植物病毒在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用的制作方法

专利名称：：植物病毒在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医学领域，更具体地说是涉及烟草花叶病毒在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。植物病毒(烟草花叶病毒)转染恶性肿瘤细胞(Hela)后，不仅在恶性肿瘤细胞中发生了复制，而且使肿瘤细胞出现空泡效应诱导其发生了自噬(细胞程序性II型凋亡)及凋亡。
背景技术：
：1911年美国病毒学家劳斯发表医学报告，首次提出癌肿瘤是病毒所致的这一学说，并获得1966年的诺贝尔医学与生理学奖，时隔大半个世纪后德国科学家楚尔郝森因发现人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)引发子宫颈癌而获得2008年诺贝尔生理学奖，再次论证了这一学说。上世纪初，医生在临床上观察到一些患有肿瘤的病人在经历一场病毒感染之后惊奇的发现肿瘤消失了。这个谜团一直在上世纪二十年代才得以解开，并引起众多科学家及临床医生的重视，由此也兴起了利用病毒治疗肿瘤的尝试。到上世纪中叶，己有50多种病毒被用于人或动物肿瘤的治疗[MullenJT，TanabeKK.2002.Viraloncolysis.Owco/og/W.7(2):廳-19;McCormickF.2001.Cancergenetherapy:fringeorcuttingedgei\to7evOmcw.1(2):130-41]。1956年，在美国国家癌症研究所，Smith先生领导的课题组[Smitheta1.(1956)9:1211-1218]，利用10种野生的人类腺病毒感染Hela细胞或KB细胞产生的细胞裂解上清液对30多位患有子宫肿瘤的病人进行原位注射及静脉给药治疗。所有的病人在接受治疗之后肿瘤肿块縮小且出现肿瘤细胞裂解现象。一直以来，生物界中存在不同种属间的相互干扰现象，例如1928年英国细菌学家亚历山大弗莱明发现青霉菌会抑制葡萄球菌生长而发明了青霉素，并因此而获得1945年诺贝尔医学奖，人类从此走进抗生素时代；接着1946年美国科学家赛尔曼，瓦克斯曼发现链霉菌可抑制结核杆菌生长，从而使链霉素广泛应用于抗结核治疗，并因此获得1952年诺贝尔医学奖。近年来不断有跨生物界远缘病毒入侵人类，比如SARS病毒来源于野生动物棕榈猫；HIV病毒来源于非洲黑猩猩。随着病毒本身的高度变异，病毒能否入侵人体细胞，己经不完全决定于特异性受体的有无。在生物进化过程中，整个生物群体也在不断地应对跨生物界的全新病毒、或发生变异的原有病毒，先进生物技术的拓展，削弱了原有的生物界物种屏障，多种转染技术可以将蛋白、核酸、大颗粒物质直接导入细胞；人类的探索活动向世界各地纵深，拉近了人与不同物种间的距离，跨生物界生命物质比以往任何时候都更容易发生交叉与融和。本发明就是以跨生物界远缘病毒入侵，即植物病毒入侵人类细胞为出发点，以引导治疗肿瘤的新方向为目标，为探索远缘病毒对人类致病病毒的干扰做了相关科学研究，发明采用对人类无特异性受体、无主动侵袭性的植物病毒(烟草花叶病毒，TMV，以下简称T病毒)，以及在全世界细胞研究中使用最早、应用最广泛的人类细胞Hda细胞系为代表进行相关研究，借助生物转染技术将T病毒直接导入Hela细胞。
发明内容本发明的目的在于通过探索远缘病毒与人类致病病毒间的干扰，将植物病毒(T病毒)导入恶性肿瘤细胞(Hela)中，观察植物病毒对肿瘤细胞的作用与影响，进而提供T病毒在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。为达上述目的，本发明采取了以下技术措施-1)观察到植物病毒可有效地进入肿瘤细胞。2)观察到植物病毒RNA在肿瘤细胞中表达。3)观察到植物病毒蛋白在肿瘤细胞中表达。4)观察到植物病毒在肿瘤细胞中发生了复制。5)观察到植物病毒在肿瘤细胞内合成完整子代病毒颗粒。5)观察到植物病毒诱导肿瘤细胞发生自噬。