胰岛分离方法及装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种胰岛分离方法及装置，所述方法包括如下步骤：胰腺的前处理；加消化液；注水；消化；检样；收集消化液；二次消化；离心；沉淀重悬。本发明涉及的胰岛分离方法，利用具有双层空心壁、且底部具有两层滤网的消化罐，通过其具有的双层空心壁中注入的恒定温度的水，保持消化灌内的温度恒定，使得胰腺的消化比较完全，且胰岛的得率较高，且成本低，操作简便。
【专利说明】胰岛分离方法及装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种胰岛分离方法及装置。
【背景技术】
[0002]胰岛pancreatic islets (Iangerhans)是胰的内分泌部分,是许多大小不等和形状不定的细胞团，散布在胰的各处，可控制碳水化合物的代谢；如胰岛素分泌不足则患糖尿病。胰岛素是促进合成代谢、调节血糖稳定的主要激素。
[0003]而现有分离技术主要应用机械分离法，持续应用机械力量和消化液流动的冲击力来冲击胰腺达到消化的目的。这种分离方法快速彻底，但是分离后的胰岛容易破碎，不适合哺乳动物的胰岛分离，比如成年猪和人的胰岛分离。
【发明内容】
[0004]基于此，有必要提供一种分离纯度高，分离效果好且操作简便的胰岛分离方法。
[0005]一种胰岛分离方法，包括如下步骤:
[0006](I)胰腺的前处理:选取具有双层空心壁的消化罐，且所述消化灌的底部具有两层滤网；往修整后的胰腺的胰管内灌注消化液后放入所述消化灌中，所述消化液为胶原酶消化液；
[0007](2)加消化液:向步骤(1)的消化灌中加入胶原酶消化液，并密封所述消化灌，所述胶原酶消化液的加入量为覆盖所述胰腺；
[0008](3)注水:注水至所述消化罐的双层空心壁中，所述水温为35~40°C，并保持温度的恒定；
[0009](4)消化:消化3-10分钟后，开始晃动消化罐，继续消化10-30分钟；
[0010](5)检样:取消化罐内的消化液，加入染色液，光学显微镜下观察胰岛，当游离胰岛≥60%时，停止消化，若未达到60%，则继续消化；
[0011](6)收集消化液:收集消化罐内的消化液，将收集的消化液放入HBSS和10%猪血清的混合物中保存于1-10°C ；
[0012](7) 二次消化:重新加入胶原酶消化液至消化罐里，继续消化未消化完的胰腺，消化后收集消化液，并合并收集的消化液；
[0013](8)离心:将合并收集的消化液离心，收集沉淀，所得沉淀用HBSS液洗涤；
[0014](9)沉淀重悬:用HBSS和9-11 (V/V) %猪血清的混合物中重悬沉淀，梯度离心纯化胰岛，得到分离后的胰岛。
[0015]在其中一个实施例中，步骤(3)所述的水温为37 °C。
[0016]在其中一个实施例中，步骤(4)所述的消化过程还包括将所述消化灌倒置。
[0017]在其中一个实施例中，步骤(6)所述的染色液为DTZ染色液。
[0018]在其中一个实施例中，步骤(4)所述的消化灌的晃动频率为每分钟3-5次。
[0019] 本发明还提供了一种胰岛分离装置，所述装置技术方案如下所述。[0020]一种胰岛分离装置，包括前置箱、消化系统、收液箱及两个蠕动泵；
[0021]所述消化系统具有消化罐，所述消化罐的内部具有第一滤网层及第二滤网层，所述消化罐具有双层空心壁，所述双层空心壁的外壁具有进水口和出水口，所述消化罐的底部具有入口及出口；
[0022]所述前置箱、蠕动泵及消化罐的入口依次连通，所述消化罐的出口、蠕动泵及收液箱依次连通；
[0023]所述第一滤网层的网孔尺寸为600-1000 μ m，所述第二滤网层的网孔尺寸为200-600 μ mD
[0024]在其中一个实施例中，所述消化罐的底部具有出口，所述出口连接有T-型连接管的一个管口，所述T- 型连接管的另两个管口分别连接有所述蠕动泵，且所述管口与所述蠕动泵之间设有阀门。
[0025]在其中一个实施例中，所述消化罐的罐底部呈漏斗状。
[0026]在其中一个实施例中，所述漏斗状的罐底部中间设有所述出口。
[0027]在其中一个实施例中，所述消化罐的顶部匹配有顶盖。
[0028]在其中一个实施例中，所述顶盖的边缘具有突出边，所述突出边将所述双层空心
壁覆盖。
