本发明属于小麦蛋白加工技术领域，具体涉及一种食品级谷氨酰胺酶脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法。
背景技术：
小麦面筋蛋白俗称谷朊粉，是生产小麦淀粉时的副产品。小麦面筋蛋白来源丰富，营养价值高，应用范围广，具有较高的经济价值。由于小麦面筋蛋白其本身有一个缺点，即低溶解性。而控制溶解度的最主要因素是电荷率（chargefrequeney）和疏水性（hydrophobicity）。脱酰胺改性可以改变蛋白质电荷分布状态，使蛋白质分子空间结构得到伸展，改善其疏水性，最终增大蛋白质的溶解性，使蛋白质获得良好的功能特性，从而拓宽它的应用范围。
matsudomi指出脱酰胺改性是改变小麦面筋蛋白溶解性和表面特性的最有前景的方法。目前，蛋白质脱酰胺改性的方法主要有非酶法、酶法、混合脱酰胺法。蛋白质的非酶法脱酰胺改性包括物理法和化学法，其中，物理法可分为湿热法和双螺杆挤压法，化学法有温和酸、碱、盐改性。目前报道中用于酶法脱酰胺的酶主要有转谷氨酰胺酶（tg酶）、蛋白酶、肽谷氨酰胺酶和谷氨酰胺酶（pg酶）。最初利用转谷氨酰胺酶（tg酶）、蛋白酶以及肽谷氨酰胺酶来进行脱酰胺，在使蛋白质发生脱酰胺反应的同时也会产生一些副作用，而pg酶脱酰胺改性较其他酶脱酰胺改性方法在专一性、温和性以及安全性等方面更具有优势。
近几年，国内外学者采用蛋白质谷氨酰胺酶对蛋白质进行脱酰胺改性处理，其中研究最多的蛋白质是大豆蛋白、燕麦蛋白、米谷蛋白、小麦面筋蛋白、玉米蛋白等植物蛋白。inthawootsuppavorasatit等人采用蛋白质谷氨酰胺酶（amano500）对大豆蛋白进行脱酰胺处理，并研究了对其功能性质的影响；zhong-qingjiang等人研究了食品级蛋白质谷氨酰胺酶（amano50）对燕麦蛋白溶解性及乳化性的影响；yiehuiyong等人研究了蛋白质谷氨酰胺酶（从chryseobacteriumproteolyticum中提纯）对α-玉米蛋白结构及功能性质的影响；n.miwa等人采用从chryseobacteriumproteolyticum中提纯的蛋白质谷氨酰胺酶研究其对脱脂牛奶蛋白理化性质及功能性质的影响。在对蛋白质进行谷氨酰胺酶脱酰胺处理的研究中，蛋白质谷氨酰胺酶的来源大致有三种：一种是利用产谷氨酰胺酶的微生物（如chryseobacteriumproteolyticum）提取、纯化得到自制谷氨酰胺酶，该法得到的谷氨酰胺酶成分及酶活性具有一定的不稳定性，对提取工艺要求较高；第二种是购买分析纯级别的商品酶（如sigma公司的蛋白质谷氨酰胺酶），该酶价格昂贵，不适用于大规模工厂化应用；第三种是购买食品级蛋白酶谷氨酰胺酶，相比于分析纯蛋白质谷氨酰胺商品酶，食品级蛋白质谷氨酰胺酶成本大幅降低，对于工业化生产应用具有重要的意义。而目前采用食品级蛋白质谷氨酰胺酶对小麦面筋蛋白进行脱酰胺改性处理的相关研究鲜有人报道。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法，包括下列步骤：
第一步：制备蛋白质分散液
将小麦面筋蛋白分散于磷酸盐缓冲液中得到质量体积比为3~12%的小麦面筋蛋白悬浮液；
第二步：脱酰胺反应
向所述小麦面筋蛋白分散液中加入食品级谷氨酰胺酶进行脱酰胺处理，然后冷却得到小麦面筋蛋白脱酰胺处理液；
第三步：透析
所述小麦面筋蛋白脱酰胺处理液在醋酸溶液中透析以去除盐离子得到小麦面筋蛋白脱酰胺纯化液；
第四步：冻干
对所述小麦面筋蛋白脱酰胺纯化液进行真空冷冻干燥得到脱酰胺改性小麦面筋蛋白。
优选的技术方案为：在第二步中，所述脱酰胺处理在ph值为中性条件下进行，所述冷却是在冰浴中进行10-15min。
优选的技术方案为：在第二步中，所述酶食品级谷氨酰胺酶与小麦面筋蛋白比为10u/g-40u/g。
优选的技术方案为：所述透析在0.1m的醋酸溶液中进行，4℃下透析12h，每2h更换一次所述醋酸溶液。
