基因多态性与重症患者预后的相关性及研究方法
【专利摘要】本发明公开了CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性。-415位点突变组患者比野生组患者生存情况更差，具有更高的30d死亡率，这一研究结果为预测重症患者预后提供了新的理论依据，同时也为重症患者的病理过程中神经内分泌免疫功能的调节提供了潜在的治疗靶点。
【专利说明】基因多态性与重症患者预后的相关性及研究方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学生物【技术领域】，涉及CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性及研究方法。
【背景技术】
[0002]多种不同病因的重症患者具有共同的全身炎症反应(SIRS)的病理生理过程，可以导致多脏器功能损伤和死亡。SIRS引起肾上腺交感系统兴奋为特征的应激反应，调节机体各系统的功能，这是严重病理状态下的重要代偿反应，与重症患者的预后密切相关。
[0003]嗜铬粒 蛋白A(ChromograninA，CHGA)是肾上腺髓质中含量最大的激素前蛋白，在体内可分解为一系列有多种生物活性的多肽片段，具有调节儿茶酚胺分泌，改善血管内皮细胞功能、抗菌、免疫趋化和调控心脏功能等多种重要的生理功能。本课题组前期的研究表明，CHGA的血浆浓度在重症患者中明显增高，且与患者的危重程度相关和预后相关。
[0004]已有的研究表明，CHGA启动子部分的多态性与影响机体的交感神经系统的活性，与高血压和高血压相关肾病的发病相关。我们的前期研究表明，CHGA血浆水平与重症患者的预后相关。这些结果均提示作为与儿茶酚胺共储存同分泌的肾上腺髓质的重要激素前蛋白CHGA，可能在重症患者应激反应的病理过程中的参与到机体代偿调节的核心机制。
[0005]转录的起始是基因表达的关键阶段，启动子的结构可以通过影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。CHGA启动子的基因多态性是否与重症患者的预后相关，还从未有研究。我们假设CHGA的启动子的SNP会影响到重症患者预后，在本前瞻性队列研究中，我们筛选出已知对CHGA表达有显著意义且MAF较高的启动子位点-462 (rs9658634)，-415 (rs9658635)，通过对SNP基因型和重症患者的临床特点的分析，验证相关CHGA的SNP因素是否对重症患者预后的影响。
【发明内容】
[0006]本发明在于CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性。
[0007]进一步，-415位点突变组患者比野生组患者生存情况更差，具有更高的30d死亡率。
[0008]本发明还提供CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性研究方法:首先准备全血总DNA提取试剂盒、DNATaq酶、DNAlOOOMaker以及引物，选择入住I⑶的患者，对患者进行DNA提取并进行CHGA-415/462位点基因型分型；记录所有患者一般情况，对所有患者进行入住ICU第Id的危重症评分，以30d死亡率作为评估终点。
[0009]进一步，全血总DNA提取试剂盒为北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组提取试剂盒，货号DP319，所述DNATaq酶、DNAlOOOMaker以及引物均购自大连宝生物工程有限公司，引物序列由Primer5软件设计:上游AGGGAAGGGAGAACAG，下游:CGTTGTCCAGAAGGCAGTAGG。
[0010]进一步，入住ICU的患者的选择，排除以下情况的患者:入住I⑶不足24h ;病例资料不全；未获得知情同意书签字；多次入住I⑶患者；神经内分泌肿瘤及肿瘤晚期患者；心肺骤停后复苏；少数民族和外籍患者；DNA提取及PCR扩增实验失败的患者。
[0011]进一步，对患者进行DNA提取并进行CHGA-415/462位点基因型分型过程为患者入住I⑶后24h内，收集患者外周静脉血5 ml按照全血总DNA提取试剂盒说明书进行全血基因组提取，基因型的测定通过PCR目的片段扩增和基因测序判定，按照天根DNA萃取柱提取技术操作使用外周血Iml经蛋白酶K处理后提取DNA，DNA浓度为25~30ng/ml，使用70ngDNA作为模板用于目的片段扩增，PCR扩增体系:DNA1.5μ 1，上下游引物各1.0 μ 1，DNATaq酶预混Mixl2.5μ I, ddH208 μ 1，目的片段长度为353bp，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序，并进行-415/462SNP位点基因型鉴定，基因型测定为盲法执行。
