专利名称：外切酶－纳米孔的单分子核酸测序方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的测定方法，特别是一种外切酶—纳米孔的单分子核酸测序方法。
背景技术：
随着后基因组世代的到来，对DNA和RNA等生物大分子序列测定的需求量大量增加，但目前的测序方法速度慢、费用高、有缺口，严重妨碍了相关学科的发展，如基因组测序，2006年6月NCBI公布的结果，已完成真核生物基因组测序的21个，完成组装的100个，正在进行的164个。实际上，这仅仅是拉开了大量基因组测序的序幕，因为对基因组测序的需要是多方面的。但是，用目前的方法满足上述多种测序的需求，还很不现实，主要是当前的方法存在许多缺陷，可简单地归结为速度慢、费用高和有大量缺口。所以，要实现上述各种“梦想”，必须研发新的测序技术以替代当前的测序方法。
经对现有文献检索发现，Astier，Y.et al.，(2006)Toward singlemolecule DNA sequencingDirect identification of ribonucleoside anddeoxyribonucleoside 5’-monophosphates by using an engineered proteinnanopore equipped with a molecular adapter.Journal of the AmericanChemical Society 1281705-1710。在《美国化学协会杂志》以“朝向单分子DNA测序用适配分子工程化蛋白纳米孔直接鉴别核苷和脱氧核苷5’一磷酸盐”为题，报道了其研究结果。认为，通过检测外切酶降解而释放的核苷5’一磷酸有可能对核酸单分子测序，用工程化的α-蛋白孔识别核苷和脱氧核苷5’一磷酸盐，准确率为93-98％。因采用的是蛋白质纳米孔，不能耐受较高的电压、易老化，错误率太高，还不能用于测序。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种外切酶—纳米孔的单分子核酸测序方法。使其测定核酸(包括DNA和RNA)序列，测定速度快、测定质量高、测定费用低、基本不留缺口，可满足以DNA序列为基础的动植物及微生物的遗传改良、有害微生物的控制和各种生物基因组的大规模核酸测序的各种需求。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤①单核苷酸的电信号检测，建立标准曲线；所述的单核苷酸的电信号检测，是将电泳槽加入电泳液，在电泳槽中间，用带有单个纳米孔(直径1-2nm，孔深在1-20μm)薄膜的传感器将两级隔开，分别检测磷酸基团位置固定3’或者5’脱氧腺苷—磷酸dAMP、脱氧鸟苷一磷酸dGMP、脱氧胞苷一磷酸dCMP和脱氧胸苷一磷酸dTMP，4种脱氧核苷一磷酸(dNMPs)、dmetCMP(甲基化脱氧胞苷一磷酸)或腺苷一磷酸rAMP、鸟苷一磷酸rGMP、胞苷一磷酸rCMP和尿苷一磷酸rUMP，4种核苷一磷酸(rNMPs)在穿越纳米孔时留下的电信号，由于不同的核苷酸dNMPs或rNMPs(简称nt)的分子量和三维结构的差异，当穿越筒型纳米孔时，它们穿越纳米孔的时间(实验条件控制在约1000个穿越事件/秒)以及对离子流的阻力也各异，因此用膜片钳检测电信号时，将电信号转换为各自的“笔迹”，并建立标准曲线。