6)观察到植物病毒诱导肿瘤细胞发生凋亡。4本发明提供的技术方案是植物病毒在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。所述植物病毒为烟草花叶病毒。所述恶性肿瘤为由病毒感染引起的恶性肿瘤。所述恶性肿瘤为由人乳头瘤病毒引发的宫颈癌。所述药物以载体形式增进植物病毒的输入，如脂质体药物制剂等。本发明将植物病毒(T病毒)成功导入恶性肿瘤细胞中，进一步T病毒在肿瘤细胞内发生了复制并表达病毒蛋白，最终诱导了肿瘤细胞(Hela)发生自噬与凋亡。本发明尚属首创，野生型的植物病毒(T病毒)被有效地转染至肿瘤细胞(Hela)中，在肿瘤细胞内发生了复制并合成了子代病毒颗粒，进一步诱导肿瘤细胞发生自噬与凋亡现象。针对该植物病毒这一特性可将其用于肿瘤的治疗，如随后具体实施例结果所示，T病毒对于肿瘤细胞无论在核酸水平还是蛋白水平都具有良好的抑瘤效果。该病毒可制备用于治疗肿瘤的药物中的应用，可将其制成活性成分，在肿瘤治疗中通过各种途径给药包括但不限于肿瘤内给药以及局部肿瘤血管内给药或者通过脂质体包装该病毒为一种脂质体药物制剂直接导入肿瘤细胞内发挥杀伤肿瘤效应。另外，还可将其以液体的形式配成注射液、喷雾剂、滴液等，直接用于恶性肿瘤治疗中。另外，该病毒还可用于联合其他治疗恶性肿瘤的手段比如化学药物疗法、局部或瘤内放射疗法等非手术治疗手段，而作为一种辅助抑瘤手段，或者是用于恶性肿瘤术后瘤床的治疗。除此之外，植物病毒还可携带较大的外源基因如抑制血管生成的基因或能刺激免疫活性的基因进入耙向器官，并具有更高的稳定性。相比于以往一些进入肿瘤细胞的载体系统来说，植物病毒还具有以下优点和效果首先它易于制备，该病毒能在植物体内可进行大规模的培养；其次生物安全性高，相比动物病毒来说，以远缘的植物病毒治疗人类恶性肿瘤具有更高的安全性。本发明应用于恶性肿瘤的治疗，所指恶性肿瘤包括恶性上皮肿瘤与恶性非上皮肿瘤等。恶性上皮肿瘤包括癌与腺癌；其中包括但不限于宫颈癌、乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、肝癌等。恶性非上皮肿瘤包括但不限于卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、血管瘤等。图l为本发明摸索T病毒RNA经Lippofectamine2000转染入Hela细胞的条件；图2为本发明RT-PCR检测T病毒正负链RNA在Hela细胞内的表达；图3为本发明Real-TimePCR检测Hela细胞内T病毒正负链RNA相对量；图4为本发明Westernblot检测T病毒在Hela细胞中CP的表达；图5为本发明免疫荧光检测Hela细胞内CP的表达；图6为本发明透射电镜检测转染T病毒的Hela细胞内的情况；图7为本发明光学显微镜和扫描电镜观测转染T病毒的Hela细胞内的自噬泡；图8为本发明RT-PCR检测转染T病毒的Hela细胞自噬基因Bedin-l的核酸水平变化表达；图9为本发明Westernblot检测转染T病毒的Hela细胞自噬基因Beclin-1蛋白水平变化表达；图10为本发明RT-PCR检测T病毒RNA为诱导Hela细胞发生自噬的关键因素;图11为本发明流式细胞仪检测转染T病毒的Hela细胞凋亡率。具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明试剂来源Lipofectamine2000(脂质体2000转染试剂)由Invitrogen公司提供。逆转录试剂盒、TRIzol试剂、PCR试剂盒、实时定量PCR试剂盒由MBI公司提供。T病毒衣壳蛋白(CP)多克隆抗体，本室制备兔抗血清，亲和层析纯化。Beclin-1单抗，由晶美生物技术有限公司提供。PVDF膜、DTT、Tween-20、DAB显色试剂盒，由凌飞科技技术有限公司提供。AnnexinV/PIapoptosiskit由MULTISCIENCES公司提供。细胞固定剂武汉大学医学院结构中心电镜室配制。透射电镜HitachiH-600,由武汉大学基础医学院医学结构中心提供。