学信息。目前我国烟草品种资源库共收集到5210份资源，是世界上烟草品种 资源保存数量最多的国家，20世纪90年代以来品种资源的研宄也已从形态学、细胞学、生 理生化等方面逐渐发展为以分子标记技术为核心的分子水平。目前，烟草遗传多样性与亲 缘关系分析研宄中的分子标记主要以ISSR、SRAP、RAPD、AFLP为主，都采用的是单重PCR技 术，扩增效率有待进一步提尚。
[0004] 多重引物PCR扩增技术（简称"多重PCR"）是指在普通PCR的基础上加以改进， 于一个PCR反应体系中加入两对及以上的引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域 扩增多个目的片段的一类特殊PCR技术。该技术能够适应高通量DNA指纹分析的需要，节 省DNA模板和试验耗材，简化操作步骤，加速试验进程。目前烟草多重引物PCR技术开发应 用仅仅在烟草病毒检测、烟草转基因检测等方面有报道，而在烟草品种鉴别、烟草亲缘关系 与遗传多样性分析方面还未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种通过DNA分子标记快速高效鉴别不同烟草品种或鉴 定烟草品种资源亲缘关系与遗传多样性的方法。
[0006] 依据本发明的一方面，本发明提供一组引物组，其特征在于，所述引物组包括，弓丨 物一，引物二，引物三和引物四的组合；和/或引物五和引物六的组合。
[0007] 所述引物一由SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2组成，所述引物二由SEQ ID N0:3和 SEQ ID N0:4组成，所述引物三由SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6组成，所述引物四SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成。引物一、引物二、引物三和引物四中的任意两个、任意三个以上 或者全部四个都能够在同一 PCR反应体系、同一反应条件下各自特异性结合到模板的不同 区域同时进行扩增反应，且扩增产物易于区分，这四个引物及其组合是发明人基于不同烟 草基因组DNA序列，经过长时间设计、优化以及大量组合试验筛选验证获得的。
[0008] 根据本发明的一个实施例，该引物组还包括引物五和引物六，所述引物五由SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10组成，所述引物六由SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12组成。引物 五和引物六能够在同一 PCR反应体系、同一反应条件下各自特异性结合到模板的不同区域 同时进行扩增反应，且扩增产物易于区分开，这两个引物及其组合是发明人基于不同烟草 基因组DNA序列，经过长时间设计、优化以及大量试验筛选和验证获得的。
[0009] 根据本发明的一个实施例，所述引物组包括引物七，引物八，引物九，引物十，引物 十一，引物十二，引物十三，引物十四和引物十五中的至少一个，所述引物七，引物八，引物 九，引物十，引物十一，引物十二，引物十三，引物十四和引物十五分别由SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:19 和 SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和 SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29 和 SEQ ID N0:30组成。这些引物是发明人基于不同烟草基因组DNA序列的差异，经过长时间设计、优 化以及大量试验筛选和验证获得的。以下引物1至引物15分别等同于引物一至引物十五。 [0010] 依据本发明的一方面，本发明提供前述本发明一方面的任一实施例中的引物组在 鉴别烟草品种和/或鉴定不同烟草品种的亲缘关系中的用途。
[0011] 依据本发明的另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括前述本发明一方面或者 任一实施例中的引物组。
[0012] 依据本发明的另一方面，本发明提供本发明一方面的试剂盒在鉴别烟草品种和/ 或鉴定不同烟草品种的亲缘关系中的用途。前述对本发明一方面的引物组的优点和技术特 征的描述，同样适用本发明这一方面的引物组的用途、试剂盒或试剂盒的用途，在此不再赘 述。
[0013] 依据本发明的再一方面，本发明提供一种鉴别烟草品种的方法，其特征在于，使用 了所述的引物组或者所述的试剂盒，具体的，该方法包括：提取待检烟草的基因组DNA ;利 用引物一、引物二、引物三和引物四对所述基因组DNA进行四重PCR，获得第一扩增产物，所 述引物一由SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2组成，所述引物二由SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4 组成，所述引物三由SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6组成，所述引物四SEQ ID NO: 7和SEQ ID N0:8组成；利用所述第一扩增产物鉴别所述待检烟草的品种，获得第一鉴别结果。