优选的技术方案为：在第二步中，所述脱酰胺处理的温度条件为30-60℃，所述脱酰胺处理在摇床上进行，所述摇床的转速为80rpm-110rpm，所述脱酰胺处理的反应时间为6-30h。
优选的技术方案为：在第一步中，于搅拌条件下将小麦面筋蛋白分散于磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的浓度为200mmol/l，所述搅拌的时间为20-30min。
优选的技术方案为：在第四步中，所述真空冷冻干燥的条件为：温度为-55℃，真空度为42pa，干燥时间为30h。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明工艺采用的原料系小麦面筋蛋白，其是生产小麦淀粉时的副产物，来源广泛，价格低廉，是一种营养丰富、食用安全的植物蛋白源。
2、本发明采用食品级的蛋白质谷氨酰胺酶对小麦面筋蛋白进行脱酰胺处理，相比较其他酶，在保证谷氨酰胺酶脱酰胺效果的前提下，降低了成本，加速了小麦面筋蛋白在食品领域的工业化生产应用。
3、现有技术对小麦面筋蛋白脱酰胺改性多采用物化方法，存在物理改性方法改性效果不显著；化学改性方法反应条件剧烈，较难控制，且产物不安全等问题，谷氨酰胺酶较其他酶脱酰胺改性方法在专一性、温和性以及安全性等方面更具有优势。
4、本发明的方法采用冰浴冷却10-15min以抑制pg酶活性，与传统方法相比使蛋白变性程度最低化。
5、蛋白质谷氨酰胺酶脱酰胺使小麦面筋蛋白结构变松散，隐藏在蛋白质分子内部的疏水区域暴露，蛋白质结构变得更加灵活，表面疏水性显著增加。
6、本方法得到的小麦面筋蛋白产品，溶解度显著提高，在中性条件下脱酰胺处理18h小麦面筋蛋白样品溶解度达到27.27%，是原始未处理小麦面筋蛋白样品溶解度的3倍（原始未处理小麦面筋蛋白样品溶解度为9%）。
7、本方法得到的小麦面筋蛋白产品，表面疏水性得到显著改善，脱酰胺处理24h时表面疏水性是未处理样品的3倍，是空白组的2.3倍（其中脱酰胺处理24h样品表面疏水性为362.9，未处理空白组样品表面疏水性为121.8，对照组样品表面疏水性为158）。
8、整个工艺操作简单，易于掌握，对设备要求较低，易于产业化生产。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
本发明的检测方法包括：
1、脱酰胺度的测定：微量弥散皿法
样品完全脱酰胺产生的氨的含量：准确称取0.5g小麦面筋蛋白置于水解管中，再向其加入5ml的2mol/l的hcl，抽真空密封，在115℃-121℃条件下水解4h，水解完后取出冷却，打开玻璃管，用20g/l的硼酸吸收氮并测定酰胺氮含量。
样品脱酰胺过程中产生的氨的含量：在康威氏扩散皿的中央加入3ml的20g/l的硼酸并滴加10滴左右溴甲酚蓝-甲基红综合指示剂，皿外围加入1ml蛋白样品，皿边缘均匀涂抹凡士林，盖上玻璃盖，并留有一定空隙，通过留出的空隙向已加入样品的皿外围加入饱和naoh溶液3ml，随后立即封上玻璃盖避免漏气，在室温下放置12h后，用0.02m的hcl滴定至混合指示剂终点。
2、溶解度的测定：福林酚试剂法
准确称取冻干的小麦面筋蛋白样品1mg置于微型离心管中，分散于1ml不同ph值的缓冲液中（10mmol/l，ph=3的醋酸盐缓冲液；10mmol/l，ph=5的醋酸盐缓冲液；10mmol/l，ph=7的磷酸盐缓冲液），每组样品溶液均置于20℃条件下过夜，之后于10℃，3000rpm条件下离心10min，收集可溶部分，对上清液中的蛋白含量采用福林酚法进行测定。
福林酚试剂法样品测定：取1ml样品溶液加入5ml试剂甲混匀，于20-25℃放置10min，再加0.5ml试剂乙，立即摇匀，在20-25℃保温30min，然后于500nm波长处比色，以1ml蒸馏水代替样品做空白对照。
3、水解度的测定：甲醛滴定法
