一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件的制作方法
【专利摘要】本发明涉及的是一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件，是一种单酶生物传感器，可以用于检测溶液中浓度极低的底物分子,可用于单分子DNA的测序。该发明属于第三代DNA测序器件。一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件，其特征在于：1）具有纳米通道的固体结构将溶液分隔为两个部分，固体结构两边的溶液通过纳米通道进行联通；2）在上述纳米通道内固定蛋白质分子或蛋白质复合物分子；3）在上述由固体结构分隔的两个溶液中分别放置电极，通过检测电极间的电流，检测通过纳米通道中蛋白质分子的电阻；4）根据通过蛋白质分子电流值的变化，确定蛋白质构象的动力学特征，获得蛋白质催化反应底物的信息。
【专利说明】一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件，是一种单酶生物传感器，可以用于检测溶液中浓度极低的底物分子，可用于单分子DNA的测序。该发明属于第三代DNA测序器件。
【背景技术】
[0002]DNA测序技术是近代生命科学发展的重要里程碑之一。近十年来，低成本、高通量DNA测序技术的出现，引起了生命这一高度复杂系统中最为庞大又最为核心的核酸序列信息爆发性地增长，使生命科学和医学发展面临了前所未有的机遇和挑战，生命遗传密码的彻底破译即将成为可能，遗传信息大数据的普及将正在惠及到人类社会每一个普通成员的生存和健康。
[0003]现在正在大量使用的新一代DNA测序技术是所谓的第二代测序技术。该测序技术通过对被测目标核酸进行平行扩增，构建测序文库，克隆出上百万种固相化单链核酸片段模板，进行高通量并行序列测定。第二代测序技术还存在下列不足。(I )DNA测序文库制备需要较大量的起始DNA样本；(2 )样本的平行扩增还可能导致测序文库制备的偏性。(3 )制备测序文库需要大量的分子生物学操作，文库制备时间较长，成本高；(4)通过DNA生物合成反应在DNA测序模板上进行逐个碱基阅读,一次生化反应仅能阅读一个碱基,这也导致了测序速度和通量提升的瓶颈。因此虽然第二代测序技术比第一代的桑格测序技术在测序通量方面取得了巨大成功，在不到十年时间内使人类个体基因组的测序成本下降了近万倍。但是与未来的需求相比，第二代测序技术仍然是一项昂贵的技术，不利于推广应用；同时它还存在测序结果报告周期长，测序的准确性还不高，读长较短以及测序偏性等问题。
[0004]目前第三代测序技术成为国际学术界和产业界追捧的对象。第三代测序技术有如下三个特点:(I)实现单分子DNA测序。无需对测序对象进行扩增和放大，能够克服由基因扩增引起的测序偏向性；(2)实现连续测序。也就是DNA链上碱基的阅读是不间断的，这一特性不仅能够大幅度提高测序速度，也会使DNA的读长大幅度增加；(3)更低的测序成本。因为三代测序技术在测序反应中无需不断加入生化试剂，在DNA测序过程中没有试剂成本。由上述三个特征可以看出，第三代测序技术的实现将会是生命科学和医学发展史上的又一重要里程碑，人们可以随时随地、实时、低成本地获取人体、环境的各种各样的核酸信息，随时掌控生命体中遗传与变异、表达与调控、感染和防卫等事件，实现4P和精准的医疗。
[0005]到目前为止，第三代测序技术的原理可以分为三类。
[0006](I)成像测序法
通过高分辨率成像技术进行核酸序列的鉴定，应该是最早报导的单分子DNA测序技术。早在1977年Cole等通过锇等配位化合物与核酸上的碱基进行特异性结合，电子显微镜上观察到Os点阵，获得了单链DNA的影像。近二十多年来，有许多关于用扫描探针显微镜对核酸分子进行显微成像和碱基识别的报导，不过其识别的准确性和速度还远远达不到DNA测序的要求。
[0007](2)合成测序法
