一种基于dna自组装和g四聚体的分子检测方法及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于核酶的分子检测方法，特别涉及基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及基于该方法的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]环境中存在多种对人体有害的分子，快速、低成本地检测出这些有害小分子具有非常实际的意义。
[0003]双酚A (Bisphenol A，BPA)，化学名为2，2_ 二(4_羟基苯基)丙烷，主要用于合成环氧树脂，聚碳酸酯等多种高分子材料，被广泛用于生产各种塑料制品。双酚A主要通过食品包装材料、饮水杯、供水管、奶瓶以及塑料薄膜等渗入食品而进入体内，并能在生物体内富集，并且不易被降解。即使极低的浓度的双酚A也会对内分泌系统、免疫系统、生殖系统产生一系列的不良影响。传统的双酚A检测技术主要有高效液相色谱法等一些仪器分析方法，这些技术需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，难以用于大批量样本的实地现场快速检测。
[0004]另外，也有以抗体来检测双酚A的技术，但是抗体的制备过程麻烦，保存条件苛亥IJ，而且需要多次洗涤与分离过程，因而限制了它们的广泛应用。
[0005]G四聚体序列是由富含G碱基的一段单链DNA组成，在缓冲体系和hemin (氯高铁血红素)存在的情况下，可折叠成G四聚体二级结构。G四聚体具有类似HRP (辣根过氧化物酶)的催化活性，可催化氧化TMB (四甲基联苯胺)产生蓝色底物，使反应溶液肉眼可见。以G四聚体来检测双酚A具有操作简单，方便现场快速分析等优点。但是基于G四聚体的比色法检测灵敏度低，需要进一步提高灵敏度。传统的信号放大技术主要是PCR以及一系列依赖工具酶的信号扩增技术，但是酶的使用不仅增加了成本和操作步骤，而且酶的存储也比较麻烦，因此需要研发一种无需工具酶信号扩增技术来提高检测灵敏度。
[0006]核酸适体(aptamer，源于拉丁语)指的是经体外筛选技术SELEX (指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。
[0008]本发明所采取的技术方案是:
一种基于DNA自组装和G四聚体的检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括如下核酸序列:
DNAl:将待测分子核酸适体的一端适当延伸，形成DNA1，延伸的核酸序列中，靠近待测分子核酸适体的核酸序列依次记为1*、2*和3*区；
DNA2:DNA2至少与DNAl的I*区域和待测分子核酸适体的部分核酸互补配对；
DNA3:具有茎环结构，其核酸序列依次为1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*区，2、3和2*、3*互补配对形成茎结构，环为4*区，1、2、3分别和DNAl的1*、2*和3*区互补配对；
DNA4:具有莖环结构，其核酸序列依次为3、4、3*、2*和4*区，4和4*区形成莖结构，环为3*和2*区，3、4、3*、2*区分别和DNA3的3*、4*、3、2区互补配对；
DNA5:依次为5*、6*和G四聚体封闭区，5*、6*区与DNA3的5*和6*区相同；
DNA6:依次为G四聚体、6、5、和2区，6、5、和2区分别和DNA3的6*、5*和2*互补配对。
[0009]作为上述检测试剂盒的进一步改进，DNA2至少与待测分子核酸适体的8个碱基互补配对。
[0010]作为上述检测试剂盒的进一步改进，I?6、I*?6*区中，每个区至少含有6个碱基。
[0011]作为上述检测试剂盒的进一步改进，DNA5的G四聚体封闭区至少与DNA6的G四聚体中的6个碱基互补配对。
[0012]作为上述检测试剂盒的进一步改进，对I?6、I*?6*区核酸序列中的至少一个核苷酸进行修饰，以在不改变碱基配对原则的情况下提高核酸序列之间的亲和力。
[0013]一种双酚A的检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括如下核酸序列:
DNAl:5' -CGACATCT (3*)AACCTAGC (2*)TCACTGAC (I*) CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3’ (SEQ ID NO:1);
DNA2:5’-TAAGCTGGAAGCGTCAGTGA-3’ (SEQ ID NO:2);
DNA3:5’-GTCAGTGA (l)GCTAGGTT (2)AGATGTCG (3)CCATGTGTAGA (4*)CGACATCT (3*)AACCTAGC (2*)CCTTGTCA (5*)TAGAGCAC (6*)-3’ (SEQ ID NO:3);
DNA4:5’-AGATGTCG (3)TCTACACATGG (4)CGACATCT (3*)AACCTAGC (2*)CCATGTGTAGA(4*) -3’ (SEQ ID NO:4)；
DNA5:5’-CCTTGTCA (5*)TAGAGCAC (6*) TCCCTC (G 四聚体封闭区)-3’ (SEQ ID NO:
5)；
