T (10 μ L IM DTT，990 μ L 25mM NH4HCO3配制）20 μ L，56°C 水浴 Ihr ;
[0029] 7、冷却到室温后，吸干，快速加 55mM IAM(55 yL IM IAM，945 yL 25mM 順4!10)3配 制）20 μ L，置于暗室45min ;
[0030] 8、依次用 25mM NH4HC03(2*10 分钟）、25mM NH4HC03+50% 乙腈溶液（2*10 分钟）和 乙腈洗（10分钟），乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干IOmin ;
[0031] 9、将0· 1 μ g/ μ L的酶储液以25mM NH4HCO3稀释10~20倍，每EP管加2~3 μ L， 稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4°C或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加 25mM NH4HCOg总体积10-15 μ L置37°C，消化过夜；
[0032] 10、取消化好的溶液20 μ L，1000 Og离心5min，取上清加入进样瓶。进入Bruker amaZon进行检测。
[0033] 通过SDS-PAGE电泳获得两条差异条带，胶内酶切后LC/MS/MS质谱鉴定，肽指纹 图谱在数据库里搜索，得分大于14分，即该蛋白可靠。家蚕感染微孢子虫后蚕卵下调蛋白 鉴定到12个蛋白质，分别是：辅酶Q得分为26分，分子量为30249 ;细胞周期素 E得分为 26分，分子量为48455 ;二磷酸尿苷葡糖糖基转移酶得分为25分分子量为60104 ;起始复合 物得分为23,分子量为65617 ;酪氨酸轻化酶得分为21分，分子量大小为63658 ;依靠黄素 的单加养酶得分为19分，分子量大小为52659 ;-氧化氮合酶得分为18分，分子量大小为 139016。根据分子量大小进行筛选，认为二磷酸尿苷葡糖糖基转移酶，起始复合物，酪氨酸 羟化酶为差异蛋白鉴定结果。条带b即家蚕感染微孢子虫后感染微孢子虫的蚕卵上调蛋白 鉴定到八个得分大于14分的蛋白质，但HSP90等分最高达816分，分子量为78888,覆盖度 为 43%。
[0034] 实施例3家蚕感染微孢子虫的蚕卵（待测蚕卵）上调蛋白HSP90的荧光定量PCR 分析
[0035] 差异蛋白质组学的方法和LC-MS/MS的鉴定结果显示家蚕感染微孢子虫后带毒蚕 卵HSP90 (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示）表达量 增加。为了详细分析hsp90在携带微孢子虫的带毒蚕卵与正常蚕卵中的表达量情况，用荧 光定量PCR技术在mRNA水平进行上进行了 hsp90在携带微孢子虫的带毒蚕卵与正常蚕卵 中的表达分析。
[0036] 3. 1实验材料和方法
[0037] 3. I. 1实验材料
[0038] 豕香大造品系正常香卵、豕香大造品系带毒香卵
[0039] 3. 1. 2实验试剂和试剂盒
[0040] RNA提取试剂盒QIAGEN的RNasy Protect Mini Kit购自购自重庆百瑞公 司；来自宝生物的 DEPC(TaKaRa)、反转录试剂盒 PrimeScriptTM RT cDNA reagent Kit(TaKaRa)、PCR扩增试剂PerfectShot Taq(TaKaRa)、2000bp DNA Ladder(TaKaRa)、EASY Dilution(TaKaRa)、20bp DNA Ladder(TaKaRa)、扩增试剂 PerfectShot Taq、RNase free Water (TaKaRa)、DL5000DNA Marker 均购自成都天泰微克公司；PCR 八连管（AXYGEN)、SYBR Green IqPCR荧光定量试剂盒（天跟）购自重庆鼎今公司。引物合成由华大基因完成。
[0041] 3. 1.3 仪器
[0042] 表1仪器
[0043]
【主权项】
1. 用家蚕热休克蛋白HSP90基因作为蚕卵检测靶标在检测微粒子病蚕卵中的应用。
2. -种家蚕热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR检测微粒子病蚕卵的方法，其特征 在于，具体按照以下步骤实施： 步骤1、取正常蚕卵和待测蚕卵各20粒，用试剂盒分别提取正常蚕卵和待测蚕卵的mRNA，然后反转录成cDNA; 步骤2、根据豕香热休克蛋白HSP90基因序列和豕香actin基因序列设计引物； 步骤3、以步骤1获得的正常蚕卵的cDNA为模板，使用步骤2合成的引物，以家蚕actin基因为参照，进行荧光定量PCR，得到正常蚕卵家蚕热休克蛋白HSP90基因的相对表达量； 步骤4、以步骤1获得的待测蚕卵的cDNA为模板，使用步骤2合成的引物，以家蚕actin基因为参照，进行荧光定量PCR，得到待测蚕卵家蚕热休克蛋白HSP90基因的相对表达量； 步骤5、如果待测蚕卵家蚕热休克蛋白HSP90基因的相对表达量大于或者等于正常蚕 卵家蚕热休克蛋白HSP90基因的相对表达量3倍，则判定该待测蚕卵为不合格蚕卵，即微粒 子病蚕卵。
3. 根据权利要求2所述的家蚕热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR检测微粒 子病蚕卵的方法，其特征在于，所述根据家蚕actin基因序列设计引物的上游引物为 GTCGCTGACCGCGTGACTGT，如SEQIDNO. 3 所示，下游引物为CCAAGGGGCTCACCGCTGTC， 如SEQIDNO. 4所示；根据家蚕热休克蛋白HSP90基因序列设计引物的上游引 物的序列为GGATGTCCACGTCGCACTTCA，如SEQIDNO. 5所示，下游引物的序列为 GCGCGGCTACTCGTTCACTACC，如SEQIDNO. 6 所示。
【专利摘要】本发明公开了用家蚕热休克蛋白HSP90基因作为蚕卵检测靶标在检测微粒子病蚕卵中的应用；本发明还公开了一种家蚕热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR检测微粒子病蚕卵的方法；本发明与现有技术相比，最大的特点是改变了检查靶标，现有的微粒子病的检测方法均都是以微孢子虫为检测靶标，本发明则是以家蚕的热休克蛋白HSP90为检测靶标。用家蚕热休克蛋白HSP90为检测靶标，可以大大提高灵敏度。具有结果可靠和准确灵敏、检查效率高等优点。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104726574
【申请号】CN201510104912
【发明人】王林玲, 党晓群, 姜春宝, 苗雪, 李治, 周泽扬
【申请人】重庆师范大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月10日