[0029]在其中一个实施例中，所述双层空心壁的外壁具有两个进水口和两个出水口。
[0030]在其中一个实施例中，所述两个进水口设于所述消化罐的一侧上端和下端，所述两个出水口设于所述消化罐的相对一侧的上端和下端，使得所述两个进水口与两个出水口处于消化罐主轴的两端。
[0031]在其中一个实施例中，所述第一滤网层的网孔尺寸为750-850 μ m，所述第二滤网层的网孔尺寸为350-450 μ m。
[0032]在其中一个实施例中，所述双层空心壁之间的厚度为4_8cm。
[0033]本发明涉及的胰岛分离方法，具有以下有益效果:
[0034](I)本发明涉及的胰岛分离方法，利用具有双层空心壁、且底部具有两层滤网的消化罐，通过其具有的双层空心壁中注入的恒定温度的水，保持消化灌内的温度恒定，使得胰腺的消化比较完全，且胰岛的得率较高。
[0035](2)本发明涉及的胰岛分离方法，利用具有双层空心壁、且底部具有两层滤网的消化罐，设备简单，不需要额外复杂昂贵的设备，极大程度上节约了成本，且本发明设备生产简单,生产成本低。
[0036](3)本发明涉及的胰岛分离方法，操作简便，不需要复杂的操作方法，在常规的环境下即可进行，且消化过程人人工干预少，便于节省人力，节省时间。
[0037]本发明所使用的胰岛分离装置，通过前置箱、消化系统、收液箱及两个蠕动泵的相互配合使用，且通过具有第一滤网层及第二滤网层的消化罐，达到胰腺消化的目的；本发明分离的胰岛纯度高，分离效果好，成本低，可以连续操作消化分离，直到消化完全，且操作简便。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为本发明胰岛分离装置的主视图；[0039]图2为本发明胰岛分离装置的消化系统主视图；
[0040]图3本发明胰岛分离装置的消化系统侧视图。
[0041]附图标记说明
[0042]10、前置箱；20、消化系统；30、消化罐；32、进水口 ；34、出水口 ；36、出口 ；38、双层空心壁；40、T-型连接管；50、蠕动泵；60、收液箱；70、硅胶管；72、夹子；80、第一滤网层；82、第二滤网层。
【具体实施方式】
[0043]以下将结合实施例及附图对本发明做进一步的说明。
[0044]本发明所述胰岛分离方法使用的胰岛分离装置入下所述。
[0045]本实施例提供了一种胰岛分离装置，且本发明通过以下胰岛分离装置实现。
[0046]—种胰岛分离装置，参见图1-图3，包括前置箱10、消化系统20、收液箱60、T_型连接管40及两个蠕动泵50 ;所述T-型连接管40具有三个管口，分别为第一管口、第二管口及第三管口，呈T型，其规格为Nalgene Baxter Cat#T5342_3，T-型连接管40的尺寸规格如下:外径2.5cm,内径2cm，三个臂长均为3cm ;所述消化系统20具有消化罐30，所述消化罐30呈圆筒状，其规格 如下:消化罐30内径12cm，外径18cm，高度6cm ;所述消化罐30的内部具有第一滤网层80及第二滤网层82，所述第一滤网层80的网孔大小尺寸为800 μ m,所述第二滤网层82的网孔大小尺寸为400 μ m。
[0047]所述消化罐30具有双层空心壁38，所述双层空心壁38之间的间隔厚度为4_8cm，所述双层空心壁38的内壁厚度为2mm，外壁厚度为3mm，所述双层空心壁38的外壁具有两个进水口 32和两个出水口 34，两个进水口 32和两个出水口 34均连接有管道，所述两个进水口 32和两个出水口 34处的管道的规格相同，如下所示:内径均为2cm，外径均有2.5cm,长度4cm ;所述两个进水口 32设于所述消化罐30的一侧上端和下端，所述两个出水口 34设于所述消化罐30的相对一侧的上端和下端，使得所述两个进水口 32与两个出水口 34处于消化罐30直径的两端点处，所述两个进水口 32均连接于水泵；
[0048]所述消化罐30的罐底部呈漏斗状，所述漏斗状的罐底部中间设有所述出口 36，所述出口 36通过硅胶管70连接于所述T-型连接管40的第三管口，所述T-型连接管40的第一管口、第二管口分别通过硅胶管70连接有所述蠕动泵50，所述硅胶管70的外径为
