, 10 μ Μ)： 卩1^6-2(￥1<：，1(^]\〇:从(：探针（册0，1(^]\〇:内标0嫩(550(^^7) :模板：无菌水为12.5: 0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :1 :5 :3。其中最优体系为 25 μ L，包括：Premix Ex Taq(2x)12. 5 μ L，RpiR-F(10 μ Μ)0· 5 μ L，RpiR-F(10 μ Μ)0· 5 μ L，sea-F(10 μ Μ)0· 5 μ L， sea-F (10 μ Μ) 0· 5 μ L，Probe-1 (FAM, 10 μ Μ) 0· 5 μ L，Probe-2 (VIC, 10 μ Μ) 0· 5 μ L，IAC 探针 (NED, 10 μ Μ) 0· 5 μ L，内标 DNA (550copy) 1 μ L，模板 5 μ L，无菌水 3 μ L。
[0044] 步骤（c)中的最优的反应条件为：95°C预变性30s，再循环40次，每个循环的程序 包括：95°C变性10s，60°C退火30s，收集FAM，VIC，NED三个荧光信号通道的信号，循环结束 后，结束反应。
[0045] 本发明在利用比较基因组学发掘金黄色葡萄球菌新检测靶点的基础上，建立了能 够快速定量检测食品中金黄色葡萄球菌活菌，筛查肠毒素 A基因，并能够指示PCR反应假阴 性的内标PMA-qPCR检测方法。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明的检 测靶点是自行通过比较基因组学、生物信息学筛选，并经过生物学验证得到的，具有单一特 异性，弥补了原来检测靶点的特异性不强等缺陷；本发明在前期样品处理过程中通过添加 PMA，消除了死细胞导致的定量过高问题；本发明在定量金黄色葡萄球菌活菌的同时，通过 筛查肠毒素 A基因的携带情况，来评估可能带来的风险；本发明建立的检测方法，检测检测 时间短，特异性强，检测结果可靠，结果判定简单，更加具有实用性，对准确定量检测食品中 的金黄色葡萄球菌具有非常重要的指导意义和应用价值。
[0046] 以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0047] 图1是本发明中金黄色葡萄球菌特异检测靶基因 RpiR引物和探针特异性评价结 果；
[0048] 图2是本发明中金黄色葡萄球菌肠毒素 A基因的引物和探针特异性评价结果；
[0049] 图3是本发明中PMA-qPCR反应体系中检测靶基因 RpiR的灵敏度评价结果；
[0050] 图4是本发明中PMA-qPCR反应体系中肠毒素 A基因的灵敏度评价结果；
[0051] 图5是本发明中PMA-qPCR反应体系中扩增内标的有效扩增能力评价；
[0052] 图6是本发明中PMA-qPCR反应体系在纯培养物中的荧光定量标准曲线；
[0053] 图7是本发明中PMA-qPCR反应体系在速冻米面制品中的荧光定量标准曲线。
【具体实施方式】
[0054] 实施例1
[0055] PMA-qPCR检测方法的建立
[0056] 步骤一，检测引物和相关探针的设计
[0057] 通过比较基因组学分析，获得金黄色葡萄球菌的特异检测靶基因 RpiR。从NCBI GenBank下载RpiR基因的所有核酸序列，进行同源比对分析，查找RpiR基因的保守区域。 该靶点序列的碱基序列信息如SEQ ID NO: 1所示。同时从GenBank下载金黄色葡萄球菌肠 毒素 A基因（sea)的碱基序列，然后进行同源比对分析，查找该基因的保守区域。肠毒素 A 基因的碱基序列信息如SEQ ID N0:2所示。
[0058] 分别将RpiR和sea的碱基序列输入到Beacon designer7. 0中，在两个基因保守 区域设计引物对和探针，设置GC%范围为40-60%，产物大小范围为70-150bp之间，从备选 引物对和探针中选出较好的引物对和探针，引物和探针序列见表1 (引物由上海生工生物 工程技术服务有限公司合成，探针由赛默飞世尔科技中国有限公司合成）：
[0059] 表1检测引物和相关探针序列信息
[0060]
【主权项】
1. 一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特征在于，包括以下步 骤： a) 对待测样品进行前处理； b) 提取待测样品中的菌体DNA; c) 以步骤（b)中提取的菌体DNA为模板，用优化建立的PMA-qPCR反应体系和反应条 件，进行实时荧光定量Real-timePCR检测； d) 反应结束后，根据荧光定量PCR的扩增曲线和Ct值，依据预先建立的金黄色葡萄球 菌和肠毒素A基因的定量标准曲线，计算检验样品中金黄色葡萄球菌活菌数量及判定肠毒 素A基因的携带情况。
