专利名称：一种别藻蓝蛋白标记的荧光抗抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)标记的荧光抗抗体的制备 方法，属于免疫荧光检测领域。
背景技术：
免疫荧光检测法是一种历史悠久的标记分析法，兼具抗原、抗体反应的特异性及 荧光检测的灵敏性，广泛应用于疾病检测和生物学研究中。免疫荧光检测法的特异性和敏 感性依赖于荧光染料、抗体及荧光探针的属性和质量。实际应用时，由于血清和其他生物样 品发射波长为400-600nm的本底荧光，与常用的FITC等传统荧光染料的荧光发射光谱重 叠，严重降低荧光检测的灵敏度，造成一段时期内荧光检测法发展缓慢。藻胆蛋白是存在于红藻和蓝藻细胞中的一类水溶性的色素蛋白的总称，是藻类捕 光天线复合物的重要组成部分，能够高效捕获并传递光能。藻胆蛋白分为藻红蛋白(PE)、 藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)和藻红蓝蛋白(PEC)四大类，具有水溶性大、无毒性、稳 定性好、荧光量子产率高、斯托克位移大、荧光明亮、荧光不易淬灭等优点，是优秀的荧光染 料。藻胆蛋白应用于荧光检测，极大地提高了荧光检测的灵敏度，促使多色荧光检测和能量 共振转移(FRET)荧光探针检测成为现实。别藻蓝蛋白(APC)的稳定态为(α β )3，分子量约为IlOkDa, Amax = 620_650nm， Em = 660nm，摩尔消光系数为7 X IO5CnT1M-1,荧光量子产率为68%。APC是藻胆蛋白中发射 荧光波长最大的一类，能够发射明亮的红色荧光，极易与生物质本底的蓝色或绿色荧光区 分，因此APC几乎不受生物质本底荧光影响，荧光检测灵敏度明显提高，APC的检测灵敏度 是cy5的7倍。APC是少有的长波长发射的荧光染料，红光激发红光发射，促进了 633nm氦 氖激光器的应用。APC是优秀的发射红色荧光的染料，但由于APC分离纯化困难、稳定性差，蛋白质 交联时难以定量控制，造成APC标记得率低，生产成本高，甚至造成APC失活、荧光丧失，限 制了这一优秀染料在临床检测中的应用。国内外尚没有APC标记荧光抗体应用于动物疫病 检测的报道。本发明采用适宜摩尔比的化学交联剂SPDP分别将APC、抗抗体衍生，然后定量 交联高效制备了 APC标记的荧光抗抗体，可作为通用荧光探针用于鸡或猪传染病的间接免 疫荧光检测。
发明内容
本发明涉及一种别藻蓝蛋白(APC)标记的荧光抗抗体的制备方法。本发明采用的螺旋藻别藻蓝蛋白(APC)是优秀的荧光染料，具有无毒性、水溶性 大、荧光明亮且不易淬灭等特点，检测灵敏度显著高于传统的FITC等荧光染料。APC在荧光 染料中独树一帜，在波长550-650nm的光激发下，APC能发射明亮的红色荧光，是少有的发 射长波长荧光染料，而且APC等红色荧光染料的发现促进了 633nm氦氖激光器在荧光检测 中大量应用。
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APC的组成和晶体结构特点决定了其稳定性低于其它藻胆蛋白，因此交联时控制 使用交联剂的浓度是关键，交联剂浓度不仅影响交联得率还影响荧光特性。本发明选择 SPDP与APC和抗抗体的摩尔比分别为20-50 U50-100 1，衍生后的APC与抗体以摩 尔比1-2 1交联，制备的APC标记的荧光抗抗体交联效率高、纯度高、荧光明亮、抗体活性 好、稳定性好。本发明的解决方案如下别藻蓝蛋白(APC)的制备APC为采用阴离子交换层析法由钝顶螺旋藻 (Spirulina platensis)中分离纯化。纯化步骤为藻体细胞加入5倍体积(v/w)的2OmM 磷酸缓冲液(PH6. 8-7. 0)，反复冻融3次，4°C IOOOOrpm离心，上清液中加入硫酸铵至终浓 度为60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，离心，沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH7)中，用20mM 的磷酸缓冲液(PH7)透析，透析液经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱层析， 离子交换柱经20mM醋酸缓冲液(pH5. 0，含50mM NaCl)预平衡，洗脱液为20mM醋酸缓冲液 (pH3. 6，含50mM NaCl)，洗脱速度为60mL/h，收集天蓝色液体即为纯化的螺旋藻别藻蓝蛋 白。