一种抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体及其制备方法，所述抗体通过将免疫蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，用酸调pH至4.8；按每毫升稀释蛋黄液加11μL辛酸的比例在室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置2h，然后以10000r/min的转速离心30min，弃沉淀；上清液经125μm尼龙筛过滤后，加入1/10体积的0.01mol/L的PBS，用碱调pH至7.2；将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1%（V/V），充分搅拌均匀而得到的；所述抗体能针对猪圆环病进行有效的防治，其制备方法采用辛酸沉淀法，制备的蛋黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。
【专利说明】一种抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其是一种抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体及其制备方法。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒是迄今发现的一种最小动物病毒。已知猪圆环病毒(PCV)有两个血清型，即PCV-1和PCV-2。其中，PCV-1为非致病性病毒，PCV-2为致病性病毒，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，猪皮炎与肾病综合征，断奶仔猪和育肥猪呼吸道疾病综合征，幼龄仔猪先天性震颤(又称2型相关性中枢神经系统病)等疾病，并可造成免疫抑制，给规模化猪场的疾病防控带来很大困难。
[0003]目前主要用疫苗免疫来预防该疾病的发生。由于还没有针对病毒性疾病的特效药物，因此临床治疗上主要采取对症治疗和抗生素类药物预防并发症的发生，其治疗效果不理想。因此，在生产中急需一种针对猪圆环病具有特异性、治疗效果好且疗效迅速的治疗制剂。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体。
[0005]本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体的制备方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:
[0007]—种抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体，所述抗体是由下述方法得到的:
[0008](I)分离高免鸡蛋蛋黄:将猪圆环病毒2型灭活苗免疫过的高免鸡蛋进行消毒后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
[0009](2)制备精制蛋黄抗体:将步骤(1)所分离的蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，其中，蛋黄与醋酸缓冲液的体积比为1:2，用酸调PH至4.8 ;按每毫升稀释蛋黄液加11 μ L辛酸的比例在室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置2h，然后以10000r/min的转速离心30min,弃沉淀；上清液经125 μ m尼龙筛过滤后,加入1/10体积的0.01mol/L的PBS，用碱调PH至7.2 ;将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1%(V/V),充分搅拌均匀。
[0010]优选的，上述抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体，所述抗体的抗体效价为1:128。
[0011]上述抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体的制备方法，具体步骤如下:
[0012](I)分离高免鸡蛋蛋黄:将猪圆环病毒2型灭活苗免疫过的高免鸡蛋进行消毒后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
[0013](2)制备精制蛋黄抗体:将步骤(1)所分离的蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，其中，蛋黄与醋酸缓冲液的体积比为1:2，用酸调PH至4.8 ;按每毫升稀释蛋黄液加11 μ L辛酸的比例在室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置2h，然后以10000r/min的转速离心30min,弃沉淀；上清液经125 μ m尼龙筛过滤后,加入1/10体积的0.01mol/L的PBS，用碱调PH至7.2 ;将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1%(V/V),充分搅拌均匀；
[0014](3)抗体效价的测定。
[0015]优选的，上述抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体的制备方法，所述步骤(1)中的消毒方法是对高免鸡蛋用清水冲洗干净，再用0.05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，再用75%乙醇擦洗一遍，晾干。
[0016]优选的，上述抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体的制备方法，所述步骤(1)中的高免鸡蛋是由下述方法得到的:
[0017]( i )用猪圆环病毒2型灭活苗(市售)免疫健康的高产蛋鸡；
[0018](ii)利用免疫高产蛋鸡得到高免鸡蛋。
[0019]优选的，上述抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体的制备方法，所述步骤(i )中用疫苗免疫高产蛋鸡的免疫次数> 2。
[0020]优选的，上述抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体的制备方法，所述步骤(3)抗体效价的测定是指将步骤(2)最终所得滤液进行猪圆环病毒抗体效价测定，用0.01M、pH7.2的无菌PBS倍比稀释后加入琼脂凝胶周围孔中，中间孔中加入猪圆环病毒抗原，置湿盒中37°C温箱反应24h，以出现沉淀带的最 高稀释度的蛋黄液为该蛋黄液的猪圆环病毒的抗体效价。
[0021]本发明的有益效果是:
[0022]上述抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体，是一种针对猪圆环疾病具有特异性、治疗效果好且疗效迅速的治疗制剂，能针对猪圆环病进行有效的防治；其制备方法采用辛酸沉淀法提取抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的蛋黄抗体纯度闻、效价闻、性质稳定、易于保存。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0024]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0025]实施例1
[0026]制备猪圆环病毒的高免鸡蛋
[0027](I)选择健康未免疫高产蛋鸡隔离饲养,加强饲料营养，同时加喂头孢噻呋钠以预防细菌感染；
[0028](2)用市售猪圆环病毒2型灭活苗免疫步骤(1)处理过的高产蛋鸡，具体步骤为:进行三次免疫，首免耳后肌肉注射l_2ml，2周后二免，注射免疫用疫苗l-2ml，再隔2周三免，注射免疫用疫苗l_2ml ；
[0029](3)免疫高产蛋鸡后，收集得到的高免鸡蛋，即为猪圆环病毒高免鸡蛋。
[0030]实施例2