一、提取T病毒从新鲜植物中直接提取T病毒，具体歩骤如下l)研磨新鲜(或冰冻)叶片放入研钵，加入液氮迅速研磨，至绿色粉末。2)过滤粉末移入量杯，加入3倍体积0.1M磷酸盐缓冲液(PB，pH7.2)，再加入0.1%巯基乙醇，搅拌10min，三层纱布过滤，收集滤液。3)氯仿沉淀搅拌滤液，缓慢加入10%氯仿(V/V)，混匀30min，静置30min，离心(12000rpm，20min)，小心收集上清。4)盐/PEG沉淀搅拌上清，缓慢加入4%(W/V)NaCl粉末，溶解后再缓慢加入4%(w/v)PEG6000粉末，搅拌4-10h，静置10h，离心(12000rpm，20min),收集沉淀。5)洗涤沉淀沉淀中加入0.01M盐酸缓冲液，20-30ml，搅拌4-10h，至全部溶解，离心(12000rpm，20min)，小心收集上清。沉淀重复处理1次。6)蔗糖垫超离上清底部小心加入20。/。(W/V)蔗糖10ml，离心(40000rpm，l-2h)，收集沉淀。7)收集沉淀沉淀中加入0.01MPB，3-5ml，重悬后，分装-20。C保存备用。二、建立T病毒进入肿瘤细胞(Hela)的稳定转染体系1)提病毒RNA:发病叶片总RNA提取参照[LogemannJ，SchellJ，WillmitzerL.1987.ImprovedmethodfortheisolationofRNAfromplanttissues.爿wa/所oc/ze附.15;163(1):16-20]的方法进行。2)摸索转染条件按上述步骤提取T病毒总RNA后，先建立T病毒转染恶性肿瘤细胞(Hela)的转染体系，摸索T病毒RNA经Lipofectamine2000转染入Hela细胞的条件。转染步骤参照Lipofectamine2000说明书进行，将Lipofectamine2000与T-RNA分别以1:1、1:2、h3的比例转染Hela细胞，分别取T病毒RNA8吗、16吗、24吗，分别溶于500pl无血清培养基，得到A液；取Lipofectamine200010pl加入500nl无血清培养基中，得到B液。将A、B液分别混匀，室温孵育20min。孵育期间用无血清培养基将Hela细胞洗一遍，并加入无血清培养基，将A，B混合液加入到细胞中，轻轻混匀，放置37。C培养箱中孵育4-6h。3)通过PCR技术检测，具体步骤如下采用Trizol法分别抽提三种转染比例(1:1、1:2、1:3)的细胞总RNA，分别以5，TTAAGTTGCAGGACCAGAGG3，和5，ATGTCTTATAGTATCACTACTCCATC3，与01igo(dT)18—起为引物，按MBI公司逆转录试剂盒的说明合成cDNA，再用PCR试剂盒，以cDNA为模板，分别以T病毒CP的正向引物(5TCGTGTTCTTGTCATCAGCGTGGG3')和反向引物(5，GCCACCGTTGCGTCGTCTACTCT3，)扩增目的DNA。反应体系为Template(反转录产物即分别加入T病毒CP引物、01igo(dT),8进行逆转录得到的T病毒cDNA及ActincDNA)4pl，10xTaqBuffer(NH4S04)5nl，2.5mMdNTPmix5^1，Forwardprimer(25|oM)2^1，Reverseprimer(25nM)2jal，Taq酶(5u/|xl)0.4^1，ddH2031.6^1。反应条件为94°C预变性5min;94。C45sec，53。C45sec，72。C45sec，35个循环；最后于72°C延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖电泳检测观察目的条带，内参照Actin为297bp。4)实验结果如图1所示，以RNA:LIP=1:1的情况下，可以将T病毒RNA转染至Hda细胞中。这说明，我们己成功建立T病毒转染恶性肿瘤细胞的转染体系，当T-RNA:LIP-1:1时为最佳转染条件。三、检测T病毒转染至Hda细胞内的复制情况1.RT-PCR检测Hela细胞T病毒衣壳蛋白(T-CP)的正负链RNA的表达水平1)收集转染T病毒后的Heal细胞，提取其总RNA，进行RT-PCR检测。