菌、棘状外瓶酶菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、哈 氏孤菌、创伤孤菌，为广西壮族自治区水产科学研宄院分离保存。LAMP法DNA扩增试剂盒购 自北京蓝谱生物科技有限公司，货号SLP204,细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生 物科技有限公司，货号CW0522。
[0025] 2、LAMP引物的设计与合成 根据GenBank中的马尔尼菲青霉菌MP1序列，利用LAMP法引物辅助设计软件 PrimerExplorer V4软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物， 其中F3、B3为马尔尼菲青霉菌PCR检测引物，其中 F3 TCAAAGCTACTCTGG B3 TGGAGACCAATTCGC FIP CAGGGCCAAGGGCAGTCCCTCCAAAATGAGC BIP AGGAACCTCTTGTTCAGGCTGGCCTCCTCCTGTTGTTGCCTAAG 3、真菌基因组DNA提取 使用康为世纪生物科技有限公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取真菌基因组DNA。
[0026] 4、LAMP反应体系建立 按照试剂盒说明书，按25 μ 1体系配置： 2X反应缓冲液 12. 5 yL Bst DNA聚合酶 IyL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 马尔尼菲青霉菌DNA 2 μ L 超纯水 补足25 μ L。
[0027] LAMP反应在以实时浊度仪（LA-320C，日本荣研公司）进行密闭全程监控的形式 监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达 到〇. 1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，以试剂盒推 荐的6 3 °C做为反应温度。
[0028] 5、LAMP检测方法 1)特异性检测 提取马尔尼菲青霉菌、烟曲霉菌、腐皮镰刀菌、棘状外瓶霉菌、大肠杆菌、嗜水气单胞 菌、哈氏孤菌、创伤孤菌的基因组DNA作为LAMP反应的模板，同时以水作为对照，进行各菌 株的LAMP扩增，检验LAMP方法的特异性。
[0029] 2)敏感性检测 以提取的马尔尼菲青霉菌基因组DNA为模板，用外引物F3和B3进行PCR扩增，将目 的基因连接载体PMD-18T，进行克隆，提取单克隆菌的质粒，测定其浓度，经测序验证。用 RNA-Free Water将重组质粒pMD-18T-#/连续10倍倍比稀释成10个稀释度，取各稀释度2 μ L作为模板进行LAMP扩增。
[0030] 3)荧光可视化检测 根据浊度仪监控优化的条件，在反应前加入荧光染料，加入的染料为钙黄绿素商用染 料，63°C下反应60分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免 开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染。
[0031] 实施例1 LAMP检测方法的特异性结果 对1株马尔尼菲青霉菌、3株对照真菌、4株阴性对照菌和水对照进行LAMP扩增，结果 如图1所示，马尔尼菲青霉菌反应管在35分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，3株 对照真菌、4株阴性对照菌和水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果。
[0032] 实施例2 LAMP检测方法的敏感性结果 重组质粒pMD18-T-#/^J起始浓度为I. 7 X 10 1 ng/ μ L，经10倍倍比稀释后进行LAMP和 PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示LAMP法检测限约为I. 7X KT7 ng/ μ L，而PCR 法检测限为UXU^ng/yL。
[0033] 实施例3 LAMP检测方法的荧光可视化检测结果 根据浊度仪监控优化的条件，反应前加入荧光染料，63°C反应60分钟后，在紫外灯下 观察，图4为观察结果，左管为阴性对照，右管为以马尔尼菲青霉菌为模板的反应情况，表 明建立的方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的LAMP引物，加入样品 后，用低廉的水浴锅来保持63°C 60分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。
[0034] 实施例4马尔尼菲青霉菌定量标准曲线的绘制 设置对照：浓度为 I. 7 X IO1 ng/ μ L、I. 7 X 10° ng/ μ L、I. 7 X 10-1 ng/ μ L、I. 7 X 10_2 ng/ yL、l. 7X10_3ng/yL、l. 7X10_4 ng/yL、l. 7X10_5 ng/yL 的标准样品各一个，因为浓度的 负对数值与浊度值为〇. 1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如 表1)做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=〇. 4145x-8. 9968,如图5所示。从标准曲线方程 来看相关系数R2为〇. 9963，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方 数，则浓度为l〇_y，再乘以基数1.7,即为1.7 xKTng/yL。依据拷贝数换算公式copies/ μ L= (6.02 X IO23 X (ng/ul X ICT9)) / (DNA length X 660)，DNA length 为载体序列 大小加上目的基因序列大小，为2693+220=2913 bp，将其换算成拷贝数（copies/μ L):6. 02 x IO23 x (1.7 xl(Ty x KT9)/ (2913 x 660)，简化为：5·32χ 108χ10Λ 如某试验样品达 到浊度值为〇. 1的时间为25分钟，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于0. 534,则浓度 为1〇-°_534,再乘以基数1.7,即为样品的浓度为1.7 xlO^ng/yL，拷贝数为5. 32 X IO8 χ10_°_536,即为5.32x IO7 468 copies/yL，从而达到定量的效果。
[0035] 表 1
【主权项】
1. 一种马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP引 物、2X反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、焚光目视检测试剂、超纯水和马尔尼菲青霉菌DNA模 板，所述的LAMP引物包括外引物F3 (SEQ ID N0:1)与B3 (SEQ ID N0:2)和内引物FIP (SEQ ID NO :3)与BIP (SEQ ID NO :4); 其中引物的序列分别为： F3TCAAAGCTACTCTGG B3TGGAGACCAATTCGC FIP CAGGGCCAAGGGCAGTCCCTCCAAAATGAGC BIPAGGAACCTCTTGTTCAGGCTGGCCTCCTCCTGTTGTTGCCTAAG； 所述的2X反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2SCV Tween20、Betaine和dNTPs〇
2. 根据权利要求1所述的马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述 的马尔尼菲青霉菌DNA模板提取自细菌基因组DNA提取试剂盒。
3. 根据权利要求1所述的马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述 的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
4. 根据权利要求1所述的马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所 述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL45-50mM、KCL25-30mM、MgSO4 18-25mM、（NH4)2SO4 22_28mM、Tween20 0?3-0. 8%、Betaine2-3. 5M和dNTPs3_5mMo
5. -种马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，用于检测疑似马 尔尼菲青霉菌，具体检测步骤包括： (1) LAMP引物的设计与合成 (2) 马尔尼菲青霉菌DNA模板的提取 (3) LAMP反应体系建立 (4) LAMP检测方法。
6. 根据权利要求5所述的马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在 于，所述的LAMP反应体系建立LAMP以25yL计， 2X反应缓冲液 12. 5yL BstDNA聚合酶 IyL FIP 40pmol BIP 40pmol F3 5pmol B3 5pmol 马尔尼菲青霉菌DNA 2yL 超纯水 补足25yL。
7. 根据权利要求5所述的马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在 于，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
8. 根据权利要求5所述的马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在 于，所述的LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
【专利摘要】本发明公开了一种马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和马尔尼菲青霉菌DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3与B3和内引物FIP与BIP。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的LAMP检测方法可实时监测反应并且定量检测出马尔尼菲青霉菌的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速地检测马尔尼菲青霉菌带来便利。
【IPC分类】C12Q1-04, C12Q1-68, C12R1-645
【公开号】CN104726568
【申请号】CN201510095947
【发明人】何志义, 罗洪林, 钟小宁, 张建全, 蓝秀万, 毛从政, 张瑶瑶, 陈欢, 戴小英
【申请人】何志义
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月4日