②膜片钳检测电信号；所述的膜片钳检测电信号，在负极，将1条双链DNA或单链DNA或RNA(以下统称靶核酸)的3’或5’端固定，用每次只降解1个核苷酸、核苷酸降解物上磷酸基团位置固定、每秒降解约1000个核苷酸、延续性长的双链DNA或单链DNA或RNA外切酶(以下统称外切酶)降解靶核酸，在外加电场作用下，降解产物按它们在原靶核酸中的相对位置，有序地自负极向正极移动过程中穿越纳米孔，膜片钳检测电信号。
③根据标准曲线，将电信号转换为具体的核苷酸，并根据外切酶的切割方向，获得靶核酸的碱基序列。
所述的根据标准曲线，将电信号转换为具体的核苷酸，是指将一个核酸分子固定于电泳槽负极，用外切酶从自由端逐个降解并释放核苷酸，在外加电场作用下，核苷酸有序地自负极向正极移动时穿越纳米孔，膜片钳记载各核苷酸的笔迹，根据标准曲线将电信号转换为碱基，再根据外切酶的切割方向，实现核酸的单分子测序。
所述的标准曲线，采用一根单壁碳纳米管包埋于聚合物中的薄膜直径和孔深作为二维可控的单孔传感器，在外加电场作用下，膜片钳检测各种核苷和脱氧核苷5’(或3’)一磷酸自负极向正极移动过程中穿越纳米孔时产生的电信号(穿孔时间和产生的电阻)，将各种碱基的笔迹分开，建立标准曲线。
上述的每一个纳米孔作为一个测序单元，将该单元组装成阵列(如10×100或100×100)，构成高通量测序仪。
如果核酸为dsDNA(双链DNA)，测序后还可用ssDNA(单链DNA)外切酶对其互补链测序，进一步提高测序的准确性，此外，还可通过对甲基化脱氧胞苷(dmetC)一磷酸笔迹的识别，为高等生物来源于不同组织器官细胞的DNA甲基化模式研究提供新的诊断工具。
本发明采用的是直径和孔深均可控制的单壁碳纳米管(SWCNT)包埋于多聚物的筒型单纳米孔，硬度高、表面光洁、无静电，可耐受较高的电压、更经久耐用、信噪比更高，所以，对核苷和脱氧核苷一磷酸的识别准确性更高，本发明不仅可检测核苷和脱氧核苷5’一磷酸，还可以检测3’一磷酸，而且还可检测天然真核生物DNA中的甲基化胞苷。
图1.本发明测序示意图具体实施方式
实施例1DNA片段测序①dNMPs笔迹的检测将两级与膜片钳连接的电泳槽中加入电泳液，用直径和孔深可控的纳米元件从中间将电泳槽隔开，每次只加入一种超稀释的核苷酸，打开电源记载单个核苷酸穿越纳米孔时的电信号；如此对各类核苷酸的穿孔电信号进行检测，最后确定各自特异的笔迹，建立标准曲线，并编写软件。
②计算核苷酸的泳动速度，求出碱基序列的外切酶最远作用点；当每次上述检测结束时，将正负电极相互转换，使聚集在原正极的核苷酸向新的正极泳动，计算电极转换至核苷酸到达纳米孔的时间，获得特定条件下它们在电泳液中的泳动速度，求出在确保外切酶产物达到纳米孔时仍保留原靶核酸的碱基序列的外切酶最远作用点。
③单分子操作采用磁珠捕获法；1.将单细胞破壁后提取DNA，再经超声波破碎为大片段DNA备用；将抗生物素包衣的磁珠按Margulies等(Genome sequencing in microfabricatedhigh-density picolitre reactors.2005，Nature 437376-380.刊物名称自然；题目“在微型制作的高密度皮升反应器中的基因组测序”)的方法与长度、序列已知和末端用生物素标记的DNA片段按1∶1连接，即每个磁珠只连接1个片段；连接在磁珠上的DNA片段与靶核酸片段用连接酶连接，显微获取单个磁珠。
④单分子DNA片段的固定将带有1个靶核酸分子的磁珠固定到安装在一个测序单元电泳槽负极端的磁铁上，磁铁与纳米孔的距离不超过步骤②中所称的外切酶最远作用点，将一条靶核酸一端固定，最后使整个阵列的每一个测序单元都有一条靶核酸。
