专利名称：一种快速分析单分子的纳米孔测试仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能够用于单分子多种特性研究的纳米孔测试仪，该测试仪能够应用于基因的超快速测序、用于生物单分子(DNA、RNA、蛋白质分子等)的筛选、分离、计数，能 够用于纳米量级大小的药物分子的筛选和分析。
背景技术：
目前，检测生物单分子的方法，尤其是检测DNA分子排序的常用方法有“Sanger方 法”和“shotgun方法”，以及“454生命科学公司”的JonathanRothberg与其同事发明的方 法——焦磷酸测序法。这些测序方法，基本原理和方法都是对样品先“分段”、再“测序”，最 后“拼接”。使用这些技术对一种生物的基因进行完全测序，其花费十分昂贵，所需时间长。基因测序技术进一步发展和普及应用需要研发新的测序方法，降低测序成本、提 高测序速度。新一代基因测序技术的革新目标主要集中在以下几个方面(1)测序成本低； (2)测序速度(超)快；(3)结果准确性高；(4)每次阅读碱基长度大。目前，新一代测序技 术的研发以单分子测序技术为指导思想，主要技术有合成测序技术，杂交测序技术，连接 测序技术，纳米孔测序技术。其中，美国哈佛大学Daniel Branton.Jene Golovchenko以及 加利福尼亚大学Dave Deamer教授等提出的纳米孔测序技术是最有潜力实现低价高效超快 的全基因测序技术。但是，利用现有的纳米孔研制方法制作纳米孔，成品率不高；纳米孔的厚度一般也 比较大，有IOnm左右；而且，所研制的纳米孔是单独存在的，即单个纳米孔被制作在一块面 积较大的绝缘固体薄膜的中心(蛋白质α-溶血素生物纳米孔也是被安置在一块面积较大 的绝缘平面上)。单个的纳米孔在测序应用中有许多缺点。首先，穿孔的DNA分子是随机竞 争的结果；不能够控制单独一个DNA分子穿越纳米孔。其次，穿孔的DNA分子速度很大，而 且不是勻速运动；不能控制DNA分子的穿越速度。这些因素导致不能获取穿孔DNA分子的 准确信息，从而导致对基因序列的误判，严重制约纳米孔技术的实用化发展。中国发明专利申请“一种合成的固体侧向纳米孔”(申请号2007100729863)公开 了一种合成的固体侧向纳米孔，其目的是为了有效引导单个DNA分子无纠缠、勻速地穿越 纳米孔，并对其准确测序。其不足之处是缺乏对单个样品分子的有效选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够挑选单个样品分子，并引导其无纠缠、勻速进入纳 米孔的快速分析单分子的纳米孔测试仪，用于生物分子如DNA、RNA、蛋白质、核糖，甚至细 胞、以及药物分子等的多种特性研究，解决对单个样品分子性质的快速测定。本发明实现过程如下一种快速分析单分子的纳米孔测试仪，包括样品操纵系统和信号处理系统，其中 样品操纵系统用于引导被分析样品无纠缠、伸展开、勻速地穿越纳米孔通道系统，其包括微 纳米孔通道系统和动态检测调控系统；信号处理系统包括信号采集系统、信号分析系统和计算机显示系统，微纳米孔通道系统由高绝缘材料制作而成，其对单个分析样品进行选择，并保证 分析样品无缠绕、勻速地进出并穿越整个通道；信号采集系统用于实时收集样品在外力作用下流经通道系统时引起的通道阻塞 效应信号；信号分析系统用于接收信号采集系统采集到的信号，进行数据整理，同时，接收 动态检测调控系统检测到的样品输运信息，根据分析结果，将信息反馈给动态检测调控系 统；
计算机显示系统根据信号分析系统传递的信息，结合生物物理数学模型，确定分 析样品的特定性质；动态检测调控系统接受信号采集系统采集到的样品输运信息，根据信号分析系统 的分析结果，控制样品的运动方向和速度。所述的微纳米孔通道系统采用了 “T”字形结构的两段样品进出通道、在初始进样 通道内沉积有选择单分子的多个检测调控电极(一般2 5个)，通道内设置有调整样品运 动方向的电极，使用软件控制多电极配合组对。微纳米孔通道系统包括有样品储蓄池，样品 回收池，初始进样通道，进样通道，辅助出样通道，出样通道，选择单个DNA分子以及检测和 调控样品输运状态的电极和纳米孔。微纳米孔通道系统包括有孔径可小至1. 5纳米、孔深 至单原子级的纳米孔。在上述微纳米孔通道系统中集成有多组(4 8组)电极，在通道系统的分叉路口 设置有用于探测分析样品的运动位置和引导样品运动方向的电极。纳米孔检测仪系统的样品动态检测与调控系统采用集成电路芯片实现。纳米孔检测仪的信号采集部分采用精密微电流测试仪。