具体实验步骤如下将实验分为2个组，其中未转染T病毒RNA的Hela细胞(normalcell，NC)为正常对照，经Lipofectamine2000转染T-RNA后分别于24h、48h、72h收集的Hela细胞。采用Trizol法分别抽提细胞2组Hela细胞总RNA，分别以5'TTAAGTTGCAGGACCAGAGG3'和5'ATGTCTTATAGTATCACTACTCCATC3'与Oligo(dT),s—起为引物，按MBI公司逆转录试剂盒的说明合成T病毒CPcDNA，再用PCR试剂盒，以cDNA为模板，分别以T病毒CP正向引物(5TCGTGTTCTTGTCATCAGCGTGGG3')禾B反向弓l物(5，GCCACCGTTGCGTCGTCTACTCT3')及Actin正向引物(5'TCACCCACACTGTGCCCCATCTACGA3')和反向引物(5'CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3')扩增目的DNA。反应体系为Template(反转录产物即分别加入T病毒衣壳蛋白基因正反向引物、01igo(dT)18进行逆转录得到的cDNA)4^1，10xTaqBuffer(NH4S04)5|il，2.5mMdNTPmix5^1，Forwardprimer(25pM)2^1,8Reverseprimer(25,2^1，Taq酶(5,0.4jxl，ddH2031.6jxl。反应条件为94。C预变性5min;94°C45sec，53°C45sec,72°C45sec，35个循环;最后于72°C延伸5min。Actin为内参照。PCR产物经1%琼脂糖电泳检测观察目的条带。2)结果如图2所示，经Lipofectamine2000转染后的分别收集的24h、48h、72hHela细胞中清晰可见T病毒基因组衣壳蛋白CP正、负链RNA的条带。由此说明T病毒CP正负链RNA在Hela细胞中持续存在达72h，T病毒RNA经Lipofectamine2000己成功转染至Hela细胞中，并在Hela细胞中发生了复制。2.Real-TimePCR检测Hela细胞T病毒衣壳蛋白(T-CP)正负链RNA相对量1)T病毒RNA经Lipofectamine2000转染至Hela细胞后，分别于6h、24h、48h、72h、96h收集Hela细胞，通过Real-TimePCR检测Hela细胞T病毒CP的正负链RNA的相对量。2)具体实验步骤如下用Trizol试剂提取在不同时段(6h、24h、48h、72h、96h)收集的Hela细胞总RNA，以T病毒CP反向引物(5'TTAAGTTGCAGGACCAGAGG3')为引物，按MBI公司逆转录试剂盒的说明合成cDNA。实时定量PCR以SYBRGreenI为荧光标记，并用ABIPRISM7700系统检测，每一个PCR循环中产生的荧光信号为实时定量PCR提供信息。特异性引物序列为T病毒CP正向引物(5TCGTGTTCTTGTCATCAGCGTGGG3，)和反向引物(5'GCCACCGTTGCGTCGTCTACTCT3,)，Actin正向引物(5'TCACCCACACTGTGCCCCATCTACGA3')和反向引物(5'CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3')。反应体系为Template(反转录产物即分别加入T病毒衣壳蛋白基因正反向引物、Oligo(dT),s进行逆转录得到的cDNA)4^1，10xTaqBuffer(NH4S04)5^1，MgCl23nl,2.5mM證Pmix5pl，Forwardprimer(25,2^1Reverseprimer(25pM)2^1，Taq酶(5u4d)2pl，ddH2027pl。反应条件为94。C预变性5min;94°C45sec，53。C45see,72°C45sec，35个循环;最后于72。C延伸5min。Actin为内参照。