纯化的APC硫酸铵沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除盐，调整浓 度为 5-10mg/mLoAPC标记荧光抗抗体的制备抗抗体(抗鸡IgG抗体、抗猪IgG抗体)购自Sigma 公司，电泳检测纯度达电泳纯，对流免疫电泳法检测抗抗体具有良好的生物学活性，使用时 用PBS透析，调整蛋白浓度为5-10mg/ml。APC与抗抗体的交联采用蛋白质交联法技术，利 用异型双功能交联剂SPDP分别在APC、抗抗体上衍生吡啶二硫基团，然后用DTT还原抗抗体 的衍生物为其引入游离-SH，将携带吡啶二硫基的APC衍生物与携带巯基的抗抗体按一定 摩尔比交联制备荧光抗抗体。SPDP与APC、抗抗体的摩尔比分别为20-50 1,50-100 1， DTT与衍生抗体的摩尔比为50-100 1，SPDP衍生的APC与带-HS的抗抗体再以摩尔比 1-2 1液相交联制备APC标记的荧光抗抗体。APC标记的荧光抗抗体的高效纯化和交联效率分析液相色谱工作站上采用HPLC 法进行荧光抗抗体的纯化和交联效率分析，流动相为50mM pH7. 5的PBS，流速0. 5mL/min, 检测波长190-800nm。采用分子筛高压液相色谱柱纯化，液相柱型号为TSK G3000sw (规格 7. 5mmX60cm)，荧光标记抗抗体最先被洗脱下来(附图1)。收集洗脱峰，进行光谱学、抗体 活性、电泳检测。目标产物的洗脱峰面积占所有洗脱峰面积的比例即为交联得率。APC标记荧光抗抗体的光谱检测吸收光谱在紫外_可见光分光光度计上测定， 扫描波长区间250-700nm。吸收光谱检测可判定交联是否成功及交联反应是否导致APC 变性。室温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，激发波长580·，荧光扫描范围为 600-700nmo APC标记荧光抗抗体在紫外区的吸光度明显高于对照APC，吸收峰位置相同，这 是因为APC表面交联了 280nm有较强的光吸收的抗抗体分子，而在450-700nm区间，交联物 的吸收光谱与APC的吸收峰及吸光度相似，这是因为抗抗体在此范围内无光吸收。APC标记 光抗抗体与对照APC在580nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于660nm，没有发生 斯托克位移改变，仍具有APC的特征荧光发射光谱，且荧光亮度无明显降低(附图2)。APC标记荧光抗抗体的效价检测对流免疫电泳法检测APC标记荧光抗抗体的免 疫学活性。APC标记荧光抗抗体与鸡IgG形成天蓝色免疫沉淀线，不用染色就可清晰地观察 到沉淀线的位置(附图3)。天蓝色免疫沉淀线的形成进一步说明抗抗体与APC交联成功，同时也说明交联反应对抗抗体的免疫学活性影响不大，交联物仍保留较高的抗体活性。APC标记荧光抗抗体的电泳检测=SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分 离胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓度为5%，218V恒压电泳。用0. 25% (w/v)考马斯亮蓝R-250 染色，脱色后观察结果。SDS-PAGE电泳发现APC标记荧光抗抗体既具有APC的α、β亚基 条带，又具有抗体的H、L链条带(附图4)，电泳结果证实APC与抗抗体交联成功。APC标记荧光抗抗体的稳定性检测纯化的APC标记荧光抗抗体中加入0. 02%叠 氮化钠，4°C避光保存，每隔30天测定一次荧光光谱和抗体效价，观察荧光亮度和抗体活性 的变化。研制的APC标记荧光抗抗体在0. 05mol/L的磷酸缓冲液中4°C保存60天，荧光强 度保持不变，随后随着保存时间推移荧光强度缓慢降低，但降幅较小。荧光抗抗体4°C保存 90天抗体效价维持在5Log 2，随后抗体效价随保存时间推迟而缓慢降低(附图5)。总之，APC标记荧光抗抗体发射明亮红色荧光，4°C保存60天荧光亮度和抗体活性 无衰减，可作为通用荧光探针用于鸡、猪等动物传染病的间接免疫荧光检测，省去了直接免 疫荧光检测时需要针对每种病原制备荧光标记抗体的麻烦，采用间接免疫荧光抗体即可方 便地进行鸡、猪等畜种的传染病的病原的免疫荧光检测，而且抗抗体可具有信号放大功能。