动态检测调控系统、信号采集系统、信号分析系统和计算机显示系统为模块化集 成式结构，各模块通过软件控制实现功能联动。本发明的优点与积极效果本发明所提供的纳米孔检测仪系统，通道内径由微米逐渐减至纳米的结构与多电 极相结合，保证了对单个分析样品的选择；与纳米孔直接相连的足够长(可至厘米级)的进 样通道和出样通道保证长链生物大分子分析样品一次性进出纳米孔、无需分割；与纳米孔 直接相连的足够长、孔径小至50nm的进样通道和出样通道保证了样品分子勻速、无纠缠进 出和穿越纳米孔；孔径小至1. 5nm、孔深至单原子级的纳米孔保证了分析样品时检测电流 的高准确性；样品操纵系统和信号处理系统通过软件实现功能联动，保证了对分析样品运 动状态的实时监测调节，进而实现对单个分子特定性质的快速检测。
图1本发明快速分析单分子的纳米孔测试仪总体框图；图2微纳米孔通道系统结构示意图；图3信号分析与处理软件流程图。1-样品储蓄池 2-样品回收池 3-样品回收池4-电极5-电极6-电极
7-电极8-电极9-电极10-电极11-初始进样通道12-进样通道13-辅助出样通道14-出样通道 15-纳米孔
具体实施例方式图1为本发明提供的纳米孔测试仪系统原理框图。如图1所示，它包括五个主要 组成部分微纳米孔通道系统，信号采集系统，信号分析系统，样品动态检测调控系统和计 算机显示系统。图2为微纳米孔通道系统结构示意图，其可选择单个DNA分子、并操纵其定向运 动，包括有样品储蓄池(1)，样品回收池(2)，样品回收池(3)，初始进样通道(11)，进样通道 (12)，辅助出样通道(13)，出样通道(14)，选择单个DNA分子、以及检测和调节样品输运状 态的电极(4)、电极(5)、电极(6)、电极(7)、电极(8)、电极(9)、电极(10)和纳米孔(15)。微纳米孔通道系统包括有绝缘材料组成的通道实体和沉积在其中的电极，在信息 分析系统和动态调控系统的信号指令控制下，各电极上的电压实时调整，引导样品在通道 内运动，并与通道相结合，挑选单个分析样品，在通道内勻速运动。本发明采用了“T”字形 结构的两段样品进出通道、在初始进样通道内沉积有选择单个样品的多个检测调控电极、 通道内设置有调整样品运动方向的专用电极等。在本发明的较佳实施例子中，选择单个样品的初始进样通道内设置的微电极系统 有3个，通道的长度2毫米，通道的孔径是逐渐缩小、为楔型结构。当然，也可以选取1 2 个或更多的电极系统和孔径相等的通道等组成挑选单个样品的通道。图2中的电极(10) 设置在通道系统的分叉路口，作用有两个，一是用于探测分析样品的运动位置，一是引导样 品的运动方向。本发明的信号处理系统包括信号采集系统、信号分析系统和计算机显示系统。信 号处理系统用来对通道内的流体施加特定的外电场作用，引导操纵样品在通道内的运动、 分析穿越纳米孔样品的一定特性。在较佳的实施例子中，信息处理系统各个部分各自采用 集成电路实现。检测电极(7)、电极(8)、电极(9)和电极(10)与样品储蓄池(1)、样品回收 池⑵和样品回收池(3)内的电极(4)、电极(5)、电极(6)构成回路，监测分析样品分子是 否通过该处，由信息采集系统电极实时采集信号、并反馈至信息分析系统，由分析系统分析 得到的结果，判断测试样品在通道内的运动情况，并向通道检测和调控系统发出指令，调整 各电极正负、调整电场方向，控制样品在通道内运动。根据图3所示的信号分析与处理软件流程图中描述的信息控制流程，实现信号采 集系统、信号分析系统、动态检测调控系统、计算机显示系统之间的功能联动，本发明纳米 孔测试仪对单个DNA分子的测序实验基本过程如下首先将适量的缓冲液注入到样品储蓄池(1)内，由于液体的流动以及毛细管作 用，缓冲液将连续通过初始进样通道(11)、初始出样通道(13)，进入样品回收池(2)；同时， 缓冲液连续通过初始进样通道(11)、进样通道(12)、纳米孔(15)、出样通道(14)，最后进入 样品回收池(3)。然后，将样品DNA溶液注入到样品储蓄池⑴内，接通电极(4)、电极(5)，前者为 负、后者为正电极。DNA在外界电场力作用下，进入初始进样通道(11)，并向样品回收池(2)方向移动。当样品进入通道(11)后，信号分析控制系统向动态监控系统发出指令，检测电 极(7)开通，并与电极(4)组成阻止样品继续定向运动的电场，禁止后续样品继续进入通道 (11)；同时，电极(7)与电极(5)组成的电场继续引导样品在通道(11)内移动。根据同样 原理，信息分析控制系统向动态监控系统发出指令，依次间隔开通电极(8)、电极(9)，组成 不同大小和方向的电场力，在通道(11)内分阶段阻止更多样品的移动，选择单个DNA分子 越过电极(9)。 