3)如图3所示，左图为转染后Hela细胞内T病毒CP正链RNA相对量，6h、24h、48h、72h、96h分别是对应时间段收集的Hela细胞，结果如图所示，不同时间段的Hela细胞均表达T病毒CP正链RNA，并且相对于其它时间段来说，48h的Hela细胞尤其高表达T病毒CP正链RNA;右图为转染后Hela细胞9内T病毒CP负链RNA相对量，6h、24h、48h、72h、96h分别是对应的时间段收集的Hela细胞。结果如图所示，随着时间的延长，转染T病毒RNA的Hela细胞内T病毒CP负链RNA相对量表达逐渐增多，96hHela细胞达到高峰。此结果从定量核酸水平证实了成功转染至Hela细胞中的T病毒在恶性肿瘤细胞Hela细胞中发生了复制，并且随着时间的推移Hela细胞内T病毒正负链RNA相对量逐渐增多。3.通过Westernblot检测Hela细胞内T病毒衣壳蛋白(CP)的蛋白水平变化1)T病毒RNA经Lipofectamine2000转染至Hela细胞后，对其CP的蛋白量做了相应检测，具体步骤如下A.SDS-PAGE:配制12n/。SDS-PAGE胶，将蛋白质预染Marker及处理好的蛋白样品上清液(裂解Hela细胞得到的样品)上样，电泳;B.转膜:将电泳后的凝胶铺于电转缓冲液浸泡过的滤纸上，胶上覆盖PVDF膜，赶尽胶与膜之间的气泡，按从电泳槽负极到正极的顺序依次为滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸；连接电源，4°C，200mA，转膜60min;C.封闭加入含5%(W/V)脱脂奶粉的PBST溶液浸泡PVDF膜，37°C，lh;然后倒掉封闭溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，约30min;D.—抗加入用5n/。(W/V)脱脂奶粉的PBST溶液按适当比例稀释的一抗溶液覆盖PVDF膜，37°C，lh;然后倒掉封闭溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，约30min;E.二抗加入用5。/。(W/V)脱脂奶粉的PBST溶液按适当比例稀释的二抗溶液覆盖PVDF膜，37°C，lh;然后倒掉封闭溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，约30min;F.检测加入DAB显色试剂盒中的试剂，室温放置5min，放入到暗处，待膜显色5min，观察显影情况。2)结果如图4所示，N指未经转染的Hela细胞，作为正常对照，；a、b分别为转染后于24h、48h收集的Hela细胞CP蛋白量。实验结果显示未转染T病毒RNA的正常Hela细胞内不表达CP基因，转染T病毒RNA24h、48h后，Hela细胞内可以检测到CP的表达。结果说明T病毒能够在Hela细胞中表达T病毒CP。4.利用免疫荧光检测Hela细胞内CP的表达情况1)T病毒RNA经Lipofectamine2000转染至Hela细胞，将细胞培养48h后通过细胞免疫荧光技术对其CP进行检测，以未转染T病毒RNA的正常Hela细胞为对照。2)具体步骤如下A.将无菌盖玻片置于24孔板中；B.胰酶消化细胞，接种与24孔板，每孔lml，封口膜封盖37。C培养24h;C.用PBS洗板3次，每次5min;D.4%甲醛室温下固定30min;E.PBS洗3次，每次5min;F.0.2%TritonX-100透膜4min;G.PBS洗3次，每次5min;H.用PBS配制5%BSA，封闭30min;I.—抗兔抗人抗体，2.5mg/ml，分别用1%BSA按1:25、1:50、1:100、1:200稀释，每个浓度加入3个孔，每孔400^,最后两孔加等量PBS，作为阴性对照，细胞培养板放入湿盒，4。C过夜；J.移去一抗，PBS洗3次，每次5min;K.二抗FITC标记的抗兔IgG，按1:50、1:100、1:200稀释，分别加入一抗的三个孔内，每孔的一抗、二抗浓度如下表；L.37°C，避光共孵育lh;M.避光条件下移去二抗，PBS洗3次；N.取出盖玻片，置于载玻片上，50%甘油封片，荧光显微镜下观察；二抗<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1:一抗/二二抗浓度表3)通过效价检测发现B3最佳，I-抗浓度为1:50，II-抗浓度为1:200。