附图1为APC标记抗鸡IgG荧光抗抗体的HPLC纯化图。液相柱型号为TSK G3000sw，流动相为50mM pH7. 5的PBSr1^iI 0. 5mL/min,APC标记荧光抗抗体的洗脱时间为 19. 57min，抗抗体和APC的洗脱时间分别为27. 32,31. 26min。附图2为APC标记抗鸡IgG荧光抗抗体(虚线)及对照APC(实线)的吸收光谱 (A)和荧光光谱(B)。APC标记荧光抗抗体在紫外区的吸光度明显高于对照APC，吸收峰位 置相同，在450-700nm区间，交联物的吸收光谱与APC的吸收峰及吸光度相似。APC标记荧 光抗抗体与对照APC在580nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于660nm，没有发生 斯托克位移改变，仍具有APC的特征荧光发射光谱，且荧光亮度无明显降低。附图3为APC标记抗鸡IgG荧光抗抗体与鸡IgG的对流免疫电泳。APC标记荧光 抗抗体与鸡IgG形成天蓝色免疫沉淀线，不用染色就可清晰地观察到沉淀线的位置。 附图4为APC标记抗鸡IgG荧光抗抗体的SDS-PAGE电泳。APC标记荧光抗抗体既 具有APC的α、β亚基条带，又具有抗体的H、L链条带。附图5为不同保存时间的APC标记抗鸡IgG荧光抗抗体的荧光亮度(A)和抗体活 性⑶。APC标记荧光抗抗体在0. 05mol/L的磷酸缓冲液中4°C保存60天，荧光强度保持不 变，随后随着保存时间推移荧光强度缓慢降低。荧光抗抗体4°C保存90天抗体效价维持在 5Log 2，随后抗体效价随保存时间推迟而缓慢降低。
具体实施例方式实施方式1 :APC标记的抗鸡IgG荧光抗抗体的制备方法别藻蓝蛋白(APC)的制备APC由钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)中分 离纯化。藻体细胞加入5倍体积(V/w)20mM磷酸缓冲液(pH6. 8-7.0)，反复冻融3次， 40C IOOOOrpm离心，上清液中加入硫酸铵至终浓度为60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，离心， 沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH7)中，20mM的磷酸缓冲液(pH7)透析，透析液上DEAE
5Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱层析，离子交换柱经20mM醋酸缓冲液(pH5. 0，含 50mM NaCl)预平衡，洗脱液为20mM醋酸缓冲液(pH3.6，含50mM NaGl)，洗脱速度为60mL/ h，收集天蓝色液体即为纯化的螺旋藻别藻蓝蛋白。纯化的螺旋藻APC纯度达电泳纯，纯度 指数A650A280 >5，结构式为(α β)3，分子量约为IlOkDa,最大吸收峰位于650歷，620歷处 有一肩峰，室温荧光发射峰位于660nm，纯化的APC硫酸铵沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除盐，调整浓度为5-10mg/mL。APC标记抗鸡IgG荧光抗抗体的制备抗鸡IgG抗体购自Sigma公司，用20mM磷酸 缓冲液(PH6. 8-7. 0)透析，调整抗体浓度为8mg/mL。交联过程为准确称取SPDP，以DMSO 溶解配制SPDP母液。将SPDP按摩尔比分别为50 UlOO 1与APC、抗鸡IgG抗体混勻， 铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。取DTT按100 1的摩尔比 与抗抗体衍生物充分混勻，室温静置反应lh，超滤离心除去多余的DTT。抗抗体-HS与APC 衍生物以摩尔比1 2混勻，铝箔封好后于20-25°C振荡反应20h。用10mg/ml的NEM溶液 20ul封闭多余巯基，室温旋转反应60min。反应中的NEM不用除去。APC标记抗鸡IgG荧光抗抗体的纯化和交联效率分析液相色谱工作站上采 用HPLC法分析交联效率和纯化，流动相为50mM PBS pH 7. 5，流速0. 5mL/min,检测 波长190-800nm。采用分子筛高压液相色谱柱纯化，液相柱型号TSK G3000sw(规格 7. 5mmX60cm)。洗脱顺序依次为荧光抗抗体、游离的抗抗体、游离的APC，洗脱时间分别出现 在19. 57,27. 32,31. 26min(附图1)。收集19. 57min出现的洗脱峰，即为APC标记抗鸡IgG 荧光抗抗体。