随后，信息采集系统将信息传递给分析控制系统，后者向动态监控系统发出指令， 控制系统电路，开通电极(10)、电极(6)，同时关闭电极(5)。电极(9)和电极(10)之间的 电场将减缓DNA分子的运动速度，电极(6)与电极(9)、电极(10)之间组成电场引导样品进 入进样通道(12)，穿越纳米孔(15)、出样通道(14)，最后进入回收池(3)。在本发明的较佳实施例子中，进样通道(12)的孔径<50nm，最佳为 5nm，长度足 够长、大于被测样品的长度。进入进样通道(12)内的单个DNA分子伸展开勻速移动。样品 在电场作用下，无纠缠地进入并穿越纳米孔(15)后进入出样通道(14)。本发明较佳实施例 子中，纳米孔(15)孔径能够随不同的样品体积而更换，测试单链DNA分子(基因)的孔径 为丄；！！！^孔厚。^!!!!!。出样通道(14)与进样通道(12)的结构、尺寸大小相同。最后，如图3所示，信息分析系统将采集系统传递来的信息精确地传递给信息显 示系统，后者经过系统快速分析后，将检测信号转化成分析样品DNA分子组成成分核苷酸 的排列顺序。以上叙述的仅是本发明示范性实施举例，根据本发明的基本精神和方法，测试仪 系统的结构组成，可以有多种变化和组合，它们由本发明的权利要求书加以限定。
权利要求
一种快速分析单分子的纳米孔测试仪，包括样品操纵系统和信号处理系统，其特征在于样品操纵系统用于引导被分析样品无纠缠、伸展开、匀速地穿越纳米孔通道系统，其包括微纳米孔通道系统和动态检测调控系统；信号处理系统包括信号采集系统、信号分析系统和计算机显示系统，微纳米孔通道系统由高绝缘材料制作而成，其对单个分析样品进行选择，并保证分析样品无缠绕、匀速地进出并穿越整个通道；信号采集系统用于实时收集样品在外力作用下流经通道系统时引起的通道阻塞效应信号；信号分析系统用于接收信号采集系统采集到的信号，进行数据整理，同时，接收动态检测调控系统检测到的样品输运信息，根据分析结果，将信息反馈给动态检测调控系统；计算机显示系统根据信号分析系统传递的信息，结合生物物理数学模型，确定分析样品的特定性质；动态检测调控系统接受信号采集系统采集到的样品输运信息，根据信号分析系统的分析结果，控制样品的运动方向和速度。
2.根据权利要求1所述的快速分析单分子纳米孔测试仪，其特征在于微纳米孔通道 系统采用了 “T”字形结构的两段样品进出通道、在初始进样通道内沉积有选择单分子的多 个检测调控电极，通道内设置有调整样品运动方向的电极。
3.根据权利要求2所述的快速分析单分子纳米孔测试仪，其特征在于微纳米孔通道 系统包括有样品储蓄池，样品回收池，初始进样通道，进样通道，辅助出样通道，出样通道， 选择单个DNA分子以及检测和调控样品输运状态的电极和纳米孔。
4.根据权利要求3所述的快速分析单分子纳米孔测试仪，其特征在于微纳米孔通道 系统包括有孔径可小至1. 5纳米、孔深至单原子级的纳米孔。
5.根据权利要求3所述的快速分析单分子纳米孔测试仪，其特征在于微纳米孔通道 系统中集成有多组电极。
6.根据权利要求5所述的快速分析单分子纳米孔测试仪，其特征在于在通道系统的 分叉路口设置有用于探测分析样品的运动位置和引导样品运动方向的电极。
7.根据权利要求3所述的快速分析单分子纳米孔测试仪，其特征在于使用软件控制 多电极配合组对。
8.根据权利要求1所述的快速分析单分子纳米孔测试仪，其特征在于纳米孔检测仪 系统的样品动态检测与调控系统采用集成电路芯片实现。
9.根据权利要求1所述的快速分析单分子纳米孔测试仪，其特征在于纳米孔检测仪 的信号采集部分采用精密微电流测试仪。
10.根据权利要求1所述的快速分析单分子纳米孔测试仪，其特征在于动态检测调控 系统、信号采集系统、信号分析系统和计算机显示系统为模块化集成式结构，各模块通过软 件控制实现功能联动。
全文摘要
本发明公开了一种快速分析单分子的纳米孔测试仪，其包括样品操纵系统和信号处理系统，样品操纵系统用于引导被分析样品无纠缠、伸展开、匀速地穿越纳米孔通道系统，其包括微纳米孔通道系统和动态检测调控系统；信号处理系统包括信号采集系统、信号分析系统和计算机显示系统。本发明所提供的纳米孔检测仪能够应用于基因的超快速测序、用于生物单分子的筛选、分离、计数，能够用于纳米量级大小的药物分子的筛选和分析。
文档编号G01N27/416GK101799447SQ201010100860
公开日2010年8月11日 申请日期2010年1月25日 优先权日2010年1月25日
发明者任兆玉, 王凯歌, 白晋涛, 贺庆丽, 高爱华 申请人:西北大学