专利名称：一种检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法
技术领域：
本发明属于生物分析及传感领域，特别涉及一种基于水溶性共轭聚合物和核酸外切酶III检测脱氧核糖核酸(DNA)结合蛋白的荧光检测方法。
背景技术：
脱氧核糖核酸结合蛋白是生物蛋白组中一类能够与序列特异性的脱氧核糖核酸发生结合并且产生重要功能的蛋白质，这类蛋白质在基因调控、基因重组、基因修复等细胞过程中发挥着重要作用，目前已成为功能基因组和蛋白质组研究的重要对象；许多疾病都与细胞内脱氧核糖核酸结合蛋白的异常相关。脱氧核糖核酸结合蛋白的检测分析是研究其功能的主要手段。因此，有关检测分析脱氧核糖核酸结合蛋白的研究一直受到科学界的高度重视。目前用于研究脱氧核糖核酸与蛋白质相互作用的方法有很多，如凝胶迁移率分析法、印迹法等，虽然这些常规方法在脱氧核糖核酸结合蛋白的研究中发挥了重大的作用，但是这些技术工作量大、费时费力，并且操作过程中容易造成放射性物质污染。近年来，科学家们陆续报道了一些基于荧光染料的检测方法，如分子信标(Boon，Ε. Μ. ；Salas, J. Ε.； Barton, J. K. , Nat. Biotech. 2002, 20 (3) :282_286.)、荧光共振能量转移(Xu，X. ；Zhao, Ζ.； Qin, L. ；Wei, W. ；Levine, J. Ε. ；Mirkin C. Α.，Anal. Chem. 2008,80(14) :5616_5621·)等； 以及基于纳米金的比色检测(Ou，L. J. Jin, P. Y. ；Chu, X. Jiang, J. H. ；Yu, R. Q.，Anal. Chem. 2010，82，(14)，6015-24.)等，这些方法有效避免了放射性物质的污染，但是由于这些荧光探针需要双标记，给实验造成复杂化、分析效率低等缺陷。
发明内容
技术问题本发明要解决的技术问题是针对现有的脱氧核糖核酸结合蛋白检测方法存在的不足，提供一种核酸外切酶III辅助的，共轭聚合物荧光信号放大的脱氧核糖核酸结合蛋白检测方法，其具有较高的特异性和高灵敏度。有望在临床诊断和生物医学中针对脱氧核糖核酸结合蛋白的药物筛选提供一种新的技术。技术方案本发明为一种基于水溶性共轭聚合物和核酸外切酶III检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，运用该技术可以实现对脱氧核糖核酸结合蛋白表达和活化水平的检测分析，该技术的核心是利用水溶性共轭聚合物与荧光素标记的单、双链核酸之间不同的荧光共振能量转移效率(Huang，Y. Q. ；Liu, X. F. ；Fan, Q. L. ；Wang，L. ；Song, S. ；Wang, L. H. ；Fan, C. ；Huang, W. , Biosensors and Bioelectronics 2009,24, (10), 2973-2978.)，以及脱氧核糖核酸结合蛋白在核酸特定位点处结合使其不被核酸外切酶III 降解的技术巧妙地结合在一起，从而达到对脱氧核糖核酸结合蛋白表达和活化水平的高效分析。本发明检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法基于水溶性共轭聚合物和核酸
3
外切酶III，包括以下步骤a.制备可特异性结合蛋白质的双链脱氧核糖核酸荧光探针；b.将双链脱氧核糖核酸荧光探针与脱氧核糖核酸结合蛋白进行结合；c.用核酸外切酶III对上述复合物进行酶切；d.在上述的反应体系中加入水溶性共轭聚合物进行荧光检测。步骤a制备的双链脱氧核糖核酸荧光探针为两条碱基序列反向互补的单链核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子。所述的核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子，含有脱氧核糖核酸结合蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列。所述的核酸分子A的3'端含有5个突出的核酸碱基，以便核酸外切酶III作用于双链脱氧核糖核酸探针时，能从B的3'端开始降解。所述的核酸分子B为5'端含有荧光素标记的核苷酸。所述的步骤b将标记的双链脱氧核糖核酸探针与脱氧核糖核酸结合蛋白进行结合，是脱氧核糖核酸结合蛋白与双链脱氧核糖核酸探针间发生序列特异性识别并结合的过程。