一种基于核酸外切酶和g四聚体的分子检测方法及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分子检测方法，特别涉及一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]环境中存在多种对人体有害的分子，快速、低成本地检测出这些有害小分子具有非常实际的意义。
[0003]17b_雌二醇被认为是作用最强烈、最具潜在影响的一类内分泌干扰物，广泛存在于河流、土壤、大气以及农产品中。它主要来源于杀虫剂、废气、食品添加剂、人畜排泄物及生活污水，即使在极低的浓度下也会对生物体产生明显的影响，其含量水平与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌以及男性生殖障碍具有显著相关性。传统的17b-雌二醇检测方法主要有高效液相色谱法、气质联用法、液质联用法等，这些方法需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，需要经验丰富的操作人员，而且难以实现大批量样本的现场快速分析。另一种方法是以抗体来检测17b-雌二醇，但是抗体的制备过程繁琐，保存麻烦，而且要涉及多次洗涤与分离过程，因而限制了它们的广泛应用。
[0004]G四聚体序列是由富含G碱基的一段单链DNA组成，在缓冲体系和hemin (氯高铁血红素)存在的情况下，可折叠成G四聚体二级结构。G四聚体具有类似HRP (辣根过氧化物酶)的催化活性，可催化氧化TMB (四甲基联苯胺)产生蓝色底物，使反应溶液肉眼可见。以G四聚体来检测分子具有操作简单，方便现场快速分析等优点。但是基于G四聚体的比色法检测灵敏度低，需要进一步提高灵敏度。传统的信号放大技术主要是PCR以及一系列依赖工具酶的信号扩增技术，但是酶的使用不仅增加了成本和操作步骤，而且酶的存储也比较麻烦，因此需要研发一种无需工具酶信号扩增技术来提高检测灵敏度。
[0005]核酸适体(aptamer，源于拉丁语)指的是经体外筛选技术SELEX (指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括核酸外切酶和如下核酸序列:
DNAl:待测分子核酸适体的一端适当延伸，形成DNA1，延伸的核酸中，靠近核酸适体一端的为I*区，其余部分记为2*区； DNA2:DNA2与DNAl的I*区和核酸适体的部分核酸连续互补配对，DNA2的另一端至少有4个碱基不与DNAl互补配对；
DNA3:具有茎环结构，其一端为I区，中间依次为2区和连接序列，另一端为G四聚体序列，G四聚体至少有6个碱基的核酸序列位于茎环结构的茎上，DNA3的I区与DNAl的I*区完全互补配对，2区与2*区靠近I*区核酸至少部分连续互补配对。
[0008]作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，I*区至少具有6个碱基，2*区至少具有24个碱基。
[0009]作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，DNA2中至少有6个碱基与待测分子核酸适体连续互补配对。
[0010]作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，待测分子为17b_雌二醇，核酸序列如下:
DNAl:5’-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-GCAGAT-GGGTTGGGATTACGATAGATAATA-3，(SEQ ID NO:1);
DNA2:5’-ATCTGCGCTTCCGCGCTTATAATA-3’ (SEQ ID NO:2);
DNA3:5’-GGGTAGGGCGGGTTGGG-ATTACGATAGTCCAATCACAACCTATCGTAATCCCAACCC-ATCTGC-3’ (SEQ ID NO:3);
DNA杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl ；
TMB显色缓冲液，含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl, 10 μ L 0.5%的 TMB，20 μ L 30% 的 H2O2, ρΗ=5.0。
[0011]作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，核酸外切酶为核酸外切酶III。
[0012]作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，对DNAl的1*、2*区，DNA2和DNA3核酸序列中至少一个核苷酸进行修饰，以在不改变碱基互补配对原则的情况下，提高核酸序列之间的亲和力。