如图5所示，A为未转染的正常对照；B-D为转染T病毒48h的Hela细胞；C为光镜下；B、D中箭头所示为CP-FITC染色绿色，Barl0pm;实验结果显示，转染T病毒RNA后，CP在大多数Hda细胞中都有较强表达，CP位于特定位点(图-5B)，而并非弥散整个细胞浆；CP与自噬体位置密切相关(图-5D)。说明T病毒RNA能够在人类Hela细胞中表达蛋白，并与自噬密切相关。5.通过透射电子显微镜检测转染T病毒Hela细胞内子代病毒粒体的复制情况1)T病毒RNA经Lipofectamine2000转染48h小时后收集Hela细胞，用透射电子显微镜观察48h的Hela细胞内子代病毒粒体的复制情况。具体步骤如下:A.PBS洗涤细胞2次；B.离心(1000rpm,5min)，小心弃上清，EP管底细胞沉淀保留；C.4。C预冷细胞固定剂(2.5%戊二醛)300^1,沿管壁缓缓加入；D.送医学院结构中心电镜室包埋制片。2)结果如图6所示，A为未转染的正常Hela细胞作对照；B-C为电镜下在转染T病毒后48h的Hela细胞中发现的子代病毒颗粒，如红色箭头所示。6-B中Bar500nm，6-C中Bar200nm。结果更一歩说明T病毒RNA成功转染至Hela细胞后，在Hela细胞除表达T病毒基因组核酸与蛋白外，并且还进一步合成子代病毒完整颗粒，证实T病毒在人类Hek细胞内确实发生了复制。以上5个实验结果，均是证明T病毒在恶性肿瘤细胞中的生物学行为，说明植物病毒T病毒可以转染进入恶性肿瘤细胞中，并且利用人类宿主细胞(Hela)的酶系统、原料和能量复制T病毒的核酸，借助宿主细胞的核糖体翻译T病毒衣壳蛋白(CP)，并合成了完整的子代病毒颗粒。四、检测T病毒转染至Hela细胞后诱导其发生的自噬情况1.通过光镜和扫描电镜观测Hela细胞中的自噬泡1)T病毒RNA经Lipofectamine2000转染Hela细胞后，用光镜和扫描电镜制片观察细胞自噬的形态学变化。具体歩骤如下A.PBS洗涤细胞2次；B.离心(1000rpm，5min)，小心弃上清，EP管底细胞沉淀保留；C.4°C预冷细胞固定剂(2.5%戊二醛)300^1，沿管壁缓缓加入；D.送医学院结构中心电镜室包埋制片。2)经Lipofectamine2000将T病毒转染RNA至Hela细胞后，收集72h的Hela细胞分别在光镜和电镜下进行观测，如图7所示，A、B分别为正常Hela细胞在光镜和电镜下的正常形态；C为光镜下转染T病毒72h后的Hela细胞，箭头所示的为细胞胞浆中出现的自噬空泡，Barl(Him;D为电镜下转染T病毒的Hda细胞中出现的自噬泡结构，Bar20mn，右图为局部放大图；结果显示相对于正常细胞来说，转染T病毒72h后，Hela细胞出现典型的自噬现象。光镜下细胞浆区域可见大量空泡样结构(图7-C)，电镜显示空泡为双层膜，泡腔内存在膜样或絮样物质(图7-D)，推测为胞内代谢、降解成分。说明经脂质体包裹的T病毒可诱导人类Hela细胞发生了很明显的自噬现象，这是一种诱导细胞走向死亡途径的n型凋亡。2.通过RT-PCR检测Hela细胞中自噬基因Beclin-l的表达水平1)当T病毒转染至Hela细胞后，通过检测细胞中自噬基因Beclin-l的12核酸水平来观察其自噬效应的变化情况。2)具体步骤如下分别收集转染后不同时间点(0、6h、24h、48h、72h、)的Hela细胞，用Trizol试剂抽提细胞总RNA。得到Hela细胞总RNA后，以Oligo(dT)w为逆转录时引物，按逆转录试剂盒的说明合成cDNA，再用PCR试剂盒，以cDNA为模板，分别以基因Beclin-l正向引物(5，ATACCGACTTGTTCCTTAC3')和反向引物(5'GTCTTCAATCTTGCCTTT3，)，基因Actin正向引物(5，TCACCCACACTGTGCCCCATCTACGA3')和反向引物(5'CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3')扩增目的DNA。