一种增强ICG单线态氧产量的方法及ICG包覆的纳米金颗粒及其制备方法与流程

本发明属于药物化学领域，涉及一种增强icg单线态氧产量的方法及icg包覆的纳米金颗粒及其制备方法。
背景技术：
：吲哚菁绿(icg)是美国食品药物管理局(fda)批准的一种用于临床的近红外成像剂。icg是一种三碳花菁染料，吸收峰和荧光发射峰都在近红外区，由于近红外光的组织穿透深度较大，受背景影响较小，作为一种诊断用试剂在血容量、心输出量、肝功能、视网膜、脉络膜的脉管系统进行诊断时能起到很好的辅助作用。另外，icg可以将光能转化为热能或产生单线态氧，在光热治疗(ptt)和光动力治疗(pdt)中有潜在应用前景(biotechnol.adv.,2016,34,758-789)。icg单体在水中光热稳定性差，导致其光照过程中非单线态光降解途径为主，单线态氧产率低。icg在水中易形成聚集体，可显著增强其光热稳定性；但聚集体产生单线态氧的能力比单体还低，不利于单线态氧相关的应用。目前很多研究都致力于增强icg的稳定性。johnc.kraft等通过疏水相互作用将icg嵌入脂质体中，利用脂质体使icg在水溶液中溶解性增强，进而获得更强的icg荧光，提高了成像效率(biochemistry,2014,53,1275-1283)。leey.等利用两嵌段共聚物包裹icg，同样是通过增强icg的稳定性进而提高了icg单线态氧产量(sci.rep.,2017,7,46688)。liy.等用二氧化硅包裹的金棒通过介孔的吸附作用负载icg，利用二氧化硅增强icg稳定性，并利用金棒吸收截面大的特点减小icg的光降解(acsnano,2014,11,11529-11542)。还有一些研究利用静电相互作用将icg负载在纳米材料中，增强icg稳定性(colloidssurfbbiointerfaces,2015,136,402-412；langmuir,2015,31,6202-6210)，但大部分研究集中在icg的光热效应，光动力治疗的应用较少。主要原因还是由于icg水中的不稳定性以及光降解严重，单线态氧产量很低，如何增强icg的单线态氧产量是icg应用于光动力治疗面临的重要问题。技术实现要素：针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种增强icg单线态氧产量的方法及一种icg包覆的纳米金颗粒及其制备方法，所述增强icg单线态氧产量的方法，增强了其光热稳定性并实现了icg单线态氧产量的增强，所述icg包覆的纳米金颗粒及其制备方法，实现了生物体系中icg的载带和单线态氧产量的增强。为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明目的之一在于提供一种增强icg单线态氧产量的方法，使用正电荷分子孵化icg。所述方法利用带正电荷的表面活性剂分子或阳离子聚电解质通过静电相互作用促进icg形成聚集体从而增强了其光热稳定性并实现了icg单线态氧产量的增强。其中，所述孵化为将几种组成加入同一溶液中混匀后置于适宜温度水浴中放置。作为本发明优选的技术方案，所述正电荷分子包括阳离子表面活性剂和/或正电荷聚电解质。优选地，所述阳离子表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵和/或十六烷基三甲基氯化铵。优选地，所述正电荷聚电解质为聚二烯丙基二甲基氯化铵。作为本发明优选的技术方案，所述正电荷分子与icg的摩尔比为(1～100):1，如1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、40:1、50:1、60:1、80:1或100:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。作为本发明优选的技术方案，所述孵化的温度为20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，所述孵化的时间为3～10min，如3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，所述孵化在避光条件下进行。本发明目的之二在于提供一种icg包覆的纳米金颗粒，所述纳米金颗粒由内到外依次包覆正电荷分子层和icg层。本发明所使用的纳米金颗粒为采用本领域技术人员公知的制备方法制备得到，在此不再赘述。其中，所述纳米金颗粒的直径为10～20nm。本发明目的之三在于提供一种icg包覆的纳米金颗粒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)使用正电荷分子孵化纳米金颗粒，得到正电荷分子包覆的纳米金颗粒溶液；(2)将步骤(1)得到的正电荷分子包覆的纳米金颗粒溶液与icg混合，孵化，得到纳米金颗粒负载的icg。