专利名称：：乌梅提取物在抗畜禽病毒、细菌、支原体或衣原体的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及乌梅提取物的一种新的医药用途，尤其涉及乌梅提取物在抗畜禽病毒、细菌、支原体、衣原体中的用途，属于生物医药领域。
背景技术：
：进入21世纪以来，畜禽重大疫病在全球不断爆发，不仅严重地阻碍了畜牧业的健康发展，也引起了一系列的公共卫生突发事件，我国也未能幸免，先后发生禽流感、猪链球菌病、口蹄疫等重大疫情，给人民健康、社会安定造成了极大的危害。因此，研究和创制生物兽药新产品，已成为保障我国畜牧业发展、维护人民的健康和生命安全、保持社会稳定和促进经济发展的国家重大需求。乌梅(FuctusM匿)是由蔷薇科植物梅(Pr画sm騰(Sieb,)Sieb.etZucc.(ArmeniacamumeSieb.)干燥未成熟果实加工而成。别名有梅实、熏梅、桔梅肉。全国各地都有栽培，主要产于我国四川、浙江、福建、湖南、贵州。该植物味酸、性涩、平，具有敛肺止咳、涩肠止泻、固崩止血、生津止渴、安蛔等功效。主要用于治疗久咳、虚热烦渴、久疟、久泻，痢疾、尿血、血崩、钩虫病等。体外筛选发现乌梅对多种致病菌有抑制作用，如痢疾杆菌、大肠杆菌、伤寒、副伤寒杆菌、百日咳杆菌、脑膜炎双球菌。也有报道对结核杆菌抑制作用，还对某些致病性真菌有抑制作用，但应用于动物和人的疗效没有报道。乌梅的水提取液、醇提取液对肿瘤细胞有一定的抑制生长效应，且呈量效关系。目前乌梅主要用于治疗蛔虫和消化不良等效果较好。2005年农业部发文规定禁止把人类使用的广谱药物(病毒灵、金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛伟)应用到畜禽药物中，防止抗病毒药物耐药性从畜禽向人类传递，但是，我国某些传染性疾病仍缺乏有效的疫苗来控制(如呼吸繁殖综合症、猪心肌炎、猪无名高热等)，开发有效药物来预防这些疾病的途径。畜禽生产中支原体、衣原体、大肠杆菌等广泛流行，控制这些细菌病主要依赖抗菌素治疗。由于抗菌素的滥用、耐药性出现，导致细菌性传染病预防和治疗难度加大。同时药物残留也威3胁人类食品安全和身体健康。开发天然中草药预防畜禽疾病是国家中药创新体系的组成部分，符合高效、毒性小、副作用少的国家产业结构调整方向，顺应绿色、环保的基本生产要求，产品的推广和应用可以解决抗生素药物残留、部分替代抗菌素，控制畜禽重大疫病流行和发生，提高我国畜禽产品出口的竞争力。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种新的能够有效预防和治疗畜禽病毒病、支原体病、衣原体病的植物药。为了解决上述问题，本发明人通过了大量的实验室和临床验证，发现乌梅提取物或有效部位具有抗病毒活性和广谱抗细菌活性，有效防治畜禽禽流感、支原体和禽大肠杆菌，牛大肠杆菌可代替抗菌素治疗家禽顽固性呼吸道疾病，从而有效提高家禽的成活率。同时可抑制猪心肌炎病毒在细胞上的增殖，显示了广谱抗病毒效果。更具体来说，乌梅提取物或有效部位(i、n或m)具有预防和抑制家禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等作用，同时可有效杀灭引起动物致病菌，例如牛无乳链球菌、牛金色葡萄球菌、牛大肠杆菌、鸡大肠杆菌等细菌。此外，本发明还发现乌梅提取物可有效预防和治疗家禽衣原体病和支原体病。本发明分别通过体外、体内试验并将病毒和细菌结合起来，评价乌梅提取物和有效部位的抗病毒和细菌的功效。发现乌梅提取物或有效部位(I、II或III)具有抑制病毒增殖的作用，如禽流感(H9N2、H5N1亚型)、新城疫(F48E8)、传染性支气管炎(M41);乌梅提取物或有效部位可有效抑制下列细菌鸡支原体、鸡衣原体、鸡大肠杆菌、牛大肠杆菌、牛无乳链球菌和牛金黄色葡萄球菌。体内试验表明连续口服4天后，乌梅提取物能抵抗禽流感、新城疫的攻击，同时具有治疗大肠杆菌、支原体混合感染的作用。te乌梅提取物或有效部位(I、II或III)应用于北京延庆县康庄肉鸡饲养协会、河北省丰润养鸡场、高碑店市种鸡孵化场等三家鸡场进行临床试验。