第一个洗脱峰的面积占所有洗脱峰面积的比例即为交联效率，本法制备的荧 光抗抗体的交联效率为92%。APC标记荧光抗抗体的光谱检测吸收光谱在紫外_可见光分光光度计上测定，扫 描波长区间250-700nm。室温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，激发波长580nm，荧 光扫描范围为600-700nm。在紫外区，APC标记荧光抗抗体的吸光度明显高于对照APC，吸 收峰位置相同，这是因为APC表面交联了抗抗体分子，而抗抗体在280nm有较强的光吸收； 450-600nm范围内，交联物的吸收光谱与对照APC的吸收峰位置及吸光度无差别，因为抗抗 体在此范围内无光吸收。通过吸收光谱检测可判定交联成功，同时交联反应没有导致APC 变性。APC标记荧光抗抗体与对照APC在580nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于 660 nm，具有APC的特征荧光发射光谱，没有发生斯托克位移的改变，且荧光亮度无明显降 低(附图2)。APC标记荧光抗抗体的效价检测对流免疫电泳法检测APC标记荧光抗抗体的免 疫学活性。取10-15mL熔化的的离子琼脂(0.03M pH 8. 6的巴比妥缓冲液配制)趁热 倒在电泳板槽中，待冷却后打孔。孔直径约为4mm，孔间距约为5mm。打孔后在酒精灯上烘 烤背面，使琼脂层与电泳板贴紧。用生理盐水稀释鸡IgG为0. 5mg/mL,吸取20_40uL注于 正极端各孔；用生理盐水稀释APC标记荧光抗抗体成lmg/mL，吸取20_40uL，注于负极端孔 中。在电泳板正、负电极端与电极槽缓冲液间用滤纸搭桥，150V稳压电泳4h。APC标记荧光 抗抗体与鸡IgG形成天蓝色免疫沉淀线，不用染色就可清晰地观察到沉淀线的位置(附图 3)。天蓝色免疫沉淀线的形成，进一步说明抗抗体成功地与APC进行了交联，同时也说明交 联反应对抗抗体的免疫学活性影响不大，交联物仍然保留较高的抗体活性。APC标记荧光抗抗体的电泳检测=SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分离胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓度为5%，218V恒压电泳，用0. 25% (w/v)考马斯亮蓝R-250 染色。APC标记荧光抗抗体既具有APC的α、β亚基条带，又具有抗体的H、L链条带(附 图4)，电泳结果证实APC与抗抗体交联成功，且纯度达电泳纯。APC标记荧光抗抗体的稳定性检测纯化的APC标记荧光抗抗体中加入0. 02 %叠 氮化钠，4°C避光保存，每隔30天测定一次荧光光谱和抗体效价，观察荧光亮度和抗体活性 的变化。研制的APC标记荧光抗抗体在0. 05mol/L的磷酸缓冲液中4°C保存60天，荧光抗 抗体的荧光强度保持不变，随后随着保存时间推移荧光强度缓慢降低，但降幅较小。4°C保 存90天，荧光抗抗体的抗体效价维持在5Log 2，然后抗体效价随着保存时间延长而缓慢降 低(附图5)。实施方式2 =APC标记的抗猪IgG荧光抗抗体的制备方法别藻蓝蛋白(APC)的制备APC由钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)中分 离纯化。藻体细胞加入5倍体积(V/w)20mM磷酸缓冲液(pH6. 8-7.0)，反复冻融3次， 40C IOOOOrpm离心，上清液中加入硫酸铵至终浓度为60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，离心， 沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH7)中，20mM的磷酸缓冲液(pH7)透析，透析液上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱层析，离子交换柱经20mM醋酸缓冲液(pH5. 0，含 50mM NaCl)预平衡，洗脱液为20mM醋酸缓冲液(pH3.6，含50mM NaCl)，洗脱速度为60mL/ h，收集天蓝色液体即为纯化的螺旋藻别藻蓝蛋白。纯化的螺旋藻APC纯度达电泳纯，纯度 指数A650A280 >5，结构式为(α β)3，分子量约为IlOkDa,最大吸收峰位于650歷，620歷处 有一肩峰，室温荧光发射峰位于660nm，纯化的APC硫酸铵沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除盐，调整浓度为5-10mg/mL。