分别取2ml经改性后的小麦面筋蛋白水解液于3个标有号码的100ml三角瓶中，分别加入5ml蒸馏水及1%酚酞溶液3滴，摇匀。用0.1mol/lnaoh溶液滴定第三号瓶内溶液至呈微红色，作为终点标准并记下读数v2，向第一和第二号瓶内分别加入2ml中性甲醛溶液混匀，再用标准naoh溶液滴定至和三号瓶内溶液颜色相同为止，记下读数，求出平均值v1，按下式计算水解度。
游离氨基氮（mg/ml）=nnaoh×(v1-v2)×14/2
水解程度dh（%）=游离氨基氮×上清液体积×10-3/（样品量×总含氮量）×100%
表面疏水性的测定：准确称取400mg的pg酶处理小麦面筋蛋白样品分散于15ml的10mmol/lph=7的磷酸盐缓冲液中，于8000rpm，15℃条件下离心10min，上清液蛋白浓度由考马斯亮蓝法测得。将上清液稀释到几个不同的浓度梯度（1倍、0.75倍、0.5倍、0.25倍、0.125倍），再取40µlans试剂（8mmol/l）加到4ml的蛋白质溶液中，选择激发波长365nm，发射波长484nm，以荧光强度对蛋白质浓度做曲线，将曲线的最开始斜率定义为被检测样品的表面疏水度。
4、上清液蛋白浓度的测定：考马斯亮蓝法
吸取样品溶液1ml放入试管中，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，放置3min左右，等反应完成后，在595nm处测定吸光度值，通过牛血清蛋白标准曲线得到样品溶液蛋白质含量。
实施例一：一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法
称取一定量的小麦面筋蛋白，边搅拌边加入盛有磷酸盐缓冲液（200mmol/l，ph=7）的反应器中，配制成浓度为7%（w/v）的小麦面筋蛋白液，搅拌30min后形成蛋白悬浮液，加入食品级pg酶搅拌形成酶与底物比e/s=10u/g的体系，置于摇床中，转速80rpm，于40℃脱酰胺改性反应12h，反应结束后立即冰浴冷却10min，pg酶处理液经0.1m醋酸溶液透析12h，每2h更换一次透析液，真空冷冻干燥得到脱酰胺改性小麦面筋蛋白样品。
真空冷冻干燥条件为：-55℃，真空度42pa，干燥时间为30h。
检测脱酰胺改性小麦面筋蛋白的脱酰胺度为52.48%，水解度为3.64%。
实施例二：一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法
称取一定量的小麦面筋蛋白，边搅拌边加入盛有磷酸盐缓冲液（200mmol/l，ph=7）的反应器中，配制成浓度为5%（w/v）的小麦面筋蛋白液，搅拌20min后形成蛋白悬浮液，加入食品级pg酶搅拌形成酶与底物比e/s=40u/g的体系，置于摇床中，转速80rpm，于40℃脱酰胺改性反应30h，反应结束后冰浴冷却10min，pg酶处理液经0.1m醋酸溶液透析12h，每2h更换一次透析液，真空冷冻干燥得到脱酰胺改性小麦面筋蛋白。
真空冷冻干燥条件同实施例1。
检测脱酰胺改性小麦面筋蛋白的脱酰胺度为53.40%，水解度为8.34%。
实施例三：一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法
称取一定量的小麦面筋蛋白，边搅拌边加入盛有磷酸盐缓冲液（200mmol/l，ph=7）的反应器中，配制成浓度为5%（w/v）的小麦面筋蛋白液，搅拌20min后形成蛋白悬浮液，加入食品级pg酶搅拌形成酶与底物比e/s=20u/g的体系，置于摇床中，转速110rpm，于40℃条件脱酰胺改性反应12h，反应结束后冰浴冷却15min，pg酶处理液经0.1m醋酸溶液透析12h，每2h更换一次透析液，真空冷冻干燥得到脱酰胺改性小麦面筋蛋白。
真空冷冻干燥条件同实施例1。
检测脱酰胺改性小麦面筋蛋白的脱酰胺度为29.59%，水解度为3.20%。
实施例四：一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法