结果表明乌梅提取物或有效部位(i、n或m)对禽流感、新城疫、鸡传染性支气管、鸡大肠杆菌、鸡衣原体病均有良好的预防和治疗效果。乌梅提取物应用于预防和治疗小鼠禽流感模型，结果显示预防和治疗禽流感具有良好的效果。本发明所述的乌梅提取物或有效部位可按照现有技术所公开的各种方法提取得到，例如可参考下述文献制备得到沈红梅等，乌梅的化学成分研究，中草药，1995年第26巻第2期。作为优选的，本发明所述的乌梅提取物或有效部位i、n和m按照以下方法制备得到(1)将乌梅粉碎后过筛，筛过物加水浸泡，水煎煮提取，提取液过滤，将滤液浓縮，得浓縮液；(2)将浓缩液用乙酸乙酯浸泡萃取，收取滤液，回收乙酸乙酯，得到乌梅提取物；(3)将乌梅提取物用甲醇溶解后，1-1.5倍(重量/重量)再与硅胶混合，自然凉干，上硅胶柱，依次使用下述三种洗脱液洗脱100%氯仿洗脱液、90%氯仿洗脱液(氯仿甲醇二9:1)、80%氯仿洗脱液(氯仿甲醇=8:2)，收集100%氯仿洗脱液洗脱部分得到乌梅有效成分I;收集90%氯仿洗脱液洗脱部分得到乌梅有效成分II;收集80%氯仿洗脱液洗脱部分得到乌梅有效成分111。上述方法中，优选的，步骤(1)将乌梅粉碎后过IO目筛，筛过物加4-5倍重量水浸泡，水煎煮提取三次，每次2-6小时，收集三次提取液过滤，将滤液浓縮至乌梅提取原料重量的1-1.5倍，得浓縮液；步骤(2)中，优选的，将浓縮液用3-6倍重量的乙酸乙酯浸泡萃取，连续浸泡5-10次，收取滤液，回收乙酸乙酯，得到乌梅提取物；按照上述方法所制备得到的乌梅提取物或有效部位i、n和m，与按照现有方法所得到的乌梅提取物或有效部位相比，主要具有以下几方面的优点有效成分的含量更高，所含的杂质更低；产物的收率有明显提高；有效成分的各组成比例有显著改变，对于畜禽病毒、细菌、支原体或衣原体具有更好的治疗或预防效果。乌梅提取物可以广泛应用于养禽业、养猪业、养牛业，部分替代抗病毒药物，弥补我国目前疫苗预防效果不良造成的损失，替代耐药抗菌素防治畜禽细菌病，控制传染病的流行和解决食品抗菌素残留和保证食品安全，提高保证动物产品出口的竞争力。乌梅提取物按50-500毫克/公斤体重或有效部位按5-200毫克/公斤可通过口服、非肠道或局部途径给药，加入常规的辅料或载体或，可以按照本领域的常规制剂方法制备成口服制剂、注射剂等，例如，可以是片剂、颗粒剂、口服液、注射剂、冻干粉针剂等，优选为口服液或注射剂。具体实施方式以下通过具体实施方式对本发明进行进一步说明。这里想要指出的是，下面的具体实施方式仅用来说明本发明，本领域技术人员在理解本发明精神的前提下，可以根据本
技术领域：
的现有技术和公知知识对本发明进行相应变换，这些技术方案均落入本发明的范围之内。实施例1乌梅提取物或有效部位的制备将乌梅lkg粉碎，然后过10目筛，筛过物加水4-5公斤浸泡，水煎煮3次，每次2-6小时，收集3次滤液后，浓縮为1-1.5公斤，后使用乙酸乙酯3-6倍量浸泡，连续浸泡5-10次，收取滤液，回收乙酸乙酯，得到乌梅提取物；将乌梅提取物使用甲醇溶解后，1-1.5倍(重量/重量)再与硅胶混合，自然凉干，上硅胶柱，依次使用100%氯仿、90%氯仿(氯仿/甲醇=9:1)、80%氯仿(氯仿/甲醇=8:2)、氯仿/甲醇(2:1)、氯仿/甲醇(1:1)、氯仿/甲醇(1:1)/1%甲酸、氯仿/甲醇(1:2)/1%甲酸；收集100%氯仿洗脱部分，得到有效成分I;收集90%氯仿洗脱部分，得到有效成分II;收集80%氯仿洗脱部分，得到有效成分m。乌梅水提取物为深褐色物质，其乙醇溶液的pH为2-5。碘显色取乌梅提取物约O.lg，用lml甲醇溶解，用毛细管点在薄层色谱板，放置碘缸后显黄色。硫酸一乙醇反应配制成10%硫酸乙醇溶液。取乌梅提取物，用甲醇溶解，用毛细管点在薄层色谱板，用喷雾器喷洒10%硫酸溶液试剂，然后用电吹风加热，显黑色。薄层层析(TLC)检查取乌梅提取物少许，点在硅胶板上，显示至少6个荧光斑点。展开剂三氯甲烷甲醇=9:1。实施例2乌梅提取物颗粒剂和口服液的制备将100g乌梅提取物用95%的500ml乙醇溶解，加入聚丙烯酸钠20g、羧甲基纤维素纳20g和糊精1200g。