APC标记抗猪IgG荧光抗抗体的制备抗猪IgG抗体购自Sigma公司，用20mM磷 酸缓冲液(PH6. 8-7. 0)透析，调整抗体浓度为10mg/mL。以DMSO溶解SPDP配制SPDP母液， 现配现用。将SPDP按摩尔比分别为50 1,60 1与APC、抗猪IgG抗体混勻，铝箔封好后 于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。取DTT按60 1的摩尔比与抗抗体衍生 物充分混勻，室温静置反应lh，超滤离心除去多余的DTT。抗抗体-HS与APC衍生物以摩 尔比1 1混勻、液相交联，铝箔封好后于20-25°C振荡反应20h。用10mg/ml的NEM溶液 20ul封闭多余巯基，室温旋转反应60min。反应中的NEM不用除去。APC标记抗猪IgG荧光抗抗体的纯化和交联效率分析液相色谱工作站上采 用HPLC法进行交联效率分析和纯化，采用分子筛高压液相色谱柱纯化，液相柱型号TSK G3000sw(规格 7. 5mmX60cm)，流动相为 50mM PBS pH 7. 5，流速 0. 5mL/min，检测波长 190-800nm。洗脱顺序依次为荧光抗抗体、游离的抗抗体、游离的APC，洗脱曲线与APC标记 的抗鸡IgG荧光抗抗体(附图1)基本一致，洗脱峰分别出现在19. 57,27. 32,31. 26min。这 是由于抗鸡IgG抗体与抗猪IgG抗体分子量相同。收集19. 57min出现的洗脱峰，即为APC 标记抗猪IgG荧光抗抗体。第一个洗脱峰的面积占所有洗脱峰面积的比例即交联效率为 90%。APC标记抗猪IgG荧光抗抗体的光谱检测吸收光谱在紫外_可见光分光光度计 上测定，扫描波长区间250-700nm。室温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，激发波长 580nm，荧光扫描范围为600-700nm。光谱检测结果与附图2相同。APC标记荧光抗抗体在紫 外区的吸光度高于对照APC，吸收峰位置相同；450-600nm范围内，交联物的吸收光谱与APC
7的吸收峰及吸光度无差别。通过吸收光谱检测可判定交联成功，且交联反应没有导致APC 变性。APC标记荧光抗抗体与对照APC在580nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于 660nm,没有发生斯托克位移的改变，仍具有APC的特征荧光，且荧光亮度无明显降低。APC标记抗猪IgG荧光抗抗体的效价检测取10_15mL熔化的的离子琼脂 (0. 03MpH 8.6的巴比妥缓冲液配制)趁热倒在电泳板槽中，待冷却后打孔。孔直径约为 4mm，孔间距约为5mm。打孔后在酒精灯上烘烤背面，使琼脂层与电泳板贴紧。用生理盐水 稀释鸡IgG为0. 5mg/mL,吸取20_40uL注于正极端各孔；用生理盐水稀释APC标记抗猪IgG 荧光抗抗体为lmg/ml，吸取20-40uL，注于负极端孔中。在电泳板正、负电极端与电极槽缓 冲液间用滤纸搭桥，接通电源，150V稳压电泳4h。APC标记抗猪IgG荧光抗抗体与猪IgG抗 体同样形成天蓝色免疫沉淀线，不用染色就可清晰地观察到沉淀线的位置。免疫沉淀线的 形成说明抗抗体与APC交联成功，同时交联物仍然保留较高的抗体活性。APC标记抗猪IgG荧光抗抗体的电泳检测=SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上 进行，分离胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓度为5%。218V恒压电泳，用0. 25% (w/v)考马斯亮 蓝R-250染色，脱色后观察结果。SDS-PAGE电泳发现APC标记荧光抗抗体既具有APC的α、 β亚基条带，又具有抗体的H、L链条带，表明APC与抗猪IgG抗体交联成功。APC标记抗猪IgG荧光抗抗体的稳定性检测纯化的APC标记荧光抗抗体中加入 0. 02%叠氮化钠，4°C避光保存，每隔30天测定一次荧光光谱和抗体效价。APC标记抗猪IgG 荧光抗抗体稳定性与APC标记抗鸡IgG荧光抗抗体相近，4°C保存60天荧光强度保持不变， 随后缓慢降低；4°C保存90天，荧光抗抗体的抗体效价维持在5Log2，然后随着保存时间延 长而缓慢降低。