[0012]进一步，记录所有患者一般情况包括年龄、性别、感染情况、有无感染、白细胞计数、降钙素原、呼吸功能相关情况、循环情况、肝肾指标；对所有患者进行入住ICU第Id的危重症评分:APACHEII评分、SAPSII评分、SOFA评分。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是CHGA-415T/C多态性对重症患者死亡影响的生存分析曲线。
【具体实施方式】
[0014]1.1材料准备:
[0015]全血总DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司:血液基因组提取试剂盒，货号DP319)，DNATaq酶、DNAlOOOMaker以及引物均购自大连宝生物工程有限公司，引物序列由 Primer5 软件设计:上游 AGGGAAGGGAGAACAG，下游:CGTTGTCCAGAAGGCAGTAGG。
[0016]1.2患者选择:
[0017]本研究为前瞻性、观察性队列研究，选入2013年7月至2012年3月连续入住重庆医科大学附属第一医院重症医学科的351例患者。按照纳入标准，排除入住ICU不足24小时患者24例、少数民族患者5例、病例资料不全患者2例，多次入住I⑶2例、神经内分泌肿瘤肿瘤及肿瘤晚期患者17例、心肺复苏后等其他原因不能入选本研究的患者7例，最终共有294例患者入选。本研究得到相关伦理机构委员会批准，并获得患者本人或其家属的书面知情同意。
[0018]排除标准:排除以下患者:入住I⑶不足24h，病例资料不全，未获得知情同意书签字，多次入住I⑶患者，神经内分泌肿瘤及肿瘤晚期患者，心肺骤停后复苏，少数民族和外籍患者以及DNA提取及PCR扩增实验失败的患者。
[0019]1.3DNA提取及CHGA-415/462位点基因型分型:
[0020]患者入住I⑶后24h内，收集患者外周静脉血5ml按照全血总DNA提取试剂盒说明书进行全血基因组提取。基因型的测定通过PCR目的片段扩增和基因测序判定。按照天根DNA萃取柱提取技术操作使用外周血Iml经蛋白酶K处理后提取DNA，DNA浓度为25~30ng/ml。使用约70ngDNA作为模板用于目的片段扩增，PCR扩增体系:DNA1.5 μ 1，上下游引物各1.0 μ 1，DNATaq酶预混Mixl2.5 μ 1，ddH208 μ 1，目的片段长度为353bp。扩增参数:940C 30s-59°C 60s_72°C 45s, 35个周期。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后由上海美吉生物公司进行测序，并进行-415/462SNP位点基因型鉴定。基因型测定为盲法执行。
[0021]1.4变量记录:
[0022]记录所有患者一般情况(年龄、性别)、感染情况、有无感染(结合病原学，影像学和临床证据)、白细胞计数、降钙素原、呼吸功能相关情况(ARDS、机械通气、氧合指数)、循环情况(收缩压，休克)、肝肾指标(肌酐、胆红素)。对所有患者进行入住ICU第Id的危重症评分(APACHEII评分、SAPSII评分、SOFA评分)，以30d死亡率作为评估终点。
[0023]1.5 统计:
[0024]使用以上方法，该研究共纳入294例符合标准的患者。计数参数采用频率和百分数表达，组间比较进行卡方检验。符合正态分布且方差齐的计量参数采用中位数土标准差表达，组间比较进行t检验，不符合正态分布的计量参数采用中位数和四分位距记录，组间比较进行Wilcoxon - Mann - Whitney检验。记录生存组和死亡组各基因型的频率,并统计最小等位基因频率(MAF)。将患者分为两组:非-415C等位基因组(野生组-415TT基因型)和-415C等位基因组(突变组，包括-415TC基因型和CC基因型)，比较组间各变量的差异。采用KaplanMeier生存分析描绘两组患者30d生存曲线。采用二元logistic回归分析法分析影响患者预后的独立影响因素。以上统计结果均以P < 0.05作为具有统计学意义。
[0025]2.结果分析: [0026]2.1CHGA-415/462SNP位点基因型及等位基因分布情况
