3] 下游引物 5' GGAGCCTGAGCAAGGAGC 3'（SEQ ID NO :4)。
[0044] 以B-actin为内参，引物序列：
[0045] 上游引物 5' AATCGTGCGTGACATTAAGGAG3'（SEQ ID NO :5)，
[0046] 下游引物 5'ACTGTGTTGGCGTACAGGTCTT3'（SEQ ID NO :6)。
[0047] 反应体系10μ 1，含cDNA 0· 5μ 1，Shp2(或B-actin)上游、下游引物各1 μ 1， 2xTaqman SYBR 12. 5μ1，CldH2O 10μ1。反应参数：95°C预变性 10 分钟，之后 95°C变性 15 秒，60°C退火30秒，72°C延伸40秒，共40个循环，72°C终末延伸IOmin。每次在延伸阶段读 取吸光值。PCR结束后，95°C lmin，然后冷却至55°C，使DNA双链充分结合。从开始到95°C， 每一步增加0. 5°C，保持4秒，记录吸光值和制作熔解曲线（图1)。
[0048] 由图1可知，Shp2在134例肝癌组织中的大部分癌组织中与癌旁组织相比呈现高 表达。
[0049] 实施例2 :
[0050] 采用能够特异性沉默Shp2基因表达的shRNA经由慢病毒载体表达。
[0051] 制备过程包括：将编码Shp2基因小分子干扰RNA的DNA片段克隆插入慢病毒载体 获得Shp2基因干扰慢病毒载体，进而利用该干扰Shp2基因慢病毒载体经过病毒包装成为 有感染力的病毒颗粒后，感染肝癌细胞SMMC-7721 (此细胞购自中科院细胞所）并最终获得 特异性沉默Shp2基因表达的SMMC-7721细胞系（命名为SMMC-7721shShp2)及其对照细胞 系（命名为 SMMC-7721GFP)。
[0052] Shp2干扰型（shShp2)慢病毒构建。该方法包括：
[0053] A、构建Shp2干扰型（shShp2)慢病毒质粒；
[0054] B、包装Shp2干扰型（shShp2)慢病毒；
[0055] C、将Shp2干扰型（shShp2)慢病毒转染SMMC-7721细胞。
[0056] 该方法具体包括：
[0057] A、合成如下shShp2序列并克隆入Lenti慢病毒载体中，构建Shp2干扰型 (shShp2)慢病毒质粒为：Lenti_shShp2 ;
[0058] 正义链5'UUAAUUGCCCGUGAUGUUCUU3'（SEQIDN0:1)
[0059] 反义链5，GAACAUCACGGGCAAUUAAUU3，（SEQIDN0:2)
[0060] B、Shp2干扰型（shShp2)慢病毒质粒与pCMV、pMD2G慢病毒骨架质粒共转包装 Shp2干扰型（shShp2)慢病毒；
[0061] C、Shp2干扰型（shShp2)慢病毒转染SMMC-7721细胞。
[0062] 如图2所示，用GAPDH作为内参，SMMC-7721 shShp2细胞系Shp2蛋白表达量相对 于SMMC-7721GFP细胞系明显减少。
[0063] 实施例3 :
[0064] 将实施例2制备得到的肝癌细胞系SMMC-7721GFP、SMMC-7721shShp2分别传入96 孔板，每孔5000个细胞，每种细胞分为DMSO及索拉菲尼两组，每组设3个副孔。待细胞贴 壁后计为〇h，同时各组分别给予DMSO或索拉菲尼（5 μ M)。在72h吸掉培养基，加入用DMEM 稀释的10%的CCK8检测试剂，37°C孵箱孵育Ih后检测450nm处的吸光度值，并用所测的 吸光度值绘制生长曲线（图3)。
[0065] 由图3可知，干扰Shp2基因表达可以促进肝癌细胞对Sorafenib抑制克隆形成的 效应。
[0066] 实施例4 :
[0067] 为了进一步证明索拉菲尼能够抑制肝癌细胞SMMC_7721shShp2的增殖，进行细胞 克隆实验。
[0068] 实验方法如下：将实施例2制备得到的肝癌细胞系SMMC-7721GFP、 SMMC-7721 shShp2传入6孔板中，每孔500个细胞。分为DMSO、Sorafenib (2 μ M) 2组，每组 设3个副孔。待细胞贴壁后，各组换成分别含有DMSO及Sorafenib (2 μ Μ)的培养基，放入 37°C孵箱孵育1周。第7d吸除培养基，用生理盐水冲洗两遍，加入结晶紫染色5min，吸除结 晶紫，再用生理盐水冲洗2遍，拍照，并计算各孔中形成克隆个数。统计每组各副孔克隆形 成个数，并绘制计数柱状图（图4)。
[0069] 由图4可知，干扰Shp2基因表达的肝癌细胞对Sorafenib引起的生长抑制更加显 著。