所述的步骤c用核酸外切酶III对上述复合物进行酶切，是核酸外切酶III对核酸探针分子从双链脱氧核糖核酸的3'发生降解反应，逐个释放单核苷酸的过程。所述的步骤d中的水溶性共轭聚合物的发射光谱与荧光素的吸收光谱有较好的重叠，以便发生高效的荧光共振能量转移；荧光共振能量转移效率用529nm和450nm处的荧光发射强度的比值来表示，即I529nm/I 450nm°所述的荧光发射强度，用岛津RF-5301荧光分光光度计进行检测，激发波长为 404nm，发射波长扫描范围为410_650nm。技术效果本发明所述的荧光检测方法，无需大型仪器，经过简单的三个实验步骤即可完成对核因子NF-K B蛋白的分析检测，缩短了检测时间，并且该方法具有较高的选择性和灵敏度，能在比较复杂的混合蛋白体系中灵敏的检测出目标蛋白，具有较高的分析效率。
图1是基于水溶性共轭聚合物和核酸外切酶III检测脱氧核糖核酸结合蛋白的原理示意图。图2为基于核酸外切酶III和水溶性共轭聚合物检测蛋白NF- κ B的荧光光谱图。 a为共轭聚合物的荧光光谱图；b为空白对照的荧光光谱图；(为含有靶蛋白的荧光光谱图。图3是基于核酸外切酶III和水溶性共轭聚合物的荧光检测方法对不同浓度的 NF-k B蛋白进行检测的荧光光谱图。NF-K B浓度范围为0 115nM。注解小图为不同浓度蛋白对应的荧光共振能量转移效率(I529mZI45tol)关系曲线图。
具体实施例方式运用该技术检测脱氧核糖核酸结合蛋白时，首先要依据待检测的脱氧核糖核酸结合蛋白的脱氧核糖核酸结合位点的核苷酸序列，以及本技术运用的核酸外切酶III保护分析对核酸探针结构的要求，设计含有蛋白结合位点的标记核酸探针，对脱氧核糖核酸结合蛋白进行检测时。若溶液中存在脱氧核糖核酸结合蛋白，标记的核酸探针就会与相应的脱氧核糖核酸结合蛋白发生序列特异性的结合反应，形成的“核酸探针/脱氧核糖核酸结合蛋白”复合物为核酸探针提供了空间保护，在酸外切酶III酶切时，核酸酶由于空间阻碍而不能降解核酸探针，因此在加入水溶性共轭聚合物时，会由于较强的静电作用而与共轭聚合物结合，拉近荧光基团与共轭聚合物之间的距离，使其发生高效的荧光共振能量转移；当溶液中不存在脱氧核糖核酸结合蛋白时，裸露的核酸探针会被核酸外切酶III酶切，从而使荧光基团游离出来，无法与共轭聚合物发生结合，因此二者之间的距离较远，在荧光检测时，检测不到荧光共振能量转移。运用该技术包括如下四个步骤A.制备荧光标记的双链核酸探针；B.双链核酸探针与脱氧核糖核酸结合蛋白结合；C.核酸外切酶III酶切；D.对反应体系进行荧光检测；其中步骤A制备荧光标记的核酸探针是很重要的一步，为实现对脱氧核糖核酸结合蛋白的检测分析，核酸探针应具备下列结构a)核酸探针是由两条碱基序列反向互补的单链核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子；b)核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子，含有脱氧核糖核酸结合蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列；c)核酸分子B为5'端标记有荧光素的核苷酸；核酸分子A为3'端比5'端突出 5个核酸粘性末端，核酸分子B为3'端与5'端平齐的平末端，核酸探针种类可以表现为多种形式，但是需要在核酸探针中设立一个脱氧核糖核酸结合蛋白的结合位点，因此，在设计寡核酸探针时要加入脱氧核糖核酸结合蛋白(如核因子)的结合位点。本技术中制备的核酸探针为包含核因子NF-K B(p50)结合序列 "-^^===,3的脱氧核糖核酸。有些脱氧核糖核酸结合蛋白需要在其结合序列外围设计少量的侧翼序列，才能在结合液中与相应的结合蛋白结合，并且不同的脱氧核糖核酸结合蛋白对侧翼序列长度的要求也不相同，在探针设计时，应注意在蛋白结合序列侧翼添加有效长度的侧翼序列。步骤B核酸探针与脱氧核糖核酸结合蛋白结合，是脱氧核糖核酸结合蛋白与双链探针间发生序列特异性识别并结合的过程。反应过程的结合液为10% (ν/ν)甘油，0.5% (m/v)牛血清蛋白，0. 5mM 二硫苏糖醇，IOmM Tris-HCl(pH 7. 5)。步骤C核酸外切酶III酶切，是核酸外切酶III对核酸探针分子从双链脱氧核糖核酸的3'端发生降解反应，逐个释放单核苷酸的过程，在酶切完全后需加入20mM的乙二胺四乙酸溶液终止核酸外切酶III的酶切，酶切反应的缓冲液为66mM Tris_HCl，0. 66mM MgCl2 (pH 8. 0)，37 °C 反应 5-10 分钟。步骤D对反应体系进行荧光检测，水溶性的共轭聚合物对荧光信号的放大是一个关键，水溶性阳离子型共轭聚合物的结构式如图1所示，可根据文献(Huang，Y. Q. ；Fan,
