抗分化基因ha117在预判白血病预后的临床应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及一种抗分化基因 HA117的应用。
【背景技术】
[0002] 全身化疗是治疗肿瘤的主要手段，可以减少或者消除肿瘤的复发及转移。然而， 目前有两大主要因素制约了化疗的成功率：一是抗肿瘤药物具有毒性，二是肿瘤细胞对抗 癌药物的抗药性，尤其是"多药抗药性"，是癌症死亡病人的最主要死因，约占死亡病人的九 成。
[0003] "肿瘤细胞对一种抗癌药物产生抗药性时，对结构及作用机制不同的其他抗癌药 物也会产生交叉抗药性。"符立梧介绍，这种"多药抗药性"是肿瘤化疗失败的最重要原因， 目前临床上仍无良策。
[0004] HA117是一种新的抗维生素 A相关促分化作用的多药耐药基因。肿瘤耐药的最重 要原因，是肿瘤细胞膜上的'ABC转运泵'在肿瘤干细胞中的过度表达。"符立梧表示，"ABC 转运泵"的家族有49个成员，其中11个与多药抗药性有关。其中，最重要的当属ABCBl/ P-gp、ABCC1/MRP1、ABCG2/BCRP这三种跨膜蛋白的过度表达。它们可将抗癌药物泵出细胞 外，使抗癌药物在肿瘤细胞中的浓度降低，从而令肿瘤细胞产生抗药性。因此，如果能够及 时的发现在化疗过程中肿瘤细胞是否产生耐药性或者是能够构建肿瘤耐药细胞系以研宄 药物的治疗作用，对于提高肿瘤的治疗效果是十分有益的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抗分化基因 HA117在判断白血病危险度、疗效及预判白 血病预后的临床应用，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案。
[0006] 本发明涉及一方面涉及抗分化基因 HA117在预判白血病预后的临床应用，所述的 抗分化基因 HA117的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1，其特征在于包括如下步骤：取经化疗的白 血病细胞，检测其中是否含有及高表达抗分化基因 HA117以判断白血病细胞是否产生耐药 性，评估白血病预后。
[0007] 在本发明的另一方面，还涉及抗分化基因 HA117在制备耐药性肿瘤细胞系中的应 用。
[0008] 在本发明的一个优选实施方式中，所述的耐药性肿瘤细胞系是指对氟尿嘧啶 (5-FU)、长春新碱（VCR)、阿霉素（ADM)、柔红霉素（DNR)和/或环磷酰胺（CTX)产生耐药性 的细胞系。
[0009] 在本发明的另一个优选实施方式中，所述的制备耐药性肿瘤细胞系的步骤包括将 含HAl 17基因的重组腺病毒转染到肿瘤细胞系中，筛选阳性肿瘤细胞系。
[0010] 本发明的抗分化基因 HA117是耐药性肿瘤细胞系的标志物，因此通过检测抗分化 基因 HA117能够对白血病预后进行预判，通过制备耐药性肿瘤细胞系，用于肿瘤耐药性研 宄，对于提高肿瘤的治疗效果十分有益。
【具体实施方式】：
[0011] 实施例1 :
[0012] (1)用抗分化基因 HA117的重组腺病毒转染多种细胞后对多种抗癌药物的耐药性
[0013] 抗分化基因 HAl 17的DNA序列为SEQ ID NO. 1
[0014] 携带新基因 HA117的重组腺病毒
[0015] 采用改良的Adeasy-I腺病毒载体系统重组表达HA117基因的重组腺病毒 Ad5-HA117
[0016] 一、HA117 基因构建质粒 pAdTrack-HA117
[0017] 1.已克隆的HA117目的基因片段的收获
[0018] PCR扩增目的片段
[0019] PCR产物的纯化及鉴定
[0020] 2.含HA117目的基因的质粒pAdTraek-HA117的克隆合成
[0021] 1)酶切载体pAdTrack-CMV和目的基因 HA117
[0022] 2)用去磷酸化酶将酶切后的载体去磷酸化，收获载体DNA
[0023] 3)目的基因 HAl 17的DNA的纯化
