0] 下游引物为：CCTGGAAAATAAAGCGTTGGT(SEQ ID NO:16);
[0031] 引物由上下游引物等量混合至5 μ Μ。
[0032] 3.扩增系统
[0033] 由 SYBR Premix Ex Taq?试剂组成。
[0034] 本发明的第四方面，提供了上述用于检测血清中IncRNA-NEATl的试剂盒的检测 方法，具体步骤如下：
[0035] 按常规方法抽血并取血清，富集血清中的小RNA ;
[0036] 由逆转录系统将RNA逆转录成cDNA ;
[0037] 用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定IncRNA-NEATl的含量。
[0038] 本发明的第五方面，提供了上述的检测血清中IncRNA-NEATl的试剂盒在制备诊 断肝癌的检测试剂盒中的应用。
[0039] 本发明所述的肝癌为原发性肝细胞癌等。
[0040] 本发明的IncRNA-NEATl可以作为肝癌诊断血清学标志物，本发明为诊断肝癌提 供了新临床手段。
【附图说明】
[0041] 图1为10个IncRNA在肝癌干细胞中的表达检测；
[0042] 图2为8对引物检测IncRNA-NEATl在血清中的表达量；
[0043] 图3为正常人与肝癌病人血清中IncRNA-NEATl的表达检测。
【具体实施方式】
[0044] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0045] 实施例1 !IncRNA-NEATl的筛选、鉴定
[0046] 前期我们利用高通量的IncRNA芯片筛选了与肝癌干细胞相关的IncRNA，从筛到 的IncRNA中选出了变化最显著的10个IncRNA，然后对其从Huh7肝癌细胞中富集的肝癌干 细胞中的表达进行PCR验证，结果发现IncRNA-NEATl在肝癌干细胞中表达最高（见图1)。
[0047] 目前认为肿瘤来源于肿瘤干细胞，因此这些结果提示IncRNA-NEATl在包括肝癌 等恶性肿瘤发生的早期即可能有作用，也提示了其在肿瘤诊断标志物方面可能具有一定的 应用价值。
[0048] 实施例2 :血清样本的采集、处理及提取其中的小RNA
[0049] (1)血清样本收集：收集约4ml肝细胞癌病人术前的外周血放入含EDTA的抗凝管 中，静置约1小时。
[0050] (2)血清样本处理：采集的外周血样品4000rpm 4°C离心10min，取上清分装于EP 管中，-80°C保存。
[0051] (3)提取血清中小RNA :每个血清样品均取350 μ 1，按照从Ambion公司购买的 mirVana?PARIS?Kit 提取小 RNA。
[0052] (4)逆转录成cDNA:每个样品取相同量RNA，用随机引物N6进行逆转录。按照 5XM-MLV RT Buffer 5 μ KM-MLV Reverse transcriptasel μ K rRNasinO. 5 μ I (Promega 公司）、dNTPsl μ 1、随机引物Ν61 μ 1、提取的小RNA 15ul、DEPC水（补充H2O使总体积达到 25 μ 1)进行逆转录。以上步骤所用的tip头、EP管均经过RNA酶灭活处理。
[0053] 实施例3 :引物设计与筛选
[0054] (1)引物设计：利用NCBI查得IncRNA-NEATl的全长序列（NR_028272. 1)，针对 IncRNA-NEATl的序列利用Primer Premier 5软件设计Real-time PCR的上下游引物8对 (如表1所示），由invitrogen公司负责引物合成。
[0055] 表1 :用于检测血清中IncRNA-NEATl设计的8对引物
[0056]
【主权项】
1. IncRNA-NEATl在制备肝癌诊断标志物中的应用。 2. IncRNA-NEATl在制备诊断肝癌的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
3. 根据权利要求2所述的IncRNA-NEATl在制备诊断肝癌的检测试剂或检测试剂盒中 的应用，其特征在于，所述的检测试剂或检测试剂盒为血清学检测试剂或试剂盒。
4. 根据权利要求2或3所述的IncRNA-NEATl在制备诊断肝癌的检测试剂或检测试剂 盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂或试剂盒用于检测生物样品中IncRNA-NEATl的 表达量。
5. 根据权利要求2或3所述的IncRNA-NEATl在制备诊断肝癌的检测试剂或检测试剂 盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂或试剂盒包括：对IncRNA-NEATl具有检测特异 性的探针、基因芯片，或PCR引物。
6. 根据权利要求4所述的IncRNA-NEATl在制备诊断肝癌的检测试剂或检测试剂盒中 的应用，其特征在于，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或 石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。
7. 根据权利要求4所述的IncRNA-NEATl在制备诊断肝癌的检测试剂或检测试剂盒中 的应用，其特征在于，所述的生物样品为血清。
8. 根据权利要求5所述的IncRNA-NEATl在制备诊断肝癌的检测试剂或检测试剂盒中 的应用，其特征在于，所述的对IncRNA-NEATl具有检测特异性的PCR引物如下： 上游引物为：GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQIDN0:15); 下游引物为：CCTGGAAAATAAAGCGITGGT(SEQIDN0:16)。
9. 一种检测血清中IncRNA-NEATl的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括： A、 逆转录系统，由逆转录体系缓冲液、随机引物N6、dNTPs、逆转录酶和RNA酶抑制剂组 成； B、 引物系统，由1对Real-timePCR的上、下游引物组成，引物序列如下： 上游引物为：GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQIDN0:15); 下游引物为：CCTGGAAAATAAAGCGITGGT(SEQIDN0:16); C、扩增系统，由SYBRPremix ExTaq?试剂组成。
10. -种利用如权利要求9所示的检测血清中IncRNA-NEATl的试剂盒的检测方法，具 体步骤如下： A、 按常规方法抽血并取血清，富集血清中的小RNA; B、 由逆转录系统将RNA逆转录成cDNA; C、 用扩增系统进行Real-timePCR扩增，测定IncRNA-NEATl的含量。
11. 一种如权利要求9所示的检测血清中IncRNA-NEATl的试剂盒在制备诊断肝癌的检 测试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明涉及医学生物检测技术领域，本发明利用lncRNA芯片筛选与肿瘤干细胞相关的lncRNA，结果发现lncRNA-NEAT1在肝癌干细胞中高表达并可以调节肝癌干细胞的功能。本发明提供了lncRNA-NEAT1在制备肝癌诊断标志物中的应用，以及lncRNA-NEAT1在制备诊断肝癌的检测试剂或试剂盒中的应用。进一步地，本发明人建立了人血清中lncRNA-NEAT1的检测方法和提供了血清中lncRNA-NEAT1检测的试剂盒，通过对肝癌病人血清的检测，发现在血清中能够检测到lncRNA-NEAT1，并且HCC病人血清中的lncRNA-NEAT1含量明显高于正常人。本发明为肝癌血清学诊断提供了新的临床手段。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104726570
【申请号】CN201510100528
【发明人】王红阳, 丁劲, 王林辉, 陈程, 曲乐, 李晓峰, 孙文, 王雪, 刘娜
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月6日