一种快速检测禽源样品中沙门菌的lamp试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种快速检测禽源样品中沙门菌的 LAMP试剂盒，具体为一种快速检测禽源样品中鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌与肠炎沙门菌 的LAMP试剂盒。
【背景技术】
[0002] 沙门菌（Salmonella)是肠杆菌科中最常见的人畜共患病原菌，常寄生于动物和 人体肠道内。由沙门菌引起的食物中毒是所有细菌性食物中毒中比例最高，危害最广的一 种。沙门菌感染的禽群，是那些能够通过食物链传给人的沙门菌最为常见的储存库之一。 从家禽和禽产品中分离出沙门菌的报道明显多于其它动物，造成这一结果的主要原因是由 于沙门菌在被感染的家禽中能通过水平传播和垂直传播造成广泛流行，同时也反映出家禽 的饲养数量十分庞大。大量的研宄数据表明，不同宿主来源的沙门菌血清型存在较大的差 异，对禽源沙门菌的流行病学研宄表明，其优势血清型主要集中于鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙 门菌、肠炎沙门菌等几种严重危害家禽养殖业与人类健康的血清型，因而针对上述禽源优 势血清型沙门菌开发特异性的检测技术对于防控禽源沙门菌的传播具有重要的意义。
[0003] 由于传统的沙门菌检测技术上存在诸多缺陷，如：操作步骤烦琐耗时，现行的国家 标准或行业标准中对沙门菌的检测通常需要4-6天，已不能满足及时有效的质量监测和疾 病防控需求；灵敏度较低，当样品中沙门菌含量较低时，易造成假阴性结果；准确度不高， 尤其是加工后的食品受加热、干燥、高盐和冷冻等因素的作用，易导致沙门菌形成营养缺陷 型，用传统方法不易检出。因此，迫切需要研发操作简便、准确快速的检测技术。环介导等温 扩增技术（LAMP)是一种新型的分子检测方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特 异引物，利用链置换型DNA聚合酶，能在等温条件下（60~65°C )、Ih内特异地扩增出IO9~ 101°拷贝靶序列。在保持传统PCR技术优点的基础上，进一步提高了反应的特异性，同时缩 短了检测时间。现已被应用于多种病原微生物的检测和研宄，并具有良好的发展前景。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有沙门菌检测技术上存在诸多缺陷，旨在提供一种简单、快速、准确 的检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简单的 特点。
[0005] 本发明另一目的在于提供一种用于检测沙门菌的通用LAMP引物组。
[0006] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0007] -种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，包括：
[0008] I) 10 X LAMP 缓冲液；
[0009] 2) 8000U/mL BstDNA 聚合酶；
[0010] 3) IOmMdNTPs;
[0011] 4)LAMP引物组：外引物浓度为Spmol/yL，外引物为F3和B3 ;内引物浓度为 40pmol/ μ L，内引物为FIP和BIP ;环引物浓度为20pmol/ μ L，环引物为LF和LB ;
[0012] 5)无菌去离子水；
[0013] 6)荧光染料：10 X SYBR Green I ;
[0014] 7)阳性对照：肠炎沙门菌标准株ATCC13076基因组DNA ;
[0015] 8)阴性对照：无菌去离子水。
[0016] 所述的 10XLAMP 缓冲液含有 200mM Tris-HCl(pH 8.8,25°C )、100mM 氯化钾、 IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1 %的曲拉通X-100。
[0017] 所述的外引物F3和B3序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，所述的内引物 FIP和BIP序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示，所述的环引物LF和LB序列如SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。
[0018] 本发明待检样品基因组DNA按常规方法提取或试剂盒提取。
[0019] 本发明试剂盒LAMP检测反应体系为：每25 yL反应液中，5pmol/yL的F3和B3 各 1 μ L，40pmol/ μ L 的 FIP 和 BIP 各 1 μ L，20pmol/ μ L 的 LF 和 LB 各 1 μ L，Bst DNA 聚合 酶1 μ L，lOmmol/L的dNTPs 3. 5 μ L，待检样品DNA 2~3 μ L，无菌去离子水适量。