[0027]该研究共纳入294例I⑶患者。其中-415位点多态性分布情况为:TT基因型总共131例(所占比例44.6% ), TC基因型总共141例(所占比例48.0% ), CC基因型22例(所占比例7.4% )。结果显示本研究中-415T/C位点MAF(C-0.315)，与NCBI数据库中亚洲地区健康人群MAF (C-0.384)相比无显著性差异(P = 0.197)。而生存组与死亡组-415位点MAF分别为0.292和0.378，具有显著性差异(P = 0.046)。同时对-462G/A位点进行分析，结果显示本研究中-462G/A位点MAF(Α-0.104)，与NCBI数据库中亚洲健康人群MAF (Α-0.071)相比同样无显著性差异(P = 0.339)，生存组与死亡组-462G/A位点MAF分别为0.107和0.096，无显著性差异(P = 0.717)。采用卡方检验分别对CHGA-415/462位点进行Hardy - Weinberg平衡检验，研究结果提示基因型分布与预期基因型分布无显著偏倚，如表1生存组与死亡组CHGA-415/462SNP位点基因型及等位基因分布情况。
[0028]表1
[0029]
【权利要求】
1.CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后具有相关性。
2.按照权利要求1所述CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后具有相关性，其特征在于:-415位点突变组患者比野生组患者生存情况更差，具有更高的30d死亡率。
3.CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性研究方法，其特征在于:首先准备全血总DNA提取试剂盒、DNATaq酶、DNAlOOOMaker以及引物，选择入住I⑶的患者，对患者进行DNA提取并进行CHGA-415/462位点基因型分型；记录所有患者一般情况，对所有患者进行入住ICU第Id的危重症评分，以30d死亡率作为评估终点。
4.按照权利要求3所述CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性研究方法，其特征在于:所述全血总DNA提取试剂盒为北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组提取试剂盒，货号DP319，所述DNATaq酶、DNA 1000Maker以及引物均购自大连宝生物工程有限公司，引物序列由Pr imer5软件设计:上游AGGGAAGGGAGAACAG，下游:CGTTGTCCAGAAGGCAGTAGG。
5.按照权利要求3所述CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性研究方法，其特征在于:所述入住ICU的患者的选择，排除以下情况的患者:入住ICU不足24h ;病例资料不全；未获得知情同意书签字；多次入住I⑶患者；神经内分泌肿瘤及肿瘤晚期患者；心肺骤停后复苏；少数民族和外籍患者；DNA提取及PCR扩增实验失败的患者。
6.按照权利要求3所述CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性研究方法，其特征在于:所述对患者进行DNA提取并进行CHGA-415/462位点基因型分型过程为患者入住I⑶后24h内，收集患者外周静脉血5ml按照全血总DNA提取试剂盒说明书进行全血基因组提取，基因型的测定通过PCR目的片段扩增和基因测序判定，按照天根DNA萃取柱提取技术操作使用外周血Iml经蛋白酶K处理后提取DNA，DNA浓度为25~30ng/ml，使用70ngDNA作为模板用于目的片段扩增，PCR扩增体系:DNA1.5μ 1，上下游引物各1.0 μ 1，DNATaq酶预混Mixl2.5μ I, ddH208 μ 1，目的片段长度为353bp，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序，并进行-415/462SNP位点基因型鉴定，基因型测定为盲法执行。
7.按照权利要求3所述CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性研究方法,其特征在于:所述记录所有患者一般情况包括年龄、性别、感染情况、有无感染、白细胞计数、降钙素原、呼吸功能相关情况、循环情况、肝肾指标；对所有患者进行入住ICU第Id的危重症评分:APACHEII评分、SAPSII评分、SOFA评分。
【文档编号】C12Q1/68GK103966329SQ201410196808
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】张丹, 陈晓迎 申请人:重庆医科大学