本世纪初，美国加州理工就发表了单分子合成测序的结果。在玻璃片上构建单分子DNA测序文库，采用与可切除封闭基团的荧光标记碱基进行测序。但是该方法测序通量低、读长短、错误率高，产品成熟度差，并没有形成销售。PicB1等公司通过在核苷酸的磷酸基团上修饰荧光基团，在合成测序时能够自动切除的荧光基团，实现了单分子DNA上碱基的连续阅读。为了提高单分子荧光检测的灵敏度，其芯片采用Z波导腔。该技术能够自动快速并行地实现单分子DNA的测序，其测序速度快，读长较长，但测序成本高、通量低，准确性较差。
[0008](3)纳米孔测序法
纳米孔测序方法是单链DNA分子在电场驱动下穿过纳米尺度的微孔，通过实时检测过孔电导的变化，识别过孔DNA单链上的碱基。制备纳米孔的材料可以采用天然的或经过改造过的蛋白质分子(如α溶血素、Mps蛋白)，也可以是用微加工制备的固态纳米孔(如氮化硅、石墨烯)。生物纳米孔能够识别单个碱基，但对在单链D N A分子上碱基的准确识别还存在技术瓶颈。固态纳米孔由于孔径的可控性和稳定性、单链过孔速度、纳米孔长度等因素，尚未达DNA链单个碱基的识别能力。一些公司通过在纳米孔上构建场效应器件、引入可检测横向隧道电流的对电极、组装具有分子识别功能的分子基团、增加荧光标记分子等方法，试图提高对单碱基识别能力。
【发明内容】
[0009]本发明目的是针对上述不足之处提供一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件。
[0010]生命系统中天生存在着多种能够闻效精准识别喊基的蛋白质分子机器，把蛋白质分子机器在识别碱基时其分子构象产生的微小变化转换成电信号，并进行放大和快速测定，无疑是一种理想的测序方法。本发明就是针对固态纳米孔测序技术中过孔电流对核酸链上碱基敏感性差的问题，通过在纳米孔中固定DNA聚合酶或RNA聚合酶或核酸外切酶等单个蛋白质分子，提高过孔电流对单链核酸上碱基的识别能力，发展一种低成本、快速DNA测序器件。
[0011]本发明一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件是采取以下技术方案实现: 一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件，
I)具有纳米通道的固体结构将溶液分隔为两个部分，固体结构两边的溶液通过纳米通道进行联通；
2)在上述纳米通道内固定蛋白质分子或蛋白质复合物分子；
3)在上述由固体结构分隔的两个溶液中分别放置电极，通过检测电极间的电流，获得通过纳米通道中蛋白质分子的电阻；
4)根据通过蛋白质分子电流值的变化，确定蛋白质构象的动力学特征，获得蛋白质催化反应底物的信息。
[0012]所述的固体结构为纳米孔芯片。
[0013]所述的纳米通道是指在氮化硅薄膜材料上制备的纳米孔，各种纳米管材料等。
[0014]所述的在纳米通道内固定蛋白质分子或蛋白质复合物分子为DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶等。
本发明提出了一种能够对长片段单链DNA模板进行快速、低成本地测序的方法。当生物酶在与底物反应时其构象涨落的动力学特性会产生微小变化，这种由水合蛋白质构象涨落现象可引起单个蛋白质电特性的微小变化。对于DNA聚合酶，当四种不同碱基沿单链DNA模板进行合成时DNA聚合酶的构象会因被合成碱基的种类产生微小的差异，并引起相应的电导率的差异。因此通过检测在溶液中单个DNA聚合酶电导率的测定，实现单分子DNA的合成测序。
[0015]本发明提出一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件，通过检测溶液中单个蛋白质分子的电导率来表征其构象在溶液中涨落的动力学特征，从而检测蛋白质的活性及其与底物分子的生化反应过程。该器件将DNA聚合酶等蛋白质分子对DNA上碱基识别的特异性和纳米孔器件微小过孔电流的检测技术相结合，通过将功能蛋白质分子组装在纳米孔中，在纳米孔两边的溶液中放置电化学电极，检测通过纳米孔的电流，构建成单个蛋白质分子的电子器件。通过检测DNA聚合酶在合成测序时电导率的变化，实现单分子DNA序列上四种碱基检测。