反应体系为Template(反转录产物即加入01igo(dT)18进行逆转录得到的cDNA)4^1，10xTaqBuffer(NH4S04)5^1，MgCl23(xl，2.5mMdNTPmix5^1，Forwardprimer(25pM)2plReverseprimer(25^iM)2pl，Taq酶(5u^l)2pl，ddH2027nl。反应条件为94。C预变性5min;94°C45see,51。C45sec，72°C45see,35个循环;最后于72°C延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖电泳检测。3)如图8所示，相对应的条带分别为转染后Oh、24h、48h、72h收集的Hela细胞基因Beclin-l的RT-PCR的结果；SF(Serumfree)为无血清时饥饿培养诱导细胞自噬，作为阳性对照；Actin为内参基因Actin的RT-PCR结果；M为Marker;结果显示，Hela细胞内自噬标志分子表达显著增加，T病毒RNA转染至细胞后6h即可检测到显著增多的Bclin-lmRNA，高水平表达持续到72h。自噬基因Beclin-l的高表达可抑制恶性肿瘤细胞(Hela)的增殖，并诱导其凋亡。3.通过Westernblot检测Hda细胞自噬基因的蛋白水平变化1)T病毒RNA经Lipofectamine2000转染至Hela细胞后，分别收集不同时间点(0、6h、24h、72h)的Hela细胞并对其Beclin-l的蛋白量做了相应检测，具体步骤如下A.SDS-PAGE:配制12%SDS-PAGE胶，将蛋白质预染Marker及处理好的蛋白样品上清液(裂解Hela细胞得到的样品)上样，电泳；B.转膜将电泳后的凝胶铺于电转缓冲液浸泡过的滤纸上，胶上覆盖PVDF膜，赶尽胶与膜之间的气泡，按从电泳槽负极到正极的顺序依次为滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸；连接电源，4°C，200mA，转膜60min;C.封闭加入含5n/。(W/V)脱脂奶粉的PBST溶液浸泡PVDF膜，37°C，lh;然后倒掉封闭溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，约30min;D.—抗加入用5。/。(W/V)脱脂奶粉的PBST溶液按适当比例稀13释的一抗溶液覆盖PVDF膜，37°C,lh;然后倒掉封闭溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，约30min;E.二抗加入用5。/。(W/V)脱脂奶粉的PBST溶液按适当比例稀释的二抗溶液覆盖PVDF膜，37°C，lh;然后倒掉封闭溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，约30min;F.检领!l:加入DAB显色试剂盒中的试剂，室温放置5min，放入到暗处，待膜显色5min，观察显影情况。2)如图9所示，相对应的条带分别为转染后Oh、24h、48h、72h收集的Hela细胞中自噬基因Beclin-l的蛋白量；SF(Serumfree)为无血清时饥饿培养诱导细胞自噬，作为阳性对照；Actin为内参基因Actin;M为Marker;实验结果显示转染T病毒RNA的Hela细胞自噬基因Beclin-l蛋白量高表达，并且持续了72h。五、通过RT-PCR检测诱导Hela细胞自噬的核心因素1)利用RT-RCR检测各处理组Hela细胞内Beclin-l-mRNA，首先分别收集单加T病毒RNA的Hela细胞(RNA，R)、单加Lipofectamine2000的Hela细胞(Upofectine2000,L)、以及经Lipofectamine2000转染T病毒RNA的Hela细胞(RNA+lipofectine2000，RL)、无任何处理的Hela细胞，并提取其总RNA，进行PCR检测，具体操作步骤见四-2。