DNA6:5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGA (G 四聚体序列)GTGCTCTA (6)TGACAAGG (5)GCTAGGTT
(2)-3’ (SEQ ID NO:6)。
[0014]一种分子的检测方法，包括如下步骤:
1)将过量DNA5和DNA6于DNA杂交缓冲液中混合反应，形成DNA5-DNA6复合物；
2)将DNAl和过量DNA2于DNA杂交缓冲液中混合反应，形成DNA1-DNA2复合体；
3)将DNA1-DNA2复合体内加入待测样品、DNA3和DNA4，混合反应完全，得到DNA3-DNA4复合物；
4)将DNA3-DNA4复合物、DNA5-DNA6复合物、氯高铁血红素、TMB显色缓冲液混合，如反应体系产生蓝色底物，说明待测样品含有待测分子；
其中，DNAl?DNA 6的序列组成如上所示。
[0015]作为上述分子检测方法的进一步改进，DNA杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl 以及 50 mM KCl。
[0016]作为上述分子检测方法的进一步改进，TMB显色缓冲液，含有26.6 mM柠檬酸，51.4mM 磷酸氢二钠，25 mMKCl，10 mL 0.5% 的 TMB, 20 mL 30% 的 H2O2, pH=5.0。
[0017]本发明的有益效果是:
I)本发明的检测方法及检测试剂盒具有较高的灵敏度，对双酚A的检测限为I pg/mL，检测结果肉眼可见，适于现场快速分析。
[0018]2)本发明所述的分子检测方法应用核酸适体实现待测分子的捕捉，具有很好的特异性，其他常见的干扰物对检测不产生影响。
[0019]3)以G四聚体作为信号报告分子，结合DNA自组装介导的信号放大技术，可产生大量的具有催化活性的G四聚体，整个操作简单，经济便宜，不需要使用任何检测仪器，不需要专业技术人员，无须培训即可推广使用。
【附图说明】
[0020]图1是DNA1-DNA2复合体在双酚A作用下脱离的原理示意图；
图2是DNA3-DNA4复合体形成的原理示意图；
图3是显色反应阶段的原理示意图；
图4是不同浓度的双酚A检测的结果图；
图5是特异性实验结果图。
【具体实施方式】
[0021]一种基于DNA自组装和G四聚体的检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括如下核酸序列:
DNAl:将待测分子核酸适体的一端适当延伸，形成DNA1，延伸的核酸序列中，靠近待测分子核酸适体的核酸序列依次记为1*、2*和3*区；
DNA2:DNA2至少与DNAl的I*区域和待测分子核酸适体的部分核酸互补配对；
DNA3:具有茎环结构，其核酸序列依次为1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*区，2、3和2*、3*互补配对形成茎结构，环为4*区，1、2、3分别和DNAl的1*、2*和3*区互补配对；
DNA4:具有莖环结构，其核酸序列依次为3、4、3*、2*和4*区，4和4*区形成莖结构，环为3*和2*区，3、4、3*、2*区分别和DNA3的3*、4*、3、2区互补配对；
DNA5:依次为5*、6*和G四聚体封闭区，5*、6*区与DNA3的5*和6*区相同；
DNA6:依次为G四聚体、6、5、和2区，6、5、和2区分别和DNA3的6*、5*和2*互补配对。
[0022]作为上述检测试剂盒的进一步改进，DNA2至少与待测分子核酸适体的8个碱基互补配对，以确保DNA1-DNA2复合物的稳定性。同时DNA2与待测分子核酸适体的碱基互补配对数也不宜过多，一般不超过20个碱基互补配对，以免影响待测分子与DNAl中的核酸适体竞争性结合从而把DNA2置换下来。
[0023]作为上述检测试剂盒的进一步改进，I?6、I*?6*区中，每个区至少含有6个碱基，以确保对应区域结合的稳定性。优选的，为6?20个，更佳为6?15个、6?10个。
[0024]作为上述检测试剂盒的进一步改进，DNA5的G四聚体封闭区至少与DNA6的G四聚体中的6个碱基互补配对，封闭后的G四聚体没有催化活性。
[0025]作为上述检测试剂盒的进一步改进，对I?6、I*?6*区核酸序列中的至少一个核苷酸进行修饰，以在不改变碱基配对原则的情况下提高核酸序列之间的亲和力。如通过锁核酸修饰以提高碱基之间的亲和力，使用较短的序列实现本发明的技术方案。
[0026]下面结合附图，以双酚A的检测为例，进一步说明本发明的检测原理:
DNA1-DNA2复合体的形成:双酚A的核酸适体的一端适当延伸，形成DNA1，靠近核酸适体一端包含3个区域，分别是1*，2*，3*。DNA2与部分DNAl互补。将DNAl和DNA2在缓冲体系中反应一段时间，形成DNA1-DNA2复合物。在DNA1-DNA2复合物中，DNAl中的I*区域被DNA2封闭。当DNA1-DNA2反应体系中存在双酚A时，双酚A将与核酸适体相互作用，从而把DNA2置换下来，使DNAl中的I*区域暴露出来(原理如图1所示)。如无双酚A存在，DNA1-DNA2复合物稳定存在，DNAl中的I*区域无法暴露。
[0027]DNA3-DNA4复合体的形成与放大:DNA1中暴露的I*区域可作为DNA支点，将会与DNA3中的I区域互补结合，启动DNA自组装链置换反应，介导DNAl中的2*、3*区域与DNA3中的2、3区域结合，形成更长的双链DNA (1-1*、2-2*、3-3*)，从而打开颈环结构的DNA3，使DNA3中的3*区域暴露(原理图2反应a所示)。DNA4中的