肿瘤联合治疗相关基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种可用于肿瘤细胞联合治疗具有决定作用 的基因及其应用，特别是涉及将该基因作为靶基因并下调该基因在病人体内的表达以增强 化疗的疗效。
【背景技术】
[0002] 作为恶性肿瘤之一的原发性肝癌，因其异质性极高，使得其成为当前人类无法攻 克的一种恶性疾病。目前，肝癌的主要治疗手段包括手术切除、化学药物治疗和放射治疗 等，其中化学药物疗法已广泛用于晚期肝癌患者。但是肿瘤化疗药物的毒副作用及患者产 生的耐药现象，很大程度上限制了肿瘤化疗药物的使用。其次，由于在治疗前无法判断不同 肿瘤患者对肿瘤化疗药物的反应性，临床医生主要还是依据其临床经验选择不同的药物， 因此具有一定的盲目性。再者，不恰当的使用肿瘤化疗药物不仅使患者正常细胞和免疫系 统遭到破坏，还有可能诱导肿瘤细胞产生对多种药物的联合耐药性，即多药耐药性，进而导 致化学治疗的失败。肿瘤化疗失败的主要原因是肿瘤细胞的耐药性，对目前主要采用药物 治疗的肿瘤而言，找到肿瘤细胞耐药性的原因和决定肿瘤化疗疗效的基因是一项具有重大 意义的课题。
[0003] 在过去十几年中，抗肿瘤药物研发取得了长足的进展，许多抗肿瘤新药进入临床 应用。由拜耳公司研发的索拉菲尼（Sorafenib)是第一个，也是唯一一个获得美国FDA批 准上市，用于治疗肝细胞癌的多靶点药物。它能够抑制多个酪氨酸蛋白激酶，如VEGFR、 TOGFR，还能抑制ERK1/2信号通路中抑制丝/苏氨酸蛋白激酶RAF，从而抑制了肿瘤细胞生 长和肿瘤血管形成，进而阻止了肿瘤的生长。但肝癌患者中使用索拉菲尼易产生耐药性，治 疗效果也不理想（参见文献：Shibo Lin, Katrin Hoffmann, Peter Schemmer, Treatment of HepatocelIularCarcinoma:A Systematic Review, Liver Cancer 2012;1:144 - 158·)。
[0004] Shp2蛋白是由基因 PTPNll所编码（GeneID: 5781)，是具有去磷酸化作用的一种胞 楽·型蛋白酪氨酸磷酸酶（英文全称：protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11)，结构上含有2个相同的SH2结构域，Shp2通过SH2结构域结合磷酸化的酪氨酸残基，使 其自身结构中的酪氨酸蛋白磷酸酶（PTP酶）激活，可将细胞内其他信号分子去磷酸化（参 见文献：A. Alonso, J. Sasin, N. Bottini, I. Friedberg, A. Osterman, A. Godzik, T. Hunter, J. Dixon and T. Mustelin, Protein tyrosine phosphatases in the human genome, Cellll 7 (2004)，pp. 699 - 711.)。研宄表明，Shp2分子可参与多种细胞信号通路，调控细胞增殖、凋 亡等生物学行为，但ShP2在肝癌药物治疗中的作用报道很少。本申请人已获得中国发明专 利CN201310005628. 6,发明名称为"Shp2蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用"，授权 公布号为 CN103063850B。
[0005] 在索拉菲尼治疗肝癌病人的过程中，Shp2的作用尚不清楚。
[0006] 另外，也未见肝癌中Shp2表达与其对索拉菲尼疗效影响的相关报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是：提供一种可用于肿瘤联合治疗的基因。
[0008] 本发明的另一个目的是：提供上述基因在预测肿瘤化疗效果、提高肿瘤化疗疗效、 制备肿瘤治疗药物中的应用。
[0009] 本发明的再一个目的是：提供一种提高肿瘤化疗效果的方法。
[0010] 本发明的再一个目的是：提供一种预测肿瘤化疗反应性的方法。
[0011] 本发明的第一方面，提供了一种可用于肿瘤联合治疗的基因，所述的基因为Shp2 基因（GeneID: 5781)，所述的肿瘤联合治疗药物为索拉菲尼。
[0012] Shp2基因也是肿瘤化疗药物敏感基因。
[0013] 本发明的第二方面，提供了 Shp2基因在制备检测肿瘤化疗药物反应性试剂或试 剂盒中的应用。
[0014] 所述的肿瘤化疗药物为索拉菲尼。
[0015] 所述的检测肿瘤化疗药物反应性，即预测或评估肿瘤化疗效果、病人对肿瘤化疗 药物是否有反应。
[0016] 进一步地，本发明还提供了 Shp2基因在肿瘤联合治疗、制备抗肿瘤药物中的应 用。