称取一定量的小麦面筋蛋白，边搅拌边加入盛有磷酸盐缓冲液（200mmol/l，ph=7）的反应器中，配制成浓度为12%（w/v）的小麦面筋蛋白液，搅拌30min后形成蛋白悬浮液，加入食品级pg酶搅拌形成酶与底物比e/s=10u/g的体系，置于摇床中，转速110rpm，于40℃条件脱酰胺改性反应1h，反应结束后冰浴冷却10min，pg酶处理液经0.1m醋酸溶液透析12h，每2h更换一次透析液，真空冷冻干燥得到脱酰胺改性小麦面筋蛋白。
真空冷冻干燥条件同实施例1。
检测脱酰胺改性小麦面筋蛋白的脱酰胺度为15.97%，水解度为1.79%。
实施例五：一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法
称取一定量的小麦面筋蛋白，边搅拌边加入盛有磷酸盐缓冲液（200mmol/l，ph=7）的反应器中，配制成浓度为7%（w/v）的小麦面筋蛋白液，搅拌20min后形成蛋白悬浮液，加入食品级pg酶搅拌形成酶与底物比e/s=10u/g的体系，置于摇床中，转速80rpm，于60℃条件脱酰胺改性反应12h，反应结束后冰浴冷却15min，pg酶处理液经0.1m醋酸溶液透析12h，每2h更换一次透析液，真空冷冻干燥得到脱酰胺改性小麦面筋蛋白。
真空冷冻干燥条件同实施例1。
检测脱酰胺改性小麦面筋蛋白的脱酰胺度为78.40%，水解度为7.28%。
实施例六：一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法
称取一定量的小麦面筋蛋白，边搅拌边加入盛有磷酸盐缓冲液（200mmol/l，ph=7）的反应器中，配制成浓度为7%（w/v）的小麦面筋蛋白液，搅拌20min后形成蛋白悬浮液，加入食品级pg酶搅拌形成酶与底物比e/s=10u/g的体系，置于摇床中，转速80rpm，于30℃条件脱酰胺改性反应12h，反应结束后冰浴冷却10min，pg酶处理液经0.1m醋酸溶液透析12h，每2h更换一次透析液，真空冷冻干燥得到脱酰胺改性小麦面筋蛋白。
真空冷冻干燥条件同实施例1。
检测脱酰胺改性小麦面筋蛋白的脱酰胺度为38.71%，水解度为1.49%。
实施例七：一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法
称取一定量的小麦面筋蛋白，边搅拌边加入盛有磷酸盐缓冲液（200mmol/l，ph=7）的反应器中，配制成浓度为5%（w/v）的小麦面筋蛋白液，搅拌30min后形成蛋白悬浮液，加入食品级pg酶搅拌形成酶与底物比e/s=20u/g的体系，置于摇床中，转速110rpm，于40℃条件脱酰胺改性反应24h，反应结束后冰浴冷却15min，pg酶处理液经0.1m醋酸溶液透析12h，每2h更换一次透析液，真空冷冻干燥得到脱酰胺改性小麦面筋蛋白。
真空冷冻干燥条件同实施例1。
检测脱酰胺改性小麦面筋蛋白的脱酰胺度为41.84%，水解度为7.23%，表面疏水性为362.9（其中原始未处理小麦面筋蛋白表面疏水性为121.8，对照组小麦面筋蛋白样品表面疏水性为158）。
实施例八：一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法
称取一定量的小麦面筋蛋白，边搅拌边加入盛有磷酸盐缓冲液（200mmol/l，ph=7）的反应器中，配制成浓度为5%（w/v）的小麦面筋蛋白液，搅拌30min后形成蛋白悬浮液，加入食品级pg酶搅拌形成酶与底物比e/s=20u/g的体系，置于摇床中，转速110rpm，于40℃条件脱酰胺改性反应18h，反应结束后冰浴冷却15min，pg酶处理液经0.1m醋酸溶液透析12h，每2h更换一次透析液，真空冷冻干燥得到脱酰胺改性小麦面筋蛋白。
真空冷冻干燥条件同实施例1。
检测脱酰胺改性小麦面筋蛋白的脱酰胺度为38.20%，水解度为6.67%，溶解度为27.30%，表面疏水性为374.9（其中原始未处理小麦面筋蛋白溶解度为11.43%，表面疏水性为121.8；对照组小麦面筋蛋白样品溶解度为9%，表面疏水性为158）。