⑤序列检测在电泳槽负极添加外切酶，待单个酶分子与DNA结合后，添加镁离子，立即打开电源，收集电信号，并用软件读取DNA序列，完成序列组装。
⑥互补链序列的检测待dsDNA外切酶降解结束后，再用ssDNA外切酶降解剩下的ddDNA互补链，如果降解dsDNA的外切酶为5’→3’，则需选用3’→5’ddDNA外切酶，反之亦然。此次检测互补链，除可与上一步测序结果相互印证外，在不能直接检测dmetCMP笔迹是，还可通过此步骤检测DNA中胞苷的甲基化状态。
效果在目前仪器的分辨能力下(1个事件/毫秒)，适于本发明的外切酶活性以500-1000nts/秒为宜，即每个测序单元每秒检测500-1000个碱基序列，每小时最快检测360kb(千碱基对)。
高通量核酸测序仪的测序速度＝阵列中的测序单元数×测序单元测序速度，如果是100×100阵列，则测序仪的测序最高速度为3600mb(百万碱基对)，也即人类的8C(单倍体细胞基因组大小)基因组可在7小时以内完成测序，费用在1万元以内，测序准确性在99％以上，还能检测高等生物不同组织器官来源细胞的甲基化状态。
实施例2完整染色体测序①单分子操作本例中的核苷酸笔迹检测、外切酶最远作用点同实施例1。
用显微镜、流式细胞仪或其他方法辅助，提取单条染色体，按实施例1的方法将染色体固定在磁珠上。
②染色体固定将带有1条完整染色体的磁珠固定到安装在一个测序单元电泳槽负极端的磁铁上，磁铁与纳米孔的距离不超过外切酶最远作用点，最后使整个阵列的每一个测序单元都有一条染色体。
③序列检测在电泳槽负极添加核酸外切酶，待单个酶分子与DNA结合后，添加镁离子，立即打开电源，收集电信号，并用软件读取DNA序列。
④互补链序列的检测同实施例1。
效果以整条染色体为底物进行测序，虽然阵列的作用得不到像实施例1那样的充分发挥如人类体细胞有46条染色体，因此只有46个测序单元的阵列就可满足测序，人类最长的第一染色体约245,203,898bp(碱基对)，在外切酶活性为1000nts/秒，约需680小时，虽然速度会下降，但最后的序列无需拼接和组装，可解决当前测序方法中存在的缺口问题。
实施例3RNA测序①rNMPs笔迹的检测同实施例1，根据它们产生的特异电信号建立标准曲线。
②按照实施例1的方法将RNA单分子固定到电泳槽负极，用RNA外切酶逐个降解核苷酸，膜片钳记载笔迹，根据标准曲线将电信号转换为序列信息。
③亦可以RNA为模板，通过反转录酶合成cDNA(互补DNA)，再按实施例1的步骤获得RNA的序列。
实施效果适于本发明的RNA/DNA外切酶活性在1000nts/秒为宜，如检测mRNA序列，按mRNA平均长度1000nts计，100×100的阵列，即每秒可完成10000个mRNA或cDNA序列的测定。
权利要求
1.一种外切酶-纳米孔的单分子核酸测序方法，其特征在于，包括如下步骤①单核苷和脱氧核苷一磷酸以及dmetCMP的电信号检测，建立标准曲线；②DNA/RNA的酶切，单个核苷和脱氧核苷一磷酸穿越纳米孔，膜片钳记载电信号；③根据标准曲线，将电信号转换为具体的核苷酸，结合外切酶的切割方向，获得靶核酸的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的外切酶-纳米孔的单分子核酸测序方法，其特征是，所述的单核苷酸的电信号检测，电泳槽加入电泳液，在电泳槽中间，用带有单个纳米孔薄膜的传感器将两级隔开，分别检测磷酸基团位置固定3’或者5’脱氧腺苷一磷酸dAMP、脱氧鸟苷一磷酸dGMP、脱氧胞苷一磷酸dCMP和脱氧胸苷一磷酸dTMP4种脱氧核苷一磷酸(dNMPs)、dmetCMP(甲基化脱氧胞苷一磷酸)或腺苷一磷酸rAMP、鸟苷一磷酸rGMP、胞苷一磷酸rCMP和尿苷一磷酸rUMP等4种核苷一磷酸(rNMPs)在穿越纳米孔时留下的电信号，由于不同的核苷酸dNMPs或rNMPs的分子量和三维结构的差异，当穿越筒型纳米孔时，将给出不同的电信号，用膜片钳记载电信号，将电信号转换为各自的“笔迹”，并建立标准曲线。