[0020] 本发明试剂盒采用荧光目视法时，需在反应体系中添加10XSYBR Green I 2. 5 μ L，反应体系总量保持25. 0 μ L不变。
[0021] 本发明LAMP反应条件为：66°C恒温反应50min，并在80°C持续10min。
[0022] 本发明所述的沙门菌为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌或肠炎沙门菌中的一种或几 种。
[0023] 本发明试剂盒反应完成后肉眼观察液体变混浊（如果加入荧光染料则颜色由橙 色变为绿色），则说明样品中含有鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌与肠炎沙门菌中的一种或几 种；或使用2%浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可呈现典型的特异梯状条带，阴性则无此 现象。
[0024] 本发明还提供了一种用于检测沙门菌的通用LAMP引物组，包括：外引物F3和B3 ; 内引物FIP和BIP ;环引物LF和LB。
[0025] 所述的沙门菌为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌或肠炎沙门菌中的一种或几种。
[0026] 本发明的试剂盒LAMP检测方法具有以下优点：
[0027] 1)快速高效：整个扩增过程仅需35~50min，扩增产量可达IO9~10 1(1个拷贝靶 序列；
[0028] 2)操作便捷：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变 性等繁琐步骤，只需要普通水浴锅即可进行检测；
[0029] 3)特异性强：本发明根据三种禽源沙门菌（鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌与肠炎 沙门菌）含有的特异基因序列设计6条特异性引物，应用上述引物，扩增靶序列的6个区 域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定， 形成引物二聚体概率低，确保反应的顺利进行；
[0030] 4)灵敏度高：最低检测极限可达到0. 5~0. 6pg/管，比普通PCR高1-2个数量级；
[0031] 5)适合现场检测：肉眼观察液体变浑浊即为阳性，澄清透明则为阴性；若采用荧 光目视法观察颜色变化，颜色变为绿色为阳性，橙色为阴性；或使用2 %浓度琼脂糖凝胶电 泳检测，阳性可呈现典型的特异梯状条带，阴性无此现象。
[0032] 本发明的LAMP检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高、适合现场 检测等优点，不需要配置相关检测仪器，为禽源沙门菌的检测提供了新的技术支撑，可用于 畜牧业生产单位、兽医检测实验室、屠宰场、出入境和各疾病预防控制中心筛查和检测，具 有广阔的市场前景，适于推广应用。
【附图说明】
[0033] 图1为本发明LAMP检测方法的外引物与内引物比例优化试验结果图；M为 DL-5000marker，泳道号1-6分别为外、内引物比1:5,1:6,1:7,1:8,1:9,1:10,泳道7为阴性 对照；
[0034] 图2为本发明LAMP检测方法的外引物与环引物比例优化试验结果图；M为 DL-5000marker，泳道号1-6为外、环引物比1: 1，1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,泳道7为阴性对 昭.
[0035] 图3为本发明LAMP检测方法的引物缺省试验结果图；M为DL-5000marker ;1-11分 另IJ为引物内外环引物全有、；无上游外引物F3 ;无下游外引物B3 ;无上、下游外引物F3、B3 ; 无上游内引物FIP ;无下游内引物BIP ;无上、下游内引物FIP、BIP ;无上游环引物LF ;无下 游环引物LB ;无上、下游环引物LF、LB ;内外环引物都无；泳道12为阴性对照；
[0036] 图4为本发明LAMP检测体系中不同浓度Mg2+试验结果图；M为DL-5000marker ; 1-6 分别为浓度 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM 的 MgS04;7 为阴性对照；
[0037] 图5为本发明LAMP检测体系中不同浓度Bst DNA聚合酶试验结果图；M为 DL_5000marker ; 1-6 分别对应 BstDNApolymerase 添加量依次为 0· 4、0· 6、0· 8、1. 0、1· 2、 1. 4 μ L ;7为阴性对照；
[0038] 图6为本发明LAMP检测体系中不同浓度dNTPs试验结果图；M为DL-5000marker ; 1-7分别对应反应体系