[0016]当生物酶与底物结合和反应时其蛋白质构象涨落的动力学特性将产生微小的变化，并引起纳米孔过孔电流的变化，实现单个蛋白质分子的活性和生化反应过程。
[0017]作为一种极具发展潜力的第三代DNA测序方法，蛋白质分子电子器件具有第三代测序技术应具备的全部潜力。即无需制备特殊的DNA测序文库，无需对核酸进行标记，可进行超长、连续、快速、精准的碱基阅读、可制备成高通量平行的分子器件，可实现超低成本的DNA测序等等。
[0018]有益效果:本发明具有以下优点:
(1)本发明将单个蛋白质分子固定于纳米孔中，通过检测纳米孔的过孔电流的变化来检测蛋白质的电导率。这种利用蛋白质分子在催化底物反应中构象变化引起的单分子导电特性的变化，实现核苷等单分子底物生化反应检测的方法，可直接对单链核酸分子进行测序，无需对测序对象进行扩增和放大，能够克服由基因扩增引起的测序偏向性。如果采用RNA聚合酶，则可直接对RNA链进行测序，无需对RNA进行逆转录；
(2)本发明提出的蛋白质分子电子器件，单个DNA聚合酶或RNA聚合酶分子的电特性检测是在DNA或RNA合成过程中同时实现的。也就是通过纳米孔结构我们可以实时检测核酸聚合酶的每个单体核苷酸的合成过程。因此，该器件可以实现连续、不间断的测序。这一特性不仅能够大幅度提高测序速度，也会使DNA的读长大幅度增加；
(3)本发明提出的蛋白质分子电子器件，在测序过程中除了一次性加入普通核苷酸单体(四种dNTP)外，无需加入其他生化试剂，在DNA测序过程中基本上没有试剂的成本。
[0019](4)本发明提出的蛋白质分子电子器件还可以作为研究单个生物酶活性的研究平台，目前还没有任何方法研究单个酶分子在生化反应过程中的动力学行为，同时，通过固定不同的生物酶蛋白，可以检测相应的底物分子，用于超高灵敏度的生物传感器，可以为极微量底物浓度检测方面提供新的技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]以下将结合附图对本发明作进一步说明:
图1是本发明一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件的结构示意图。
【具体实施方式】
[0021]参照附图1，一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件，
I)具有纳米通道I的固体结构4将溶液槽5中溶液2分隔为两个部分，固体结构4两边的溶液2通过纳米通道I进行联通；
2)在上述纳米通道I内固定蛋白质分子或蛋白质复合物分子6；
3)在上述由固体结构4分隔的两个溶液2中分别放置电极3，通过检测电极3间的电流，检测通过纳米通道中蛋白质分子6的电阻；
4)根据通过蛋白质分子6电流值的变化，确定蛋白质构象的动力学特征，获得蛋白质催化反应底物的信息。
[0022]所述的固体结构4为纳米孔芯片。
[0023]所述的纳米通道I是指在氮化硅薄膜材料上制备的纳米孔1，各种纳米管材料等。
[0024]所述的在纳米通道I内固定蛋白质分子或蛋白质复合物分子6为DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶等。
一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件，其工作原理是通过检测溶液中单个蛋白质分子的电导率来表征其构象在溶液中涨落的动力学特征，从而检测蛋白质的活性及其与底物分子的生化反应过程。本发明将单个蛋白质分子固定于纳米孔中，通过检测纳米孔的过孔电流的变化来检测蛋白质的电导率。当生物酶与底物结合和反应时其蛋白质构象涨落的动力学特性将产生微小的变化，并引起纳米孔过孔电流的变化，实现单个蛋白质分子的活性和生化反应过程的监控。通过检测DNA聚合酶在合成测序时导电率的变化，实现单分子DNA序列上四种碱基检测。本发明对长片段单链DNA模板进行快速、低成本地测序。