权利要求
一种别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)标记的荧光抗抗体的制备方法，包括阴离子交换层析法分离纯化螺旋藻APC，分别用摩尔比为20 50∶1、50 100∶1的化学交联剂SPDP将APC、抗抗体衍生，抗抗体的SPDP衍生物经摩尔比50 100∶1的DTT还原获得带 HS的抗抗体，带 HS的抗抗体与APC的SPDP衍生物以摩尔比1∶1 2液相交联，经HPLC纯化制备出荧光抗抗体，制备的荧光抗抗体得率高、纯度高、稳定性好、荧光呈明亮的红色，可作为通用荧光探针用于鸡、猪传染病的快速免疫荧光检测。
2.根据权利要求1的方法，其中APC由钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)中分离纯 化，制备过称为藻体细胞加入5倍体积(v/w) 20mM磷酸缓冲液(pH6. 8 7. 0)，反复冻融 3次，4°C IOOOOrpm离心，上清液中加入硫酸铵至终浓度为60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，离 心，沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH7)中，20mM的磷酸缓冲液(pH7)透析，透析液经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析纯化，离子交换柱经20mM醋酸缓冲液(pH5. 0，含 50mM NaCl)预平衡，洗脱液为20mM醋酸缓冲液(pH3.6，含50mM NaCl)，洗脱速度为60mL/ h，收集天蓝色液体即为纯化的螺旋藻别藻蓝蛋白，纯化的螺旋藻APC纯度达电泳纯，纯度 指数A650A280 >5，结构式为(α β)3，分子量约为IlOkDa,最大吸收峰位于650nm，在620nm 处有一肩峰，室温荧光发射峰位于660nm，纯化的APC硫酸铵沉淀4°C避光保存，使用前用 50mM pH7. 5PBS充分透析除盐，调整浓度为5_10mg/mL。
3.根据权利要求1的方法，其中抗抗体为抗鸡IgG抗体、抗猪IgG抗体，购自Sigma公 司，电泳检测纯度达电泳纯，对流免疫电泳法检测抗抗体具有良好的生物学活性，使用时用 PBS透析，调整蛋白浓度为5-10mg/ml。
4.根据权利要求1的方法，其中荧光抗抗体采用化学交联法在液相体系中交联制备， 制备步骤为调整APC、抗抗体的浓度为5-10mg/ml，以DMSO准确配制SPDP母液，分别用双 功能化学交联剂SPDP衍生APC、抗抗体，SPDP与APC、抗抗体的摩尔比分别为20-50 1、 50-100 1，混勻、铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。取DTT按 50-100 1的摩尔比与抗抗体衍生物充分混勻，室温静置反应lh，超滤离心除去多余的 DTT,抗抗体-HS与APC衍生物以摩尔比1 1-2混勻，铝箔封好后于20_25°C振荡反应20h。 加NEM封闭多余巯基，室温旋转反应60min。
5.根据权利要求1的方法，其中荧光抗抗体经HPLC纯化，纯化在液相色谱工作站上进 行，液相柱型号 TSK G3000SW (规格 7. 5mmX 60cm)，流动相为 50mM pH 7. 5PBS，流速 0. 5ml/ min，检测波长190-800nm，收集洗脱19. 57min出现的产物峰，经光谱、电泳、抗体活性检测 合格置4°C避光保存。
全文摘要
本发明涉及一种别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)标记的荧光抗抗体的制备方法。制备过程包括阴离子交换层析法分离纯化螺旋藻APC，用化学交联剂SPDP分别将APC、抗抗体衍生，两种衍生物再以适宜摩尔比液相交联，经高压液相色谱纯化制备出APC标记的荧光抗抗体。本发明制备的荧光抗抗体交联效率高、纯度高、红色荧光明亮、稳定性好、灵敏度高，可作为通用荧光探针用于鸡、猪等动物传染病的间接免疫荧光检测。
文档编号C07K14/405GK101980019SQ20101028433
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者吕爱杰, 姚强, 朱丽萍, 赵守山, 颜世敢 申请人:颜世敢