[0031]利用实施例1制备的猪圆环病毒高免鸡蛋制备精制蛋黄抗体
[0032]( I)分离高免鸡蛋蛋黄:
[0033]将实施例(I)中所述闻免鸡蛋在二免后I周开始每隔7天抽样测定闻免鸡蛋蛋黄中抗猪圆环病毒特异抗体效价，抗体效价均达到1:128以上时收集蛋黄，所述收集蛋黄的具体方法为:将实施例1得到的高免鸡蛋用清水洗净，再用0.05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，再用75%乙醇擦洗一遍，晾干，送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
[0034](2)制备精制蛋黄抗体:
[0035]将步骤(1)所分离的蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，其中，蛋黄与醋酸缓冲液的体积比为1:2，所述醋酸缓冲液是指PH3.5的醋酸盐缓冲液，取醋酸铵25g，加水25ml溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节PH值至3.5(电位滴定法)，用水稀释至100ml即得；用酸调PH至4.8 ;按每毫升稀释蛋黄液加11 μ L辛酸的比例在室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置2h，然后以10000r/min的转速离心30min,弃沉淀；上清液经125 μ m尼龙筛过滤后,加入1/10体积的0.01mol/L的PBS，用碱调PH至7.2 ;将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1%(V/V),充分搅拌均匀；
[0036](3)抗体效价的测定:
[0037]将步骤(2)最终所得滤液进行猪圆环病毒抗体效价测定，用0.01M、pH7.2的无菌PBS倍比稀释后加入琼脂凝胶周围孔中，中间孔中加入猪圆环病毒抗原，置湿盒中37°C温箱反应24h，以出现沉淀带的最高稀释度的蛋黄液为该蛋黄液的猪圆环病毒的抗体效价。
[0038]应用实例
[0039]抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体对猪圆环疾病的临床疗效试验
[0040]1、材料与方法
[0041](I)试验材料
[0042]利用实施例2中方法制备得到的抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体，抗体效价为1:128。
[0043]毒株猪圆环病毒强毒分离株。
[0044]实验动物35日龄健康仔猪30头。
[0045](2)试验方法
[0046]选择经猪圆环病毒抗体ELISA诊断试剂盒(购自深圳绿诗源生物技术有限公司)检测为猪圆环病毒抗体阴性的健康仔猪30头，隔离饲养观察一周后，供试验用。
[0047]将试验猪随机分成三组，第一组为空白对照组(10头)，第二组为攻毒对照组(10头)，第三组为攻毒治疗组(10头)。第一组为空白对照组，不注射任何药品，隔离饲养。第二组和第三组每头肌肉注射猪圆环病毒强毒(TCID50:106.5/ml)2ml。于攻毒后24小时给第三组每头皮下注射2ml实施例2所述猪圆环病毒精制蛋黄抗体(琼扩效价:1:128)，第二组皮下注射生理盐水2ml。观察猪的发病和死亡情况至第21天。
[0048]2、试验结果与分析
[0049]抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体对猪圆环疾病的临床疗效试验结果，详见表1。
[0050]表1抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体对猪圆环疾病的临床疗效试验结果
[0051]
【权利要求】
1.一种抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体，其特征在于:所述抗体是由下述方法得到的: (O分离高免鸡蛋蛋黄:将猪圆环病毒2型灭活苗免疫过的高免鸡蛋进行消毒后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离； (2)制备精制蛋黄抗体:将步骤(1)所分离的蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，其中，蛋黄与醋酸缓冲液的体积比为1:2，用酸调PH至4.8 ;按每毫升稀释蛋黄液加11 μ L辛酸的比例在室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置2h，然后以10000r/min的转速离心30min,弃沉淀；上清液经125 μ m尼龙筛过滤后,加入1/10体积的0.01mol/L的PBS，用碱调PH至7.2 ;将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1%(V/V),充分搅拌均匀。
2.根据权利要求1所述的抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体，其特征在于:所述抗体的抗体效价为1:128。
3.权利要求1所述抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于:具体步骤如下: (O分离高免鸡蛋蛋黄:将猪圆环病毒2型灭活苗免疫过的高免鸡蛋进行消毒后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离； (2)制备精制蛋黄抗体:将步骤(1)所分离的蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，其中，蛋黄与醋酸缓冲液的体积比为1:2，用酸调PH至4.8 ;按每毫升稀释蛋黄液加11 μ L辛酸的比例在室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置2h，然后以10000r/min的转速离心30min,弃沉淀；上清液经125 μ m尼龙筛过滤后,加入1/10体积的0.01mol/L的PBS，用碱调PH至7.2 ;将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1%(V/V),充分搅拌均匀； (3 )抗体效价的测定。
4.根据权利要求3所述的抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中的消毒方法是对高免鸡蛋用清水冲洗干净,再用0.05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，再用75%乙醇擦洗一遍，晾干。
5.根据权利要求3所述的抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中的高免鸡蛋是由下述方法得到的: (i )用猪圆环病毒2型灭活苗免疫健康的高产蛋鸡； (ii)利用免疫高产蛋鸡得到高免鸡蛋。
6.根据权利要求5所述的抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(i )中用疫苗免疫高产蛋鸡的免疫次数> 2。
7.根据权利要求3所述的抗猪圆环病毒精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)抗体效价的测定是指将步骤(2)最终所得滤液进行猪圆环病毒抗体效价测定，用0.01M、pH7.2的无囷PBS倍比稀释后加入琼脂凝I父周围孔中，中间孔中加入猪圆环病毒抗原，置湿盒中37°C温箱反应24h，以出现沉淀带的最高稀释度的蛋黄液为该蛋黄液的猪圆环病毒的抗体效价。
【文档编号】C07K16/08GK103833847SQ201310651235
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】李丽琴, 王建, 葛兆宁, 殷立伟, 于昌贵, 程雪娇, 王勇 申请人:天津市中升挑战生物工程有限公司