[0025]以下将结合实施方案对本发明作进一步说明:
实施方案一:基于纳米孔结构的DNA聚合酶分子电子器件
(I)纳米孔芯片的制备:利用光刻，干法刻蚀，湿法刻蚀，反应离子束刻蚀等一系列微纳加工手段制备得到尺寸为2微米，厚度为几十纳米的Si/Si02/SiN悬空支撑膜结构。其中，S1Jt为绝缘缓冲层，起到支撑SiN膜，减少电学测量中电容效应的作用。Si主要起支撑S12作用。后利用300kV的高能聚焦电子束(TEM)在悬空膜中心加工直径小于10纳米的纳米孔。加工指标:纳米孔直径:小于10纳米；厚度:在50纳米左右。
[0026](2)将自制的纳米孔表面进行氨基修饰。具体加工流程为:将自制的纳米孔芯片进行等离子体处理3分钟，在双功能基团的PEG分子水溶液/乙醇溶液中浸泡5小时；去离子水浸泡5 min ;自然干燥或氮气吹干；室温避光反应4-6 hr ;去离子水浸泡30 min。
[0027](3)将修饰后的纳米孔固定在一个微型溶液槽中，将溶液槽分隔成两部分。纳米孔的大小在10纳米左右。在溶液槽两边分别注入PBS溶液，通过纳米孔将分隔后的溶液槽联通。
[0028](4)在溶液槽的两边的溶液中分别放置一个钼丝电极，构建通过蛋白质分子的电学回路。微弱信号检测平台包括:微电极固定台、微小电信号检测屏蔽箱、微电流放大器、微小信号发生器、高性能电化学工作站等。
[0029](5)将I微升DNA聚合酶(I微摩/升)滴入纳米孔正极一边的溶液中，通过在两边溶液加上0.1伏的电压，同时监测过孔电流。当DNA聚合酶被纳米孔捕获并固定在纳米孔内时，过孔电流从I纳安降低到0.01纳安左右，电流的波动值在0.1纳安左右。
[0030](6)在加入DNA聚合酶溶液的另一边，也就是负极一边的溶液中加入适量的DNA模板序列和引物，同时监测纳米孔的过孔电流。当加入DNA模板序列和引物后，过孔电流的波动值在0.02纳安左右。
[0031](7)在负极一边的溶液中相应的四种dNTP，在DNA聚合酶合成时监测纳米孔的过孔电流。DNA合成速度约为I至10微秒/碱基。过孔电流的波动值可以表示DNA聚合酶合成碱基种类。根据过孔电流的大小可以鉴别对应合成的碱基。
[0032](8)记录蛋白质分子电子器件的过孔电流的波动谱，就可以分析DNA模板的序列。
[0033]实施方案二:基于纳米孔结构的RNA聚合酶分子电子器件
(I)纳米孔芯片的制备:利用光刻，干法刻蚀，湿法刻蚀，反应离子束刻蚀等一系列微纳加工手段制备得到尺寸为2微米，厚度为几十纳米的Si/Si02/SiN悬空支撑膜结构。其中，S1Jt为绝缘缓冲层，起到支撑SiN膜，减少电学测量中电容效应的作用。Si主要起支撑S12作用。后利用300kV的高能聚焦电子束(TEM)在悬空膜中心加工直径小于10纳米的纳米孔。加工指标:纳米孔直径:小于10纳米；厚度:在50纳米左右。
[0034](2)将自制的纳米孔表面进行氨基修饰。具体加工流程为:将自制的纳米孔芯片进行等离子体处理3分钟，在双功能基团的PEG分子水溶液/乙醇溶液中浸泡5小时；去离子水浸泡5分钟；自然干燥或氮气吹干；室温避光反应4至6小时；去离子水浸泡30分钟。
[0035]( 3 )将修饰后的纳米孔芯片固定在一个微型溶液槽中，将溶液槽分隔成两部分。纳米孔的大小在10纳米左右。在溶液槽两边分别注入PBS溶液，通过纳米孔将分隔后的溶液槽联通。
[0036](4)在溶液槽的两边的溶液中分别放置一个钼丝电极，构建通过蛋白质分子的电学回路。微弱信号检测平台包括:微电极固定台、微小电信号检测屏蔽箱、微电流放大器、微小信号发生器、高性能电化学工作站等。
[0037](5)将I微升RNA聚合酶(I微摩/升)滴入纳米孔正极一边的溶液中，通过在两边溶液加上0.1伏的电压，同时监测过孔电流。当RNA聚合酶被纳米孔捕获并固定在纳米孔内时，过孔电流从I纳安降低到0.01纳安左右，电流的波动值在0.1纳安左右。