5Q. L. ；Lu, Χ. M. ；Fang, C. ；Liu, S. J. ；Yu-ffen, L. H. ；Wang, L. H. ；Huang, W. , J. Polym. Sci. Pol. Chem. 2006，44，(19)，5778-5794.)合成。该共轭聚合物与脱氧核糖核酸之间有较强的结合能力、荧光量子产率高、能与标记在脱氧核糖核酸末端的荧光素之间发生高效的荧光共振能量转移，从而使荧光素的信号得到显著的增强。本发明利用水溶性共轭聚合物优越的荧光性能，以荧光素标记双链核酸为探针，结合核酸外切酶III的酶切作用，通过检测标记的荧光素与水溶性共轭聚合物之间的荧光共振能量转移效率实现对体系中脱氧核糖核酸结合蛋白的检测。以下仅以制备荧光素标记的NF-K B核酸探针检测核因子蛋白NF-K B的实验为例，说明本发明技术的具体实施方式
。a)荧光素标记核酸探针的制备NF-κ B核酸探针A 5' -AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGCTTTTT-3‘B 3' -TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-FAM-5‘其中_为NF- κ B结合位点，FAM为荧光素。制备NF- κ B核酸探针时，将两个寡核苷酸链A和B溶液等摩尔在杂交缓冲液 (IOmM Tris-HCiaOOmM NaCl，pH 8.0)中混合，95°C保温10分钟，缓慢冷却至室温。然后用杂交液将探针溶液稀释至浓度为10yM，4°C保存备用。b)标记的核酸探针与核因子NF- κ B结合将核因子NF-K B蛋白加入到脱氧核糖核酸结合缓冲液中，37°C孵育10分钟，再加入10 μ M核酸探针，37 °C继续孵育20-30分钟。c)核酸外切酶III酶切将IOX 酶切反应液(660mM Tris_HCl，6. 6mM MgCl2, pH 8. 0)和 20U/μ 1 核酸外切酶III加入反应体系中，37°C孵育5-10分钟。d)荧光检测所用的仪器为荧光分光度计(RF-5301，日本)。荧光光谱测量条件氙灯激发，激发波长为404nm，发射波长扫描范围410 650nm ；用3mL石英比色皿进行测量，样品体积 2mL ；室温。酶切反应结束后，加入0. 4M的乙二胺四乙酸溶液终止核酸外切酶III的酶切反应，然后将其加入到含有水溶性共轭聚合物(浓度为2. 25X I(T7M)的检测缓冲液(IOmM Tris-HCiaOOmM NaCl,pH 7.5)中检测荧光。这时只有连接在脱氧核糖核酸探针末端的荧光素才能与水溶性共轭聚合物发生荧光共振能量转移，这是由于长链脱氧核糖核酸与聚合物形成静电复合物使脱氧核糖核酸上的荧光素距离很近而发生有效的荧光共振能量转移。 若荧光共振能量转移效率(I 529raZI45tJ较高，则表明待测溶液中存在NF-kB蛋白，若能量转移效率很低(I529mZI45tllJ，则表明待测溶液中不含NF- κ B蛋白。实施例1检测核因子NF- κ B蛋白。检测1 将核因子NF-KB蛋白加入脱氧核糖核酸结合缓冲液，37°C孵育10分钟， 再加入10 μ M双链核酸探针，37°C继续孵育20-30分钟。再将IOX酶切反应液和20U/ μ L 核酸外切酶III加入反应体系中，37°C孵育5-10分钟。酶切反应结束后，加入0. 4M的乙二胺四乙酸溶液终止核酸外切酶III的酶切反应，然后加入到含有水溶性共轭聚合物的检测缓冲液中，检测激发波长为404nm，发射波长为410 650nm。由于带有标记的核酸探针会与核因子蛋白NF- κ B发生序列特异性的结合反应，形成的“核酸探针/脱氧核糖核酸结合蛋白”复合物为核酸探针提供了空间保护，核酸外切酶III不能降解核酸探针，可以发生高效的荧光共振能量转移。同时，做如下试验作为对比。检测2 用等体积的脱氧核糖核酸结合缓冲液代替核因子NF-K B蛋白进行试验， 作为空白对照，其它条件与检测1中相同。检测3 用等体积的相同浓度的其他蛋白质进行试验，作为阴性对照，其他条件与检测1中相同。结果空白对照(即检测2)的荧光共振能量转移效率非常低(I529mZI45tol = 0. 4)。其他蛋白(即检测3)的荧光共振能量转移效率远低于NF- κ B的荧光共振能量转移效率(I529mZI45Clnm = 2. 2)。可见本发明对核因子NF-K B的检测具有高度的特异性。实施例2检测不同浓度的核因子蛋白NF- κ B。对不同浓度的核因子NF-K B蛋白进行检测，其它条件与实施例1中的检测1相同。