[0024] 4) T4DNA连接酶连接载体和目的基因
[0025] 5)转导重组质粒入感受态细胞
[0026] 6) PCR法筛选克隆
[0027] 7)酶切鉴定重组质粒
[0028] 8)目的基因 HA117的基因测序鉴定
[0029] 二、腺病毒BJ-Adeasy细胞的制备
[0030] 三、重组腺病毒Adeasy-HAl 17构建
[0031] 1.限制性内切酶Pine 1酶切pAdTrack_HA117的质粒DNA
[0032] 2. CaC12法转导酶切后的质粒pAdTrack_HA117入腺病毒同源穿梭质粒BJ-Adeasy
[0033] 3.筛选出已导入 HAl 17 的质粒 BJ-Adeasy-HAl 17
[0034] 4.转导BJ-Adeasy-HAl 17入感受态细胞
[0035] 5·进一步酶切鉴定 Adeasy-HAl 17
[0036] 四、脂质体介导的方法将Adeasy-HAl 17转染入产病毒包装细胞HEK 293中及乒乓 感染，收获高滴度Ad5-HA117腺病毒
[0037] 五、RT-PCR方法从mRNA水平检测感染重组腺病毒HEK 293细胞HAl 17基因的表 达
[0038] 将携带新基因 HAl 17的重组腺病毒上清感染多种肿瘤细胞：K562细胞、Jurkat细 胞、Raji细胞、CW-2细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白和RT-PCR方法证实HAl 17基 因在目的细胞中呈高表达。采用MTT法分别检测高表达HAl 17基因的目的细胞抗癌药物敏 感试验判断HA117基因的耐药功能。瘤细胞药物敏感性实验结果显示：转染Ad-HA117重组 腺病毒后高表达HA117基因的k562细胞对VCR、ADM、Vp-16、DNR、MMC、CTX药物的耐药性均 比低表达HAl 17基因未转染的k562细胞增高，分别增高3-6倍（P < 0. 05或0. 01)，转染空 载体组耐药性跟未转染的k562细胞相比无显著差异（P > 0. 05)。可见高表达HAl 17基因 的目的细胞对本实验所检测到的几种药物VCR、ADM、Vp-16、DNR、MMC、CTX均产生了不同程 度的耐药性，耐药倍数3~10倍不等（见表1)。
[0039] 表1肿瘤细胞化疗药物敏感性实验结果（n=6，〗± s )
[0040]
【主权项】
1. 抗分化基因HA117在预判白血病预后的临床应用，所述的抗分化基因HA117的核苷 酸序列为SEQIDNO. 1，其特征在于，包括如下步骤：取经化疗的白血病细胞，检测其中是否 含有及高表达抗分化基因HA117以判断白血病细胞是否产生耐药性，判断白血病危险度、 疗效以及评估预后。
2. 抗分化基因HAl17在制备耐药性肿瘤细胞系中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的耐药性肿瘤细胞系是指对氟尿嘧 啶（5-FU)、长春新碱（VCR)、阿霉素（ADM)、柔红霉素（DNR)和/或环磷酰胺（CTX)产生耐药 性的细胞系。
4. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的制备耐药性肿瘤细胞系的步骤 包括将含HAl17基因的重组病毒转染到肿瘤细胞系中，筛选阳性肿瘤细胞系。
【专利摘要】本发明公开了抗分化基因HA117在判断白血病危险度、疗效及预判白血病预后的临床应用，本发明的抗分化基因HA117具有抗维生素A相关分化作用，是耐药性肿瘤细胞系的标志物，因此通过检测抗分化基因HA117能够对白血病预后进行预判，有益于提高肿瘤的治疗效果。
【IPC分类】C12N5-10, C12N15-12, C12N15-86, C12Q1-68
【公开号】CN104726569
【申请号】CN201510096382
【发明人】金先庆, 徐酉华, 刘行, 王宁, 郭玉霞
【申请人】金先庆
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月5日