家蚕热休克蛋白hsp90基因的荧光定量pcr检测微粒子病蚕卵的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种家蚕热休克蛋白HSP90基因的荧光定量 PCR检测微粒子病蚕卵的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 家蚕微粒子病是蚕桑生产上危害严重而又长期得不到根治的传染性疫病，并严重 制约着蚕丝业的健康稳定的发展。家蚕微粒子病由家蚕微孢子虫引起，家蚕微孢子虫除了 水平传播外，还可通过胚胎向下代垂直传播。被养蚕国家或地区定为法定检疫对象。我国 蚕业每年因感染微孢子虫而烧毁大量蚕种，造成的经济损失高达千万元。
[0003] 目前蚕业生产上对微孢子虫的检疫主要是母蛾镜检，母蛾镜检法是十八世纪法国 科学家巴斯德提出，已经使用了 100多年的检疫方法，母蛾镜检法费时费力，对操作人员的 技术要求较高。而且母蛾镜检法是对母蛾进行检验，不是对蚕卵进行检测，不符合成品检测 的原则。所以大家都在探索微孢子虫检疫的新方法，目前实验室中已经建立的新检测方法 有：显微镜镜检法、免疫学检测法、PCR技术、核酸分子杂交方法、环介导等温扩增法等。但 是，上述检测方法均都是以微孢子虫为检测靶标，成品蚕卵中微孢子虫数量非常少，这些方 法的灵敏度都达不到检测要求，不能用于蚕卵的检测，不利于实际生产上广泛地推广和使 用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用家蚕热休克蛋白HSP90基因作为蚕卵检测靶标在检 测微粒子病蚕卵中的应用。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种家蚕热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR检测微 粒子病蚕卵的方法，解决了现有技术中存在的灵敏度低的问题。
[0006] 本发明所采用的第一技术方案是，用家蚕热休克蛋白HSP90基因作为蚕卵检测靶 标在检测微粒子病蚕卵中的应用。
[0007] 本发明所采用的第二技术方案是，一种家蚕热休克蛋白HSP90基因的荧光定量 PCR检测微粒子病蚕卵的方法，具体按照以下步骤实施：
[0008] 步骤1、取正常蚕卵和待测蚕卵各20粒，用试剂盒分别提取正常蚕卵和待测蚕卵 的mRNA，然后反转录成cDNA ;
[0009] 步骤2、根据豕香热休克蛋白HSP90基因序列和豕香actin基因序列设计引物； [0010] 步骤3、以步骤1获得的正常蚕卵的cDNA为模板，使用步骤2合成的引物，以家蚕 actin基因为参照，进行荧光定量PCR，得到正常蚕卵家蚕热休克蛋白HSP90基因的相对表 达量；
[0011] 步骤4、以步骤1获得的待测蚕卵的cDNA为模板，使用步骤2合成的引物，以家蚕 actin基因为参照，进行荧光定量PCR，得到待测蚕卵家蚕热休克蛋白HSP90基因的相对表 达量；
[0012] 步骤5、如果待测蚕卵家蚕热休克蛋白HSP90基因的相对表达量大于或者等于正 常蚕卵家蚕热休克蛋白HSP90基因的相对表达量3倍，则判定该待测蚕卵为不合格蚕卵，即 微粒子病蚕卵。
[0013] 本发明的特点还在于，
[0014] 根据家蚕actin基因序列设计引物的上游引物为GTCGCTGACCGCGTGACTGT，如SEQ ID NO. 3所示，下游引物为CCAAGGGGCTCACCGCTGTC，如SEQ ID NO. 4所示；根据家蚕热休 克蛋白HSP90基因序列设计引物的上游引物的序列为GGATGTCCACGTCGCACTTCA，如SEQ ID NO. 5所示，下游引物的序列为GCGCGGCTACTCGTTCACTACC，如SEQ ID NO. 6所示。
[0015] 本发明的有益效果是：本发明与现有技术相比，最大的特点是改变了检查靶标，现 有的微粒子病的检测方法均都是以微孢子虫为检测靶标，本发明则是以家蚕的热休克蛋白 HSP90为检测靶标。就像人体血清中C反应蛋白（CRP)被认为是人体急性炎症时反应最主 要、最敏感的标志物之--样。用家蚕热休克蛋白HSP90为检测靶标，可以大大提高灵敏 度。具有结果可靠和准确灵敏、检查效率高等优点。
【附图说明】
[0016] 图1是感染微孢子虫的蚕卵和正常蚕卵蛋白质SDS-PAGE电泳图谱。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0018] 实施例1家蚕卵蛋白质的提取
[0019] 取家蚕卵30粒，液氮研磨至粉状，加入200111裂解液（含9111〇1/1尿素、4%(：祖?5、 1%DTT)室温放置3h，离心（4°C，12000g，30min)取上清，并再次离心取上清，充分去除不 溶性杂质，上清即为提取的家蚕卵总蛋白溶液。采用Bradford法测定提取的蛋白质浓度。 加入6倍体积一20°C预冷的TCA-丙酮（10%三氯乙酸、0. 07%巯基乙醇溶于100%丙酮） 溶液，漩涡后静置于一20°C下，沉淀蛋白过夜；离心（4°C，12000g，15min)弃上清，沉淀用一 20°C的丙酮溶液（含0.07%巯基乙醇）悬浮30min，离心（4°〇，1200(^，1511^11)，重复2~3 次；沉淀静置于常温，挥发丙酮。沉淀加入1ml裂解液（9mol/L尿素、4% CHAPSU % DTT)， 漩涡震荡，37°C水浴I. 5h以上，离心（4°C，12000g，15min)，上清液用于蛋白质电泳分析。采 用Bradford法测定提取的蛋白质浓度。
[0020] 采用不连续电泳的电泳，参数设为浓缩电压60V持续30min ;分离电压120V，持续 时间2h，分离胶浓度为12 %，浓缩胶浓度为6 %。
[0021] 运用上述蛋白质提取与电泳条件，进行微孢子虫感染微孢子虫的蚕卵与政策蚕卵 差异蛋白质分析，如图1所示，鉴定出两条差异条带a和条带b，a条带为家蚕感染微孢子虫 后蚕卵下调蛋白质，b条带为家蚕感染微孢子虫后蚕卵上调蛋白质。
[0022] 实施例2家蚕感染微孢子虫后感染微孢子虫的蚕卵（待测蚕卵）和正常蚕卵差异 蛋白质的LC-MS/MS分析
[0023] 1、将所选择的胶带用切胶笔切下。
[0024] 2、加 50 μ L DD. H2O 洗两次，IOmin/ 次；
[0025] 3、加50mM NH4HCO3/乙腈=I : 1溶液（考染脱色液）50 μ L，超声脱色5min或37°C 脱色20min，吸干；
[0026] 4、重复步骤3,直至蓝色褪去；
[0027] 5、加乙腈50 μ L脱水至胶粒完全变白，真空抽干IOmin ;
[0028] 6、加 IOmM DT