再加入药用淀粉660g，按照常规的方法制成颗粒剂2000g。实施例3乌梅提取物口服液的制备将lOOg乌梅提取物用95%的乙醇500ml乙醇溶解，用100目滤布进行过滤，加入羧甲基纤维素纳100g，混合均匀，用水稀释至2000ML分装成口服液100ML/瓶。试验例1乌梅提取物对细菌性乳腺炎、禽大肠杆菌抑制作用使用灭菌生理盐水将实施例1所制备的乌梅提取物分别稀释成浓度为100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.25mg/ml、1.62mg/ml的稀释液，分别与牛大肠杆菌、牛无乳链球菌、牛金色葡萄球菌、鸡大肠杆菌作用，培养48小时，观察到乌梅提取物抑制细菌生长的最低浓度分别为25.0mg/ral，12.5mg/ml，12.5mg/ml和18.7mg/ml。有效部位I、有效部位II和有效部位III分别稀释为6.25mg/ml、3.2mg/ml、1.6mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml，测定获得抑制细菌浓度分别为见表l。表l乌梅提取物及有效部位体外杀灭细菌最低有效浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>试验例2乌梅提取物对禽流感病毒增殖的抑制作用一、乌梅提取物对SPF鸡胚最大无毒浓度的测定将实施例1所制备的乌梅提取物用生理盐水分别稀释为60rag/mL、20mg/mL、10mg/mL、5rag/mL、2.5mg/mL和1.25mg/mL，然后经尿囊腔接种于生长良好的10d鸡胚，每个稀释度分别接种5枚鸡胚，0.2mL/胚，对照组鸡胚同法接种等剂量的生理盐水。弃取24h内死亡的鸡胚，连续观察6d观察，以不出现死亡和鸡胚体病变为该药对鸡胚的无毒浓度。使用灭菌生理盐水稀释的乌梅提取物(每毫升含60、50、40、20、10、5和2.5mg)尿囊腔接种鸡胚，连续观察6d，每组的5枚鸡胚全部存活，发育健康，说明乌梅提取物各稀释度对鸡胚在观察时间内无毒性作用。二、乌梅提取物(实施例l所制备)对禽流感(H9N2亚型、禽流感H5M亚型)病毒抑制作用用前使用鸡胚复壮，测定病毒对SPF鸡胚半数致死量分别为10^ELD5。和1062ELD5。.10dSPF鸡胚购自北京梅里亚维通达实验动物公司。分别将50、25、12.5、6.25、3.25、1.62mg/ml乌梅提取物与禽流感H9N2亚型病毒分别接种SPF鸡胚，试验组鸡胚全部存活，其尿囊液血凝集效价阴性，对照组H9N2亚型病毒50%死亡。将乌梅提取物12.5、6.25、3.25、1.62、0.81、0.41、0.20mg/ml上述剂量药物与禽流感H5N1亚型分别接种SPF鸡胚后，12.5、6.25、3.25、1.62、0.81mg/ml全部保护SPF鸡胚存活，0.41mg/ml可以获得86%保护，0.20rag/ml获得50%保护。试验例3乌梅提取物预防鸡、小鼠禽流感的作用SPF鸡、BALB/C小鼠饲养在生物安全3级实验室的隔离器中，饲料和饮水经过高压灭菌。乌梅提取物(实施例1所制备)、达菲、金刚烷胺分别按100、1、1.5mg/kg口服，每日二次，4天后经过鼻腔接种禽流感病毒0.lml，连续观察SPF鸡、小鼠存活时间和临床症状，并统计其成活率和死亡率。试验结束后，剩余动物使用安乐死处理，剖检组织器官，观察不同组织器官的病理变化，测定其肺脏病变指数。试验结果显示乌梅提取物、达菲、金刚垸胺的提取物保护率分别为80.0%、85.0%、70.0%;肺脏出血病变指数6.6、3.3、33.3。小鼠成活率分别为87.7、90.0和75.0，肺脏病变指数为0.84、0.77和1.92(表2)。表2乌梅提取物预防禽流感动物模型效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注肺脏出血面积指数=双侧肺脏出血面积投影/肺脏面积*100;肺脏病变指数=肺脏质量/体重*100试验例4乌梅提取物对预防家禽慢性呼吸道病与大肠杆菌混合感染的作用将乌梅提取物(实施例l所制备)配制成浓度为lOOrag/mL口服液体，给临床诊断为慢性呼吸道病并发大肠杆菌病的肉鸡连续口服4天(剂量为100mg/kg体重)，同时以新强霉素(新霉素、强力霉素，剂量为10mg/kg)口服4天做对照。