2.5cm,内径为2cm，长度为60-80cm ;且所述管口与所述蠕动泵50之间设有夹子72，或者可设有阀门取代夹子72 ;所述前置箱10、蠕动泵50及T-型连接管40的第一管口依次连通，所述T-型连接管40的第二管口、蠕动泵50及收液箱60依次连通；所述消化罐30的顶部匹配有顶盖，所述顶盖的外径为12cm，厚度为2cm，所述顶盖的边缘具有突出边，所述突出边的宽度为5cm，所述突出边将所述双层空心壁38覆盖。
[0049]所述胰岛分离装置的T-型连接管40可以换成Y-型连接管，其规格为3/16inNalgene Baxter Cat#T5343_2。
[0050]所述胰岛分离装置，通过前置箱、消化系统、收液箱及两个蠕动泵的相互配合使用，且通过具有第一滤网层及第二滤网层的消化罐，达到胰腺消化的目的；本发明分离的胰岛纯度高，分离效果好，成本低，可以连续操作消化分离，直到消化完全，且操作简便。
[0051]以下将具体说明胰岛分离方法。[0052]一、胰腺消化试剂
[0053]A.化学试剂
[0054]I) Hanks Balanced Salt Solution (HBSS 即 Hank 平衡盐溶液缓冲液)Sigma 公司
[0055]2)胶原酶V Sigma公司
[0056]3) Dithizone (DTZ)染色剂(胰岛染色)(铅试剂，中文别名:二苯硫代偶氮羰酰肼或者双硫腙)Sigma公司
[0057]4) HEPES Sigma 公司
[0058]5)CMRL1066细胞培养液Sigma公司[0059]6) UniversityofWisconsinSolution (UW 液)施贵宝公司
[0060]7) DNaseIM 酶 Sigma 公司
[0061]8)Ficoll 离心液 Sigma 公司
[0062]B.液体配置
[0063]I)消化液配置
[0064]a.1OOOmlHBSS 放入烧瓶里；
[0065]b.水浴箱里将HBSS调整温度至28-32 °C ；
[0066]c.加入 100_200mgDNaseI 酶；
[0067]d.加入1500mg的胶原酶V,充分搅拌；
[0068]e.用0.2 μ m的滤网过滤消化液,即得胶原酶消化液，备用。
[0069]2)离心液配置
[0070]a.称取 Ficol I;
[0071]b.用 HBSS 溶解 Ficoll ；
[0072]c.配置1.1，1.09，1.06的Ficoll梯度离心液备用，其中1.06、1.09及1.10的梯度离心液是用蔗糖和HANKS液配制的密度分别为1.06mg/ml、l.09mg/ml及1.10mg/ml的液体。
[0073]二、胰腺准备
[0074]A.器械及设备
[0075]1.组织剪
[0076]2.血管钳
[0077]3.18G静脉导管
[0078]4.丝线
[0079]5.冷却托盘
[0080]6.冰盒
[0081]7.离心管
[0082]8.光学显微镜
[0083]9.加样吸管
[0084]10.冰盒
[0085]B.胰腺插管和灌注
[0086]I)用组织剪、血管钳去除胰腺周围脂肪
[0087]a.胰腺用HBSS冲净后放入冷却托盘；[0088] b.用组织剪、血管钳将胰腺周围脂肪组织剪去。
[0089]2)胰管插管
[0090]a.找出胰管
[0091]b.插入18G的导管
[0092]c.3.0丝线固定导管
[0093]3)称量膜腺重量
[0094]灌注胰腺
[0095]a.每克胰腺灌注消化液1.5-2ml
[0096]b.如有漏渗，夹闭。
[0097]三、胰腺消化
[0098]A.消化
[0099]1.胰腺的前处理:选取具有双层空心壁38消化罐30，且所述消化灌的底部具有两层滤网，修整胰腺，往胰腺的胰管内灌注消化液后放入所述消化灌中，旋紧顶盖，所述消化液为胶原酶消化液，以下步骤所用消化液均为胶原酶消化液；
[0100]2.加消化液:通过连接于T-型连接管40的第一管口的蠕动泵50，将前置箱10内的消化液泵入至步骤(1)的消化灌中，并密封所述消化灌，所述消化液的加入量为覆盖所述胰腺；
[0101]3.注水:从消化灌的进水口 32注入热水,使得整个消化罐30的夹层里充满热水，温度通过进热水的温度和速度将消化罐30内的温度调整至37°C，并控制在37±0.50C ；
[0102]4.消化5分钟后开始晃动消化罐30，每分钟3-5次/分，消化过程中，可以将消化罐30倒转过来，即将漏斗状的罐底部朝上，消化罐30顶部在下；