2)如图10所示，M为marker;SF(Serumfree)为无血清时饥饿培养诱导细胞自噬，作为阳性对照；Blank为无处理Hda细胞；Lip为脂质体转染(RL，RNA+Lip;R，RNA;L，Lip);结果显示脂质体处理细胞组(L)，没有明显Beclin-l表达，提示不能诱发自噬；细胞外裸露T病毒RNA(R)、紫外绵处理失活病毒也没有明显Beclin-l表达，提示不能诱导细胞自噬。只有转染Ti毒RNA的细胞组、有活性的完整T病毒颗粒细胞组(RL)，可显著诱导Beclin-l表达，提示诱导Hela细胞出现自噬的核心因素是病毒的核酸。六、检测T病毒转染至Hela细胞后诱导其发生凋亡的情况1)T病毒RNA经Lipofectamine2000转染至Hela细胞，分别收集不同时间点(24h、48h)的Hela细胞后进行AnnexinV/PI染色利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。根据AnnexinV/PI染色试剂盒说明书，操作步骤如下A.收集细胞约l-5xl()5个/ml，离心(500-1000rpm，5min)，弃培养液；B.3mlPBS洗涤2次；C.配制1Xannexin-bindingbuffer(将试剂盒中5Xannexin-bindingbuffer稀释四倍)；D.离心(500-1000rpm，5min)，去PBS，加入500^1配好的1Xannexin-bindingbuffer,重悬细胞；E.加入5^1AnnexinV-FITC和10plPI染液，室温孵育5min;F.流式细胞仪检测。2)如图11所示，A为正常对照组；B为单加Lipofectamine2000的Hela细胞(lipofectine2000，L);C-D分别为经Lipofectamine2000转染T病毒RNA后24h、48h的Hela细胞。结果显示，随转染时间的延长，T病毒可诱导Hela细胞发生明显的凋亡。以上实验结果分别从核酸、蛋白水平检测经脂质体包裹的T病毒RNA转染至恶性肿瘤细胞(Hela)后，在Hda细胞中发生复制并组装合成子代病毒颗粒，进一歩在肿瘤细胞内高表达自噬基因Beclin-l，诱导肿瘤细胞发生自噬，最终导致肿瘤细胞发生凋亡，抑制了肿瘤细胞的恶性增殖。利用这一特性，将T病毒包装成脂质体药物制剂运送至实体瘤内可最终诱导肿瘤细胞发生自噬与凋亡，发挥抑制肿瘤细胞生长的作用，阻止肿瘤的恶性进程。权利要求1.植物病毒在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。2.根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述植物病毒为烟草花叶病毒。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述恶性肿瘤为由病毒感染引起的恶性肿瘤。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述恶性肿瘤为由人乳头瘤病毒引发的宫颈癌。5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述药物以载体形式增进植物病毒的输入。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述药物为脂质体药物制剂。全文摘要本发明涉及生物医学领域，更具体地说是涉及植物病毒在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。本发明是以研究跨生物界远缘病毒入侵为出发点，以引导治疗肿瘤的新方向为目标，首次将植物病毒(烟草花叶病毒)成功转染至恶性肿瘤细胞(Hela)中，在肿瘤细胞内发生了复制并且诱导了肿瘤细胞发生自噬与凋亡。本发明可作为恶性肿瘤基因治疗的一个新手段，为恶性肿瘤的治疗开创一个新局面。文档编号A61K35/66GK101653462SQ20091006337公开日2010年2月24日申请日期2009年7月28日优先权日2009年7月28日发明者何玉玲,瑞周,杰李,莉李,俐王,岚王,威肖,肖睿景,谭锦泉申请人:武汉大学