结果表明乌梅治愈率为95%，新强力霉素为80%(治愈率=治疗前发病数-治疗后发病数/剩余鸡只)，且乌梅组肉鸡肺脏、气囊病变指数明显低于对照组。试验例5乌梅提取物对预防肉鸡衣原体感染的作用选择临床感染衣原体肉鸡分成5组，其中试验组3组，红霉素治疗对照组和空白对照组。乌梅提取物(实施例1所制备)试验组分别按高(100mg/kg体重)、中(50rag/kg体重)、低剂量组(25mg/kg体重)口服肉鸡。结果表明按100mg/kg体重、50mg/kg体重、25mg/kg体重口服，肉鸡衣原体病治愈率分别为90%、90%和80%，红霉素对照组为40%(表3)。表3乌梅提取物对肉鸡衣原体治疗效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>治愈率=治疗前发病鸡只-治疗后发病鸡只/试验鸡只数量试验例6乌梅提取物对鸡新城疫病毒保护作用选择4周龄SPF鸡分成4组，其中试验组3组，l组为感染对照。将实施例l所制备的乌梅提取物试验组分别按高(750mg/kg体重)、中(500mg/kg体重)、低剂量组(250rag/kg体重)连续口服4天，第5天继续口服，下午使用新城疫病毒F48E28株鼻腔接种。结果表明按上述三种剂量口服，SPF鸡保护率分别为80。/。、70%和40%，病毒对照组为0%(表4)。表4乌梅提取物对SPF鸡新城疫病毒预防效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>试验例7乌梅提取物有效部位I对禽流感病毒保护作用BALB/C小鼠饲养在生物安全3级实验室的隔离器中。将乌梅有效部位I(实施例1所制备)分别按50mg/kg、25mg/kg、10rag/kg体重灌胃口服小鼠，每天1次，连续口服4天后，鼻腔接种禽流感病毒O.lral，继续口服有效部位I至第5天，停药，连续观察小鼠临床反应10天，记录发病率、死亡数量。IO天后未死亡小鼠，剖检测定肺脏质数。结果显示有效部位I保护率分别为100%、90%、70%;肺脏病变指数分别为0.65、0.80和0.85;肺脏病毒效价分别为0、0和1.2(表5)。表5乌梅有效部位I预防禽流感小鼠模型效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>试验例7乌梅提取物有效部位n对禽流感病毒保护作用BALB/C小鼠饲养在生物安全3级实验室的隔离器中。将乌梅有效部位II(实施例1所制备)分别按50mg/kg、25mg/kg、10mg/kg体重灌胃口服小鼠，每天1次，连续口服4天后，鼻腔接种禽流感病毒O.lml，继续口服有效部位I至第5天，停药，连续观察小鼠临床反应10天，记录发病率、死亡数量。IO天后未死亡小鼠，剖检测定肺脏质数。结果显示有效部位II保护率分别为100%、100%、90%;肺脏病变指数分别为0.62、0.69和0.81;肺脏病毒效价分别为O、0和1.1(表6)。表6乌梅有效部位II预防禽流感小鼠模型效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>25100100.00.6901010190.00.811.1病毒对照组550.01.106.0试验例8乌梅提取物有效部位III对禽流感病毒保护作用BALB/C小鼠饲养在生物安全3级实验室的隔离器中。将乌梅有效部位m(实施例1所制备)分别按50mg/kg、25mg/kg、10mg/kg体重灌胃口服小鼠，每天1次，连续口服4天后，鼻腔接种禽流感病毒O.lml。继续口服有效部位至第5天，停药，连续观察小鼠反应10天，观察指标同上。试验表明小鼠存活率分别为100%、86%、80%;肺脏病变指数分别为0.70、0.85和0.90;肺脏病毒效价分别为0、1.2、1.5(表7)。