[0014] 所述待检烟草可以选自云烟97,云烟87,云烟85,云烟99,云烟105,毕纳1号， 金海1号，安烟2号，豫烟11号，青烟201，中烟103,中烟104, CF223, PVH2254, NC196， cokerl76，coker206，coker254，coker258，coker298，coker319，CZ-1，G23，HB030, K326， K346，K358，M373，MC944，MSK326，MS 云烟 87，NCl3，NC27NF，NC567，NC628，NC82，NC89，NC95， RGll，RG8，RG97，Samsun，SC71，TW90，Viginia，巴斯马，达白 I 号，达白 2 号，鄂烟 I 号，革新 3号，贵烟1号，贵烟2号，贵烟3号，贵烟4号，黄花烟，韭菜坪2号，娄山1号，马里兰，秦 烟201，秦烟96,晴降大黑烟，威宁白花烟，云朵一号，云烟201S和云烟317中的至少一种， 但并不限于这些烟草品种。
[0015] 烟草的基因组DNA可以来自烟草幼苗的叶片、叶芽和烟叶的至少之一，在本发明 的一个实施例中，烟草的基因组DNA是该种烟草幼苗的叶片、叶芽和烟叶三部分的DNA的混 合物。
[0016] 在本发明的一个实施例中，为得到较好的多重PCR结果，发明人经过大量时间优 化试验得到四重PCR的反应条件和反应体系，所说的经优化的四重PCR的反应程序包括： 10 个循环的{94°C 5min，94°C 30s，60°C 30s、每个循环降 0· 5°C，72°C 30s}，25 个循环的 {94°C 30s，55°C 30s，72°C 45s}和72°C IOmin ;和/或优化的四重PCR的反应体系包括： 5U/μL的EasyTaqDNA聚合酶0·25μL，10mmol/L的dNTPs0·5μL，含MgCL2的10XEasy Taq 溶液 2 μ L，20mmol/L 的 MgCl2I μ L，50ng/μ L 的相应引物的正反引物各 0· 25 μ L，20ng/ UL的基因组DNA 2yL，ddH20加至25yL。在本发明的一个实施例中，所述利用第一扩增 产物鉴别所述待检烟草的品种，包括：对所述第一扩增产物进行电泳检测，获得第一电泳结 果，基于所述第一电泳结果包含的特异性条带进行所述鉴别。所说的电泳结果包括电泳图， 染色后电泳图上的肉眼可清晰分辨的条带都可作为特异性条带，将第一电泳图对比已知品 种的烟草的DNA指纹图谱，包括对比二者的电泳条带的数目、条带的绝对位置和条带之间 的相对位置等，当待检烟草的扩增产物的电泳图与某种已知烟草的DNA指纹图谱一致或者 基本一致，即将该待检烟草鉴别为所说的已知品种。所说的DNA指纹图谱可以为一电泳图， 烟草的DNA指纹图谱库包含多种已知品种的DNA指纹图谱，烟草的DNA指纹图谱库可以通 过将各个已知品种的烟草，以与待检烟草同样的基因组DNA量、同样的多重PCR反应体系条 件、同样的电泳上样量、同样的电泳条件以及同样的染色条件等来获得，可以预先获得保存 备用，也可以在鉴别待检烟草时同时获得。
[0017] 根据本发明的一个实施例，在鉴别多种烟草的品种，例如20种烟草的时候，经过 上述四重PCR，可能不能完全区分鉴别出所有的品种，当第一鉴别结果中存在未能区分开 的品种时，该方法还可以包括以下步骤：利用引物五和引物六对所述第一鉴别结果中未鉴 别出的烟草的基因组DNA进行两重PCR，获得第二扩增产物，所述引物五由SEQ ID N0:9和 SEQ ID N0:10组成，所述引物六由SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:12组成，利用第二扩增产物 鉴别所述第一鉴别结果中未鉴别出的烟草的品种，获得第二鉴别结果；使得能进一步对第 一鉴别结果中未能鉴别开的品种进行鉴别。在本发明的一个实施例中，为得到较好的多重 PCR结果，发明人经过大量时间优化试验得到该两重PCR的反应条件和反应体系，所说的经 优化的两重PCR的反应程序包括：10个循环的{94°C 5min，94°C 30s，60°C 30s、每个循环降 0· 5°C，72°C 30s}，25 个循环的{94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s}和 72°C IOmin ;和 / 或优化 的两重PCR的反应体系包括：5U/ μ L的Easy Taq DNA聚合酶0. 25 μ L，lOmmol/L的dNTPs 0· 5 μ L，含 MgCLd9 10 X Easy Taq 溶液 2 μ L, 20mmol/L 的 MgCl 21 μ L，50ng/ μ L 的相应引物 的正反引物各0.25 μ L，20ng/μ L的基因组DNA 2 μ L，CldH2O加至25 μ L。在本发明的一个 实施例中，所述利用第二扩增产物鉴别第一鉴别结果中未鉴别出的烟草的品种，包括：对所 述第二扩增产物进行电泳检测，获得第二电泳结果，基于所述第二电泳结果包含的特异性 条带进行所述鉴别。所说的电泳结果包括电泳图，染色后电泳图上的肉眼可清晰分辨的条 带都可作为特异性条带，将第一电泳图对比已知品种的烟草的DNA指纹图谱，包括对比二 者的电泳条带的数目、条带的绝对位置和条带之间的相对位置等，当待检烟草的扩增产物 的电泳图与某种已知烟草的DNA指纹图谱一致或者基本一致，即将该待检烟草鉴别为所说 的已知品种。所说的电泳结果包括电泳图，染色后电泳图上的肉眼可清晰分辨的条带都可 作为特异性条带，将第二电泳图、可选的结合其相应的第一电泳图对比已知品种的烟草的 DNA指纹图谱库，包括对比电泳条带的数目、条带的绝对位置和条带之间的相对位置等，当 待检烟草的扩增产物的电泳图与某种已知烟草的DNA指纹图谱一致或者基本一致，即将该 待检烟草鉴别为所说的已知品种。所说的DNA指纹图谱可以为一电泳图，较佳的，已知品种 的DNA指纹图谱可以通过将各个已知品种的烟草，以与待检烟草同样的基因组DNA量、同样 的多重PCR反应体系条件、同样的电泳上样量、同样的电泳条件以及同样的染色条件等来 获得，可以预先获得保存备用，也可以在鉴别待检烟草时同时获得。
[0018] 根据本发明的一个实施例，利用引物七、引物八、引物九、引物十、引物十一、引物 十二、引物十三