作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述正电荷分子与所述纳米金颗粒的摩尔比为(105～106):1，如1×105:1、2×105:1、3×105:1、4×105:1、5×105:1、6×105:1、7×105:1、8×105:1、9×105:1或1×106:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(1)所述孵化的温度为20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(1)所述孵化的时间为3～10min，如3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。9、作为本发明优选的技术方案，当步骤(1)所述正电荷分子为聚二烯丙基二甲基氯化铵时，在步骤(1)前进行步骤(1′)，先使用十六烷基三甲基溴化铵孵化金纳米颗粒，再使用聚苯乙烯磺酸钠孵化金纳米颗粒，得到聚苯乙烯磺酸钠包覆的金纳米颗粒。优选地，步骤(1′)所述十六烷基三甲基溴化铵与所述纳米金颗粒的摩尔比为(1×105～2×107):1，如1×105:1、3×105:1、5×105:1、7×105:1、2×106:1、4×106:1、6×106:1、8×106:1、1×107:1或2×107:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(1′)所述十六烷基三甲基溴化铵孵化的温度为20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(1′)所述十六烷基三甲基溴化铵孵化的时间为3～10min，如3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(1′)所述聚苯乙烯磺酸钠与所述金纳米球的质量摩尔比为(200～20000):1mg/nmol，如200:1、400:1、600:1、1000:1、2000:1、3000:1、5000:1、10000:1、15000:1、18000:1或20000:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(1′)所述孵化的温度为20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(1′)所述孵化的时间大于等于3h，如3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h或10h等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。作为本发明优选的技术方案，当步骤(1)所述正电荷分子为聚二烯丙基二甲基氯化铵时，所述聚二烯丙基二甲基氯化铵与所述金纳米球的质量摩尔比为(200～20000):1mg/nmol，如200:1、400:1、600:1、1000:1、2000:1、3000:1、5000:1、10000:1、15000:1、18000:1或20000:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，当步骤(1)所述正电荷分子为聚二烯丙基二甲基氯化铵时，步骤(1)所述孵化的温度为20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，当步骤(1)所述正电荷分子为聚二烯丙基二甲基氯化铵时，步骤(1)所述孵化的时间大于等于3h，如3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h或10h等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述正电荷分子包覆的icg与纳米金颗粒的摩尔比为(104～105):1，如1×104:1、2×104:1、3×104:1、4×104:1、5×104:1、6×104:1、7×104:1、8×104:1、9×104:1或1×105:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(2)所述孵化的温度为20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(2)所述孵化的时间为3～10min如3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：(1)本发明提供一种增强icg单线态氧产量的方法，所述方法增强了其光热稳定性并实现了icg单线态氧产量的增强；(2)本发明还提供一种icg包覆的纳米金颗粒及其制备方法，所述方法实现了生物体系中icg的载带和单线态氧产量的增强。