权利要求
1.一种检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，其特征在于该方法基于水溶性共轭聚合物和核酸外切酶III，包括以下步骤a.制备可特异性结合蛋白质的双链脱氧核糖核酸荧光探针；b.将双链脱氧核糖核酸荧光探针与脱氧核糖核酸结合蛋白进行结合；c.用核酸外切酶III对上述复合物进行酶切；d.在上述的反应体系中加入水溶性共轭聚合物进行荧光检测。
2.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，其特征是步骤 a制备的双链脱氧核糖核酸荧光探针为两条碱基序列反向互补的单链核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子。
3.根据权利要求2所述的检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，其特征在于所述的核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子，含有脱氧核糖核酸结合蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，其特征在于所述的核酸分子A的3'端含有5个突出的核酸碱基，以便核酸外切酶III作用于双链脱氧核糖核酸探针时，能从B的3'端开始降解。
5.根据权利要求2所述的检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，其特征在于所述的核酸分子B为5'端含有荧光素标记的核苷酸。
6.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，其特征在于所述的步骤b将标记的双链脱氧核糖核酸探针与脱氧核糖核酸结合蛋白进行结合，是脱氧核糖核酸结合蛋白与双链脱氧核糖核酸探针间发生序列特异性识别并结合的过程。
7.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，其特征在于所述的步骤c用核酸外切酶III对上述复合物进行酶切，是核酸外切酶III对核酸探针分子从双链脱氧核糖核酸的3'发生降解反应，逐个释放单核苷酸的过程。
8.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，其特征在于所述的步骤d中的水溶性共轭聚合物的发射光谱与荧光素的吸收光谱有较好的重叠，以便发生高效的荧光共振能量转移；荧光共振能量转移效率用529nm和450nm处的荧光发射强度的比值来表示，即 I529nm/l450nm。
9.根据权利要求8所述的检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，其特征是所述的荧光发射强度，用岛津RF-5301荧光分光光度计进行检测，激发波长为404nm，发射波长扫描范围为410-650nm。
全文摘要
本发明的检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法以荧光素标记的含有蛋白结合位点的双链核酸为探针，该探针结合靶蛋白后形成的“核酸探针/脱氧核糖核酸结合蛋白”复合物为核酸探针提供了空间保护，可以使其不被核酸酶水解，从而可以与阳离子的水溶性共轭聚合物之间通过静电反应进行结合，使荧光素与聚合物之间有较近的距离可以发生高效的荧光共振能量转移。该方法基于水溶性共轭聚合物和核酸外切酶Ⅲ，包括以下步骤a.制备可特异性结合蛋白质的双链脱氧核糖核酸荧光探针；b.将双链脱氧核糖核酸荧光探针与脱氧核糖核酸结合蛋白进行结合；c.用核酸外切酶Ⅲ对上述复合物进行酶切；d.在上述的反应体系中加入水溶性共轭聚合物进行荧光检测。
文档编号G01N21/64GK102384978SQ20111025286
公开日2012年3月21日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者刘兴奋, 欧阳斓, 黄维, 黄艳琴 申请人:南京邮电大学