[0103]5.记录消化时间，连续消化10-30分钟；
[0104]6.收集或观察胰岛时，将消化罐30置于正常状态即漏斗状的底部朝下，消化液体经过第一滤网层(网孔大小为800μπι)和第二滤网层(网孔大小为400μπι)流出，可以收集或观察胰岛；
[0105]B.检样
[0106]1.观察胰岛
[0107]Α.取消化罐30内的消化液少许；
[0108]b.加入DTZ染色液(约50 μ L)；
[0109]c.光学显微镜下观察胰岛，当游离胰岛≥60%时，停止消化，若未达到60%，则继续消化。
[0110]2.胰岛定量
[0111]a.收集2ml消化液;
[0112]b.提取50 μ I消化液并加入DTZ染色液；
[0113]c.光学显微镜下观察胰岛并计数；
[0114]d.计算光学显微镜下所观察的胰岛直径并折算成IEQ。
[0115]IEQ:1sletequivalents,胰岛当量,根据胰岛的直径大小计算胰岛当量
[0116]IEQ计算方法:
[0117]
【权利要求】
1.一种胰岛分离方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)胰腺的前处理:选取具有双层空心壁的消化罐，且所述消化灌的底部具有两层滤网；往修整后的胰腺的胰管内灌注消化液后放入所述消化灌中，所述消化液为胶原酶消化液； (2)加消化液:向步骤(1)的消化灌中加入胶原酶消化液，并密封所述消化灌，所述胶原酶消化液的加入量为覆盖所述胰腺； (3)注水:注水至所述消化罐的双层空心壁中，所述水温为35~40°C，并保持温度的恒定; (4)消化:消化3-10分钟后，开始晃动消化罐，继续消化10-30分钟； (5)检样:取消化罐内的消化液，加入染色液，光学显微镜下观察胰岛，当游离胰岛≥60%时，停止 消化，若未达到60%，则继续消化； (6)收集消化液:收集消化罐内的消化液，将收集的消化液放入HBSS和9-11(V/V) %猪血清的混合物中保存于1-1o°c ； (7)二次消化:重新加入胶原酶消化液至消化罐里，继续消化未消化完的胰腺，消化后收集消化液，并合并收集的消化液； (8)离心:将合并收集的消化液离心，收集沉淀，所得沉淀用HBSS液洗涤； (9)沉淀重悬:用HBSS和10%猪血清的混合物中重悬沉淀，梯度离心纯化胰岛，得到分离后的胰岛。
2.根据权利要求1所述的胰岛分离方法，其特征在于，步骤(3)所述的水温为37±0.5。。。
3.根据权利要求1或2所述的胰岛分离方法，其特征在于，步骤(4)所述的消化过程还包括将所述消化灌倒置。
4.根据权利要求1或2所述的胰岛分离方法，其特征在于，步骤(6)所述的染色液为DTZ染色液。
5.根据权利要求1或2所述的胰岛分离方法，其特征在于，步骤(4)所述的消化灌的晃动频率为每分钟3-5次。
6.一种胰岛分离装置，其特征在于，包括前置箱、消化系统、收液箱及两个蠕动泵； 所述消化系统具有消化罐，所述消化罐的内部具有第一滤网层及第二滤网层，所述消化罐具有双层空心壁，所述双层空心壁的外壁具有进水口和出水口，所述消化罐的底部具有入口及出口； 所述前置箱、蠕动泵及消化罐的入口依次连通，所述消化罐的出口、蠕动泵及收液箱依次连通； 所述第一滤网层的网孔尺寸为600-1000μπι，所述第二滤网层的网孔尺寸为200-600 μm。
7.根据权利要求6所述的胰岛分离装置，其特征在于，所述消化罐的底部具有出口，所述出口连接有T-型连接管的一个管口，所述T-型连接管的另两个管口分别连接有所述蠕动泵，且所述管口与所述蠕动泵之间设有阀门。
8.根据权利要求6或7所述的胰岛分离装置，其特征在于，所述消化罐的顶部匹配有顶盖，所述顶盖的边缘具有突出边，所述突出边将所述双层空心壁覆盖。
9.根据权利要求6或7所述的胰岛分离装置，其特征在于，所述第一滤网层的网孔尺寸为750-850 μ m，所述第二滤网层的网孔尺寸为350-450 μ m。
10.根据权利要求6或7所述的胰岛分离装置，其特征在于，所述双层空心壁之间的厚度为4_8cm。
【文档编号】C12M1/00GK103952371SQ201410196765
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】蒋小峰, 钱滔来, 俞晓立, 杨学伟, 薛平, 陈德 申请人:蒋小峰, 钱滔来