附图说明图1a是对比例1中激光照射下与未经ctab孵化的icg混合的naa降解的随加光时间变化的消光光谱图；图1b是实施例2中激光照射下与经ctab孵化的icg混合的naa降解的随加光时间变化的消光光谱图；图1c是实施例4中激光照射下与经ctab孵化的icg混合的naa降解的随加光时间变化的消光光谱图；图2是对比例1、对比例2、对比例2在暗态50℃下以及实施例1-4中naa降解量随时间变化图；图3a是实施例5中激光照射下与经ctac孵化的icg混合的naa降解的随加光时间变化的消光光谱图；图3b是实施例6中激光照射下与经pddac孵化的icg混合的naa降解的随加光时间变化的消光光谱图；图3c是对比例3中激光照射下与经pss孵化的icg混合的naa降解的随加光时间变化的消光光谱图；图3d是对比例4中激光照射下与经sds孵化的icg混合的naa降解的随加光时间变化的消光光谱图；图4a是对比例5中经ctab包覆的金纳米球,在808nm激光照射下降解naa的消光光谱图；图4b是实施例11中经ctab和icg包覆的金纳米球,在808nm激光照射下降解naa的消光光谱图；图4c是实施例12中经pddac和icg包覆的金纳米球,在808nm激光照射下降解naa的消光光谱图。具体实施方式为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：naa作为一种还原剂，可以被单线态氧氧化分解，本发明利用naa的降解来间接表示icg单线态氧的产量，通过265nm处naa特征吸收峰的降低计算naa的降解量。各实施例以及对比例中所用试剂和仪器如下所示：四氯金酸(haucl4)、硝酸银(agno3)、十六烷基三甲基氯化铵(ctac)、十二烷基磺酸钠(sds)购自国药集团化学试剂有限公司；硼氢化钠(nabh4)、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、聚苯乙烯磺酸钠(pss)、抗坏血酸(aa)购自alfaaesar；聚二烯丙基二甲基氯化铵(pddac)、抗坏血酸钠(naa)购自sigmaaldrich；硫酸(h2so4)购自北京化工厂；紫外-可见吸收光谱在variancary50上测得，zeta电势在zetasizernanozs上测得。实施例1一种增强icg单线态氧产量的方法：在1ml浓度为5μmicg溶液中加入10μl浓度为1mm的ctab溶液(ctab终浓度为10μm)，在30℃水浴中避光孵化5min后加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。实施例2一种增强icg单线态氧产量的方法：在1ml浓度为5μmicg溶液中加入10μl浓度为5mm的ctab溶液(ctab终浓度为50μm)，在30℃水浴中避光孵化5min后加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。实施例3一种增强icg单线态氧产量的方法：在1ml浓度为5μmicg溶液中加入10μl浓度为10mm的ctab溶液(ctab终浓度为100μm)，在30℃水浴中避光孵化5min后加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。实施例4一种增强icg单线态氧产量的方法：在1ml浓度为5μmicg溶液中加入10μl浓度为50mm的ctab溶液(ctab终浓度为500μm)，在30℃水浴中避光孵化5min后加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。实施例5一种增强icg单线态氧产量的方法：在1ml浓度为5μmicg溶液中加入10μl浓度为50mm的ctac溶液(ctac终浓度为500μm)，在30℃水浴中避光孵化5min后加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。实施例6一种增强icg单线态氧产量的方法：在1ml浓度为5μmicg溶液中加入50μl浓度为20mg/ml的pddac溶液(pddac的终浓度为1mg/ml)，在30℃水浴中避光孵化5min后加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。实施例7一种增强icg单线态氧产量的方法：在1ml浓度为5μmicg溶液中加入10μl浓度为50mm的ctab溶液(ctab终浓度为500μm)，在40℃水浴中避光孵化3min后加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。实施例8一种增强icg单线态氧产量的方法：在1ml浓度为5μmicg溶液中加入10μl浓度为50mm的ctab溶液(ctab终浓度为500μm)，在20℃水浴中避光孵化10min后加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。实施例9一种icg包覆的纳米金颗粒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)取1ml浓度为0.1nm的金纳米球，加入1μl浓度为0.1m的ctab溶液，在30℃水浴中孵化5min，得到ctab包覆的纳米金颗粒溶液；(2)将1ml浓度为0.1nm步骤(1)得到的ctab包覆的纳米金颗粒与10μl浓度为500μm的icg溶液混合，30℃水浴中避光孵化5min，得到纳米金颗粒负载的icg。