[0013]一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法，包括如下步骤:
1)将DNAl和过量DNA2于DNA杂交缓冲液中混合反应，形成DNA1-DNA2复合体；
2)将DNA1-DNA2复合体、待测样品混合反应完全；
3)加入DNA3、核酸外切酶，混合反应完全；
4)加入氯高铁血红素，反应完全后与TMB显色缓冲液混合反应，根据反应液的颜色变化确定检测结果，反应液变蓝说明待测样品中存在待测分子；
其中，DNAl?DNA3如上所述。
[0014]作为上述分子检测方法的进一步改进，DNA杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl 以及 50 mM KCl。
[0015]作为上述分子检测方法的进一步改进，TMB显色缓冲液，含有26.6 mM柠檬酸，51.4mM 磷酸氢二钠，25 mM KCl, 10 μ L 0.5% 的 TMB，20 μ L 30% 的 H2O2, ρΗ=5.0。
[0016]本发明的有益效果是:
本发明的检测方法及检测试剂盒具有较高的灵敏度，对17b-雌二醇的检测限为I pM，检测结果肉眼可见，适于现场快速分析。
[0017]本发明所述的分子检测方法应用核酸适体实现待测分子的捕捉，具有很好的特异性，其他常见的干扰物对检测不产生影响。
[0018]以G四聚体作为信号报告分子，与核酸外切酶介导的信号放大技术结合，可产生大量的具有催化活性的G四聚体，整个操作简单，经济便宜，不需要使用任何检测仪器，不需要专业技术人员，无须培训即可推广使用。
【附图说明】
[0019]图1是本发明检测方法的原理示意图；
图2为不同浓度17b-雌二醇检测的结果图；
图3为特异性实验结果图。
【具体实施方式】
[0020]一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括核酸外切酶和如下核酸序列:
DNAl:待测分子核酸适体的一端适当延伸(3’端和5’端均可)，形成DNA1，延伸的核酸中，靠近核酸适体一端的为I*区，其余部分记为2*区；
DNA2:DNA2与DNAl的I*区和核酸适体的部分核酸连续互补配对，以确保DNA1-DNA2复合物的稳定性；DNA2的另一端至少有4个碱基不与DNAl互补配对，防止被核酸外切酶切割；
DNA3:具有茎环结构，其一端为I区，中间依次为2区和连接序列，另一端为G四聚体序列；G四聚体至少有6个碱基的核酸序列位于茎环结构的茎上，此时的G四聚体没有催化活性；DNA3的I区与DNAl的I*区完全互补配对，2区与2*区靠近I*区核酸至少部分连续互补配对，以确保DNA1-DNA3复合物的稳定性。
[0021]作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，I*区至少具有6个碱基，以确保结合的稳定性。
[0022]作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，2*区至少具有24个碱基，其中2*区与DNA3的2区部分结合，以确保DNA1-DNA3复合物的稳定性。
[0023]作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，DNA2中至少有6个碱基与待测分子核酸适体连续互补配对，以确保结合的稳定性。同时DNA2与待测分子核酸适体的碱基互补配对数也不宜过多，一般不超过20个碱基互补配对，以免影响待测分子与DNAl中的核酸适体竞争性结合从而把DNA2置换下来。
[0024]作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，核酸外切酶优选为核酸外切酶III。因为核酸外切酶III能从平末端的3’端到5’端切割双链DNA，核酸外切酶III不能切割凸出来的3’端也不能切割平末端的5’端。
[0025]作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，对DNAl的1*、2*区，DNA2和DNA3核酸序列中至少一个核苷酸进行修饰，以在不改变碱基互补配对原则的情况下，提高核酸序列之间的亲和力。如通过锁核酸修饰以提高碱基之间的亲和力，使用较短的序列实现本发明的技术方案。
[0026]下面结合附图，以17b_雌二醇的检测为例，进一步说明本发明的检测原理:
如图1所示，17b-雌二醇的核酸适体的3’端适当延伸，形成DNAl JfDNAl和DNA2在缓冲体系中反应一段时间，DNA2与DNAl的I*区以及核酸适体3’端的至少6个碱基连续互补配对，形成DNA1-DNA2复合物。其中DNA2的3’端至少有4个碱基不与DNAl互补(防止被核酸外切酶III切割)。在DNA1-DNA2复合物中，DNAl中的I*区域被DNA2封闭。
[0027]当DNA1-DNA2反应体系中存在17b_雌二醇时，17b