[0017] Shp2基因在肿瘤联合治疗，所述的联合治疗药物为索拉菲尼。
[0018] Shp2基因在制备抗肿瘤药物中的应用，优选的，所述的肿瘤优选为肝癌。
[0019] 在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的药物为抑制或降低Shp2基因转录（翻译）的 物质与索拉菲尼联用。
[0020] 所述的抑制或降低Shp2基因转录（翻译）的物质为Shp2小干扰RNA，
[0021] 正义链5'UUAAUUGCCCGUGAUGUUCUU3'（SEQIDN0:1)
[0022] 反义链5'GAACAUCACGGGCAAUUAAUU3'（SEQIDN0:2)
[0023] 本发明还提供了 Shp2基因在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的应用，所述的肿瘤化 疗药物为索拉菲尼。
[0024] 本发明的第三方面，提供一种提高肿瘤化疗效果的方法，具体是通过降低Shp2基 因的表达来提高肿瘤化疗药物疗效的方法。所述的肿瘤化疗药物为索拉菲尼。
[0025] 本发明的第四方面，提供一种预测肿瘤化疗药物反应性的方法，具体是应用Shp2 基因来预测肝癌细胞对索拉菲尼反应性的方法。所述的肿瘤化疗药物为索拉菲尼。
[0026] 本发明经实验发现，当肝癌细胞内有Shp2表达可以影响肝癌细胞对索拉菲尼的 反应性。
[0027] 本发明将有助于开发针对Shp2表达的诊断试剂盒，以预测病人对化疗的治疗效 果；也有助于抗癌药物的筛选来寻找降低Shp2表达的化学和生物分子，最终达到减轻化疗 药物的毒副作用，节约医疗费用，增加治愈率的作用。本发明为肿瘤的治疗提高的新的临床 手段。
【附图说明】
[0028] 图1是Shp2在肝癌患者中的表达情况不意图，其中T :癌组织，N :癌芳组织；
[0029] 图2是建立的干扰Shp2的稳转细胞系及对照细胞系，其中细胞为肝癌细胞 SMMC-7721 ；
[0030] 图3是干扰Shp2的稳转细胞系及对照细胞系分别给予索拉菲尼后，肝癌细胞生长 情况的不意图；
[0031] 图4是干扰Shp2的稳转细胞系及对照细胞系分别给予索拉菲尼后，肝癌细胞克隆 形成能力的示意图，其中A为细胞所形成克隆的照片，B为比较克隆数量的示意图，C比较克 隆体积的示意图；
[0032] 图5是干扰Shp2的稳转细胞系及对照细胞系分别给予索拉菲尼后，肝癌细胞凋亡 比例的示意图，其中A为流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡的结果示意图，B比较两种肝癌细胞 凋亡比例的示意图；
[0033] 图6是干扰Shp2的稳转细胞系及对照细胞系在裸鼠皮下荷瘤后分别给予索拉菲 尼治疗后，裸鼠移植瘤体积的示意图，其中A为裸鼠移植瘤的照片，B为裸鼠移植瘤生长曲 线。
【具体实施方式】
[0034] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0035] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。除非另外说明，否则百 分比和份数按重量计算。
[0036] 索拉菲尼：购自拜耳公司，规格为0.2g/片。
[0037] 实验动物：裸鼠（8周龄），雄性，均购于第二军医大学实验动物中心。
[0038] 实施例1 :
[0039] 从人肝癌的癌组织及癌旁组织中提取RNA，肝癌患者的癌组织及癌旁组织来自东 方肝胆外科医院肝癌组织样本库。提取RNA的方法（参见invitrogen公司Trizol Plus 试剂盒），从肝癌病人的癌组织及癌旁组织中提取总RNA并逆转录获取cDNA。
[0040] 即按照Trizol操作程序抽提总RNA，并将RNA逆转录获得cDNA。反应体系25 μ 1， 各管分别含逆转录缓冲液（5 X) 5. 0 μ 1，dNTPs (IOmM) 1 μ 1，RNasin 0· 5 μ 1，M-MLV-RTase I. 0 μ 1，RNA 2 μ g(体积由 RNA 浓度决定），Ν61 μ 1，DEPC H2O 补至 25 μ 1，然后 70°C 5min， 4°C 4min，37°C 60min，70°C 10min，10°C 20min 进行逆转录。
[0041] Applied Biosystems 7300/7900 Fast Real-Time PCR System焚光定量PCR仪定 量检测。Shp2基因引物序列：
[0042] 上游引物 5'CTGCCTCCACACCAGTGATA3'（SEQ ID NO :3)，
[004