3.根据权利要求2所述的外切酶-纳米孔的单分子核酸测序的方法，其特征是，所述的单个纳米孔，其直径1-2nm，孔深在1-20μm。
4.根据权利要求2所述的外切酶-纳米孔的单分子核酸测序方法，其特征是，所述的穿越筒型纳米孔，穿越时间的实验条件控制在平均穿越1000nts/秒，符合当前膜片钳的分辨率。
5.根据权利要求1所述的外切酶-纳米孔的单分子核酸测序的方法，其特征是，所述的膜片钳检测电信号，在负极，将靶核酸1条双链DNA或单链DNA或RNA的3’或5’端固定，用每次只降解1个核苷酸、核苷酸降解物上磷酸基团位置固定、每秒降解约500-1000个核苷酸、延续性长的双链DNA或单链DNA或RNA外切酶降解靶核酸，在外加电场作用下，降解产物按它们在原靶核酸中的相对位置，有序地自负极向正极移动过程中穿越纳米孔时，膜片钳检测电信号。
6.根据权利要求1或者2所述的外切酶-纳米孔的单分子核酸测序方法，其特征是，所述的标准曲线，采用一根单壁碳纳米管包埋于聚合物中的薄膜直径和孔深作为二维可控的单孔传感器，在外加电场作用下，膜片钳检测各种核苷酸和脱氧核苷酸5’(或3’)一磷酸自负极向正极移动过程中穿越纳米孔时产生穿孔时间和产生的电阻的电信号，将各种碱基的笔迹分开，建立标准曲线。
7.根据权利要求1或者2所述的外切酶-纳米孔的单分子核酸测序的方法，其特征是，所述的根据标准曲线，将电信号转换为具体的核苷酸，是指将一个核酸分子固定于电泳槽负极，用核酸外切酶从自由端逐个降解并释放核苷酸，在外加电场作用下，核苷酸有序地自负极向正极移动时穿越纳米孔，膜片钳记载各核苷酸的笔迹，根据标准曲线将电信号转换为碱基序列，实现核酸的单分子测序。
8.根据权利要求2或者3或者4所述的外切酶-纳米孔的单分子核酸测序的方法，其特征是，所述的纳米孔，每一个纳米孔作为一个测序单元，将该单元组装成阵列。
9.根据权利要求1或者2或者5所述的外切酶-纳米孔的单分子核酸测序的方法，其特征是，如果核酸为dsDNA，测序后还可用ssDNA外切酶对其互补链测序。
全文摘要
本发明涉及的是一种生物技术领域的外切酶－纳米孔的单分子核酸测序的方法。包括如下步骤①单分子核苷酸的电信号检测，建立标准曲线；②将核酸固定在电泳槽负极，外切酶逐个降解核苷酸，穿越纳米孔时，膜片钳检测电信号；③根据标准曲线，将电信号转换为具体的核苷酸，根据外切酶的切割方向，获得靶核酸的碱基序列。本发明采用的是直径和孔深均可控制的单壁碳纳米管包埋于多聚物的筒型单纳米孔，硬度高、表面光洁、无静电，可耐受较高的电压、更经久耐用、信噪比更高，所以，对核苷和脱氧核苷一磷酸的识别准确性更高，本发明不仅可检测核苷和脱氧核苷5’一磷酸，还可检测核苷和脱氧核苷3’一磷酸，而且还可检测天然真核生物DNA中的甲基化胞苷。
文档编号C12Q1/68GK1932039SQ20061011629
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月21日 优先权日2006年9月21日
发明者王志民 申请人:上海交通大学