[0070] 实施例5 :
[0071] 将实施例2制备得到的肝癌细胞系SMMC-7721GFP、SMMC-7721shShp2传入6孔板， 每孔传约2 X IO5个细胞。待细胞贴壁后分为2组，每组设3个副孔，各组分别换成含有以下 药物的培养基：（I)DMSO ; (2) Sorafenib (20mM);放入37°C孵箱孵育24h后吸掉培养基，用 胰酶将细胞消化下来，并用生理盐水悬浮于1.5ml EP管中后离心，吸掉上清，留细胞沉淀。 将配好的凋亡检测试剂（Annexin V)加到含有细胞沉淀的EP管中悬浮细胞，在室温避光条 件下孵育15min，然后加入终止液，上流式细胞仪检测（图5)。
[0072] 由图5可知，干扰Shp2基因表达可以促进肝癌细胞对Sorafenib诱导的细胞凋 亡。
[0073] 实施例6 :
[0074] 实施例2制备得到的肝癌细胞系SMMC-7721GFP、SMMC-7721shShp2培养到充足密 度后用胰酶消化下来，并用生理盐水重悬，细胞计数后，将2X IO6个细胞打入裸鼠皮下，裸 鼠左侧为SMMC-7721GFP细胞，右侧为SMMC-7721shShp2。同时，将裸鼠分为2组，采用灌胃 的方法，一组给予DMS0, 一组给予Sorafenib I. 5mg/kg，2d -次，共八周。每3w测量一次肿 瘤直径，计算各组肿瘤体积后，绘制肿瘤生长曲线图。
[0075] 如图6所示，干扰Shp2基因表达的肝癌移植瘤与其对照相比生长较慢，而给与 Sorafenib药物后，该移植瘤的体积进一步缩小、甚至消失。这一结果提示我们，Shp2基因 低表达的肝癌对索拉菲尼反应性更好；在肝癌中下调Shp2表达可以促进索拉菲尼的疗效。 [0076] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 一种可用于肿瘤联合治疗的基因，其特征在于，所述的基因为Shp2基因，所述的肿 瘤联合治疗药物为索拉菲尼。 2. Shp2基因在制备检测肿瘤化疗药物反应性试剂或试剂盒中的应用。
3. 根据权利要求2所述的Shp2基因在制备检测肿瘤化疗药物反应性试剂或试剂盒中 的应用，其特征在于，所述的肿瘤化疗药物为索拉菲尼。 4. Shp2基因在制备肿瘤联合治疗药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤联合治疗药 物为Shp2基因和索拉菲尼。 5. Shp2基因在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抑制或降 低Shp2基因转录的物质与索拉菲尼联用。 6. Shp2基因在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的应用，所述的肿瘤化疗药物为索拉菲尼。
7. 根据权利要求2所述的Shp2基因在制备检测肿瘤化疗药物反应性试剂或试剂盒中 的应用，所述的肿瘤为肝癌。
8. 根据权利要求6所述的Shp2基因在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的应用，其特征在 于，所述的肿瘤为肝癌。
9. 根据权利要求5所述的Shp2基因在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的 抑制或降低Shp2基因转录的物质为Shp2的小干扰RNA。
10. 根据权利要求9所述的Shp2基因在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的 Shp2的小干扰RNA的序列如下： 反义链 5'GAACAUCACGGGCAAUUAAUU3'（SEQIDNO:2)。
【专利摘要】本发明公开了一种可用于肝癌细胞联合治疗的基因，该基因为Shp2，本发明还公开了应用该基因进行肝癌联合治疗的方法，Shp2可以影响细胞对化疗药物表现出较好的反应性。本发明还公开了一种通过敲除或减少Shp2的表达来影响肿瘤化疗效果的方法，以及该基因在预测肿瘤化疗效果、提高肿瘤化疗反应性、制备肿瘤治疗药物中的应用。
【IPC分类】A61K31-44, A61K31-713, A61P35-00, C12Q1-68, A61K48-00
【公开号】CN104726571
【申请号】CN201510100774
【发明人】王红阳, 丁劲, 夏明杨, 刘娜, 韩涛, 向代民, 孙文
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月6日