表7乌梅有效部位m预防禽流感小鼠模型效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>对比试验例1不同方法制备的乌梅提取物预防禽流感效果试验方法1(本发明方法)将乌梅lkg粉碎，然后过10目筛，每次用水4升，煎煮3次，合并滤液，滤液加乙酸乙酯萃取，得到乌梅提取物70g。方法2(现有技术方法)将乌梅lkg粉碎，然后过IO目筛。首先使用石油醚浸泡，筛过物用石油醚提取。每次用石油醚4升，提取4次，合并提取液体。得到石油醚提取物260g。然后使用乙酸乙酯萃取，得到提取物50g。方法3(沈红梅等，乌梅的化学成分研究，中草药，1995年第26巻第2期)将乌梅lkg粉碎，然后过IO目筛。首先使用甲醇回流，回收得到甲醇提取物，然后使用滤液加乙酸乙酯萃取，获得乌梅提取物60g。将上述三种方法所提取得到的乌梅提取物分别按照相同的剂量口服SPF鸡5天，试验结果见表8，观察其保护率分别为70%，50%和60%。表8不同乌梅提取物对SPF鸡禽流感预防效果分组鸡数量(只)剂量(mg/kg)成活率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>试验结果表明，本发明方法所制备的乌梅提取物较现有方法所制备的乌梅提取物，其预防鸡禽流感效果有显著提高。权利要求1、乌梅提取物或有效部位在制备抗畜禽病毒、细菌、支原体、衣原体药物中的用途。2、按照权利要求1的用途，其特征在于所述的畜禽病毒是禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒。3、按照权利要求2的用途，其特征在于所述的禽流感病毒是H9N2亚型或H5N1亚型禽流感病毒；所述的新城疫病毒是F48E8型；所述的畜禽传染性支气管炎病毒是M41型传染性支气管炎病毒。4、按照权利要求1的用途，其特征在于所述的细菌是牛无乳链球菌、牛停乳链球菌、牛金色葡萄球菌、牛大肠杆菌、鸡大肠杆菌。5、按照权利要求1的用途，其特征在于所述的乌梅有效部位包括有效部位i、n或ni。6、按照权利要求1或5的用途，其特征在于所述的乌梅提取物或有效部位按照以下方法制备得到，包括(1)将乌梅粉碎后过筛，筛过物加水浸泡，水煎煮提取，提取液过滤，将滤液浓缩，得浓縮液；(2)将浓縮液用乙酸乙酯浸泡萃取，收取滤液，回收乙酸乙酯，得到乌梅提取物；(3)将乌梅提取物用甲醇溶解后，1-1.5倍(重量/重量)再与硅胶混合，自然凉干，上硅胶柱，依次使用下述三种洗脱液洗脱100%氯仿洗脱液、90%氯仿洗脱液(氯仿甲醇=9:1)、80%氯仿洗脱液(氯仿甲醇=8:2)，收集100%氯仿洗脱液洗脱部分得到乌梅有效成分I;收集90%氯仿洗脱液洗脱部分得到乌梅有效成分II;收集80%氯仿洗脱液洗脱部分得到乌梅有效成分111。7、按照权利要求6的用途，其特征在于步骤(1)中将乌梅粉碎后过10目筛，筛过物加4-5倍重量水浸泡，水煎煮提取3次，每次2-6小时，收集三次提取液过滤，将滤液浓縮至乌梅提取原料重量的1-1.5倍，得浓縮液。8、按照权利要求6的用途，其特征在于步骤(2)中，将浓縮液用3-6倍重量的乙酸乙酯浸泡萃取，连续浸泡5-10次，收取滤液，回收乙酸乙酯，得到乌梅提取物。全文摘要本发明公开了乌梅提取物或有效部位(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)在预防和治疗畜禽病毒性、细菌性、支原体、衣原体疾病中的用途。体内和体外试验表明，乌梅提取物或有效部位(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)具有预防和抑制家禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等作用，同时可有效杀灭引起动物致病的细菌，例如牛无乳链球菌、牛金色葡萄球菌、牛大肠杆菌、鸡大肠杆菌等细菌。此外，乌梅提取物或有效部位可有效预防和治疗家禽衣原体病、支原体病。文档编号A61P31/12GK101317904SQ20071010028公开日2008年12月10日申请日期2007年6月7日优先权日2007年6月7日发明者诚何,张发明,斯建勇,李应超申请人:诚何