2. 如权利要求1所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特 征在于，所述步骤（a)中的前处理为PMA法处理待测样品，包括以下步骤： 1) 称取食品样品，加入无菌生理盐水，样品与无菌生理盐水的质量与体积比为1 :9,均 质拍打100s，吸取均质液，然后10000rpm/min离心lmin，弃上清； 2)加入TE(10 %TritonXlOO)缓冲液，TE(10 %TritonXlOO)缓冲液与步骤（1)中的均 质液体积相同，振荡混均，然后l〇〇〇〇rpm/min离心lmin，弃上清，； 3) 加入TE(10 %TritonXlOO)缓冲液，体积为步骤（2)中TE(10 %TritonXlOO)缓冲液 体积的一半，振荡混均后，加入PM工作液，使其终浓度为50yM。混均后，暗室孵育5min， 然后置于PMA-IiteLED光分解仪器上作用15min。
3. 如权利要求1所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特 征在于，步骤（c)中PCR反应体系包含，金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的特异引物和 探针，肠毒素A基因的特异引物和探针，及扩增内标的模板和探针。
4. 如权利要求1所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特 征在于，所述金黄色葡萄球菌特异检测靶基因RpiR的碱基序列如SEQIDNO: 1所示。
5. 如权利要求3所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特 征在于，所述特异引物包括： 金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的正向引物RpiR-F序列为： 5' -GATTGCATGATTTTTGTGACGAA-3' ； 金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的反向引物RpiR-R序列为： 5' -GGCCACCTGTGCAATTGACT-3'； 肠毒素A基因的正向引物Sea-F序列为： 5' -GTGGTACACCAAACAAAACAGCTT-3'； 肠毒素A基因的反向引物Sea-R序列为： 5' -TCTCTTCGGTCAATCGATTATTATCA-3'。
6. 如权利要求3所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特 征在于，所述探针包括： 金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的探针序列为： FAM-5' -CAAGGTAGTCATAGTGAATTG-3'-MGB; 肠毒素A基因sea的探针序列为： VIC-5' -TGTATGGTGGTGTAACGTTA-3' -MGB ; 扩增内标探针IAC探针序列为： NED-5' -ATTGGTGCTGAATAGTGTGT-3' -MGB。
7. 如权利要求3所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特 征在于，所述扩增内标模板序列如SEQIDN0:3所示。
8. 如权利要求1所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法， 其特征在于，所述步骤（c)中的反应体系包括：以下溶液体积比为：PremixExTaq(2x): RpiR-F(IOyM) ：RpiR-F(10yM) ：sea-F(IOyM) ：sea-F(IOyM) ：Probe-l(FAM, 10yM)： 卩1^6-2(￥1(：，10 1^):从(：探针（册0，10 1^):内标0嫩(550(^^7):模板：无菌水为12.5: 0? 5 :0? 5 :0? 5 :0? 5 :0? 5 :0? 5 :0? 5 :1 :5 :3〇
9. 如权利要求I所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特 征在于，步骤（c)中的反应条件为：95°C预变性30s，之后循环40次，每个循环的程序包括 95°C变性10s，60°C退火30s，收集FAM，VIC，NED三个荧光信号通道的信号，循环结束后，结 束反应。
【专利摘要】本发明公开了一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，及其检测靶基因、引物和探针。本发明方法为：使用PMA处理待测食品样品，消除死细菌DNA导致的定量过高问题；建立了快速定量检测食品中金黄色葡萄球菌活菌，筛查肠毒素A基因并能够指示PCR反应假阴性的PMA-qPCR检测方法。该检测方法可以在5-6h内，对食品中污染量在103-108cfu/g范围内的金黄色葡萄球菌进行准确定量，以及肠毒素A基因的筛查。本发明建立的检测方法，特异性强，定量准确，检测速度快且能检测活菌。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-10
【公开号】CN104726576
【申请号】CN201510111879
【发明人】史贤明, 宋明辉, 施春雷, 张易, 崔妍
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月13日