[0038](6)在加入R N A聚合酶溶液的另一边，也就是负极一边的溶液中加入适量的RNA模板序列和引物，同时监测纳米孔的过孔电流。当加入RNA模板序列和引物后，过孔电流的波动值在0.02纳安左右。
[0039](7)在负极一边的溶液中相应的四种dNTP，在RNA聚合酶合成时监测纳米孔的过孔电流。DNA合成速度约为I至10微秒/碱基。过孔电流的波动值可以表示R N A聚合酶合成碱基种类。根据过孔电流的大小可以鉴别对应合成的碱基。
[0040](8)记录蛋白质分子电子器件的过孔电流的波动谱，就可以分析R N A模板的序列。
[0041]实施方案三:基于纳米孔结构的脲酶分子电子器件
(I)纳米孔芯片的制备:利用光刻，干法刻蚀，湿法刻蚀，反应离子束刻蚀等一系列微纳加工手段制备得到尺寸为2微米，厚度为几十纳米的Si/Si02/SiN悬空支撑膜结构。其中，S1Jt为绝缘缓冲层，起到支撑SiN膜，减少电学测量中电容效应的作用。Si主要起支撑S12作用。后利用300kV的高能聚焦电子束(TEM)在悬空膜中心加工直径小于10纳米的纳米孔。加工指标:纳米孔直径:小于10纳米；厚度:在50纳米左右。
[0042](2)将自制的纳米孔表面进行氨基修饰。具体加工流程为:将自制的纳米孔芯片进行等离子体处理3分钟，在双功能基团的PEG分子水溶液/乙醇溶液中浸泡5小时；去离子水浸泡5 min ;自然干燥或氮气吹干；室温避光反应4 - 6 hr ;去离子水浸泡30 min。
[0043]( 3 )将修饰后的纳米孔芯片固定在一个微型溶液槽中，将溶液槽分隔成两部分。纳米孔的大小在10纳米左右。在溶液槽两边分别注入PBS溶液，通过纳米孔将分隔后的溶液槽联通。
[0044](4)在溶液槽的两边的溶液中分别放置一个钼丝电极，构建通过蛋白质分子的电学回路。微弱信号检测平台包括:微电极固定台、微小电信号检测屏蔽箱、微电流放大器、微小信号发生器、高性能电化学工作站等。
[0045](5)将I微升脲酶(I微摩/升)滴入纳米孔正极一边的溶液中，通过在两边溶液加上0.1伏的电压，同时监测过孔电流。当DNA聚合酶被纳米孔捕获并固定在纳米孔内时，过孔电流从I纳安降低到0.01纳安左右，电流的波动值在0.1纳安左右。
[0046]在加入脲酶溶液的另一边，也就是负极一边的溶液中加入适量的尿素，同时监测纳米孔的过孔电流。当加入尿素溶液后，过孔电流开始增大，并随着尿素浓度的增加和增力口。根据过孔电流的值，可以对溶液中尿素浓度进行检测，灵敏度可达到飞摩尔级的水平。
【权利要求】
1.一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件，其特征在于: 1)具有纳米通道的固体结构将溶液分隔为两个部分，固体结构两边的溶液通过纳米通道进行联通； 2)在上述纳米通道内固定蛋白质分子或蛋白质复合物分子； 3)在上述由固体结构分隔的两个溶液中分别放置电极，通过检测电极间的电流，检测通过纳米通道中蛋白质分子的电阻； 4)根据通过蛋白质分子电流值的变化，确定蛋白质构象的动力学特征，获得蛋白质催化反应底物的信息。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件，其特征在于:所述的固体结构为纳米孔芯片。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件，其特征在于:所述的纳米通道是指在氮化硅薄膜材料上制备的纳米孔，各种纳米管材料。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件，其特征在于:所述的在纳米通道内固定蛋白质分子或蛋白质复合物分子为DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶。
【文档编号】C12M1/34GK104312914SQ201410570031
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】陆祖宏, 李清宁, 赵清, 贾忠伟, 万成, 康玉麟, 丁韬力 申请人:北京大学