实施例九：一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法
一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：制备蛋白质分散液
将小麦面筋蛋白分散于磷酸盐缓冲液中得到质量体积比为8%的小麦面筋蛋白悬浮液；
第二步：脱酰胺反应
向所述小麦面筋蛋白分散液中加入食品级谷氨酰胺酶进行脱酰胺处理，然后冷却得到小麦面筋蛋白脱酰胺处理液；
第三步：透析
所述小麦面筋蛋白脱酰胺处理液在醋酸溶液中透析以去除盐离子得到小麦面筋蛋白脱酰胺纯化液；
第四步：冻干
对所述小麦面筋蛋白脱酰胺纯化液进行真空冷冻干燥得到脱酰胺改性小麦面筋蛋白。
在第二步中，所述脱酰胺处理在ph值为中性条件下进行，所述冷却是在冰浴中进行10min。
在第二步中，所述酶食品级谷氨酰胺酶与小麦面筋蛋白比为40u/g。
4、根据权利要求1所述的脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法，其特征在于：所述透析在0.1m的醋酸溶液中进行，4℃下透析12h，每2h更换一次所述醋酸溶液。
5、根据权利要求1所述的脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法，其特征在于：在第二步中，所述脱酰胺处理的温度条件为60℃，所述脱酰胺处理在摇床上进行，所述摇床的转速为100rpm，所述脱酰胺处理的反应时间为20h。
6、根据权利要求1所述的脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法，其特征在于：在第一步中，于搅拌条件下将小麦面筋蛋白分散于磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的浓度为200mmol/l，所述搅拌的时间为25min。
7、根据权利要求1所述的脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法，其特征在于：在第四步中，所述真空冷冻干燥的条件为：温度为-55℃，真空度为42pa，干燥时间为30h。
实施例十：一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法
一种脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：制备蛋白质分散液
将小麦面筋蛋白分散于磷酸盐缓冲液中得到质量体积比为12%的小麦面筋蛋白悬浮液；
第二步：脱酰胺反应
向所述小麦面筋蛋白分散液中加入食品级谷氨酰胺酶进行脱酰胺处理，然后冷却得到小麦面筋蛋白脱酰胺处理液；
第三步：透析
所述小麦面筋蛋白脱酰胺处理液在醋酸溶液中透析以去除盐离子得到小麦面筋蛋白脱酰胺纯化液；
第四步：冻干
对所述小麦面筋蛋白脱酰胺纯化液进行真空冷冻干燥得到脱酰胺改性小麦面筋蛋白。
在第二步中，所述脱酰胺处理在ph值为中性条件下进行，所述冷却是在冰浴中进行12min。
在第二步中，所述酶食品级谷氨酰胺酶与小麦面筋蛋白比为25u/g。
所述透析在0.1m的醋酸溶液中进行，4℃下透析12h，每2h更换一次所述醋酸溶液。
在第二步中，所述脱酰胺处理的温度条件为45℃，所述脱酰胺处理在摇床上进行，所述摇床的转速为80，所述脱酰胺处理的反应时间为30h。
在第一步中，于搅拌条件下将小麦面筋蛋白分散于磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的浓度为200mmol/l，所述搅拌的时间为25min。
在第四步中，所述真空冷冻干燥的条件为：温度为-55℃，真空度为42pa，干燥时间为30h。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。