实施例10一种icg包覆的纳米金颗粒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)取1ml浓度为0.1nm的金纳米球，加入0.1μl浓度为0.1m的ctab溶液，在40℃水浴中孵化3min，得到ctab包覆的纳米金颗粒溶液；(2)将1ml浓度为0.1nm步骤(1)得到的ctab包覆的纳米金颗粒与20μl浓度为500um的icg溶液混合，40℃水浴中避光孵化3min，得到纳米金颗粒负载的icg。实施例11一种icg包覆的纳米金颗粒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)取1ml浓度为0.1nm的金纳米球，加入0.5μl浓度为0.1m的ctab溶液，在20℃水浴中孵化10min，得到ctab包覆的纳米金颗粒溶液；(2)将1ml浓度为0.1nm步骤(1)得到的ctab包覆的纳米金颗粒与10μl浓度为500μm的icg溶液混合，20℃水浴中避光孵化10min，得到纳米金颗粒负载的icg。实施例12一种icg包覆的纳米金颗粒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1′)取1ml浓度为0.5nm的金纳米球，加入5ul浓度为0.1m的ctab溶液，在30℃水浴中孵化5min。加入50μl含60mmnacl的浓度为20mg/mlpss溶液，放入30℃水浴孵化3h，12000rpm离心5min，弃去上清液之后加入等体积三次水溶解，得到pss包覆的纳米金颗粒溶液；(1)向步骤(1′)得到的溶液中加入50μl含60mmnacl的浓度为20mg/mlpddac溶液，迅速混匀，放入30℃水浴孵化3h，12000rpm离心5min，弃去上清液之后加入等体积三次水溶解，得到pss以及pddac包覆的纳米金颗粒溶液；(2)取1ml浓度为0.1nm的包覆了pddac的金纳米球中加入10ul浓度为500μm的icg溶液，30℃水浴中避光孵化5min，得到纳米金颗粒负载的icg。实施例13一种icg包覆的纳米金颗粒的制备方法，除了步骤(1′)中金纳米球的浓度为0.05nm，ctab的浓度为0.2m外，其他条件均与实施例12相同。实施例14一种icg包覆的纳米金颗粒的制备方法，除了步骤(1′)中金纳米球的浓度为5nm外，其他条件均与实施例12相同。对比例1在1ml浓度为5μmicg溶液中加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。对比例2在1ml三次水中加入10μl浓度为50mm的ctab溶液(ctab终浓度为500μm)，之后加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。对比例3在1ml浓度为5μmicg溶液中加入50μl浓度为20mg/ml的pss溶液(pss的终浓度为1mg/ml)，在30℃水浴中避光孵化5min后加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。对比例4在1ml浓度为5μmicg溶液中加入10μl浓度为50mm的sds溶液(sds终浓度为500μm)，在30℃水浴中避光孵化5min后加入5μl浓度为10mm的naa溶液，搅拌均匀之后将混合溶液加入样品池中，紫外分光光度计的测量范围为200～1100nm。对比例5所述方法除了不进行步骤(2)外，其他条件均与实施例11相同。本发明基于四个基本的实验现象：(1)icg在808nm激光照射下能产生单线态氧，单线态氧的产量可以由氧化naa的效果间接反映。(2)将icg与不同浓度的ctab孵化后，激光照射后降解naa的能力增强，并且增强的效果与ctab浓度正相关。(3)同样是带正电的高分子ctac、pddac也能够增强icg产生单线态氧的效果，而带负电的sds、pss则不会影响icg单线态氧产量。(4)用覆盖了ctab或pddac的金纳米球可以静电负载icg，同样可以实现单线态氧产量的增强。首先，naa作为一种还原剂，可以被单线态氧氧化分解，本发明利用naa的降解来间接表示icg单线态氧的产量，通过265nm处naa特征吸收峰的降低计算naa的降解量。在波长为808nm的连续激光照射下，icg可以使naa降解，随着icg的光降解，naa的降解速度变慢。在加入阳离子表面活性剂ctab之后，icg降解naa的能力增强。为了探究这种增强与ctab浓度是否相关，分别采用了10μm/50μm/100μm/500μm五个浓度的ctab与icg进行孵化，对比他们在2w/808nm的连续激光照射3分钟内naa降解的不同，可以看出，ctab的确可以增强naa的氧化降解，即ctab可以提高icg的单线态氧产生，并且单线态氧产量的提高与ctab的量成正相关(图1，图2)。为了探究这种效果是否是因为ctab分子与icg产生了特殊的反应，本发明还分别用ctac、pddac、pss、sds来孵化icg，其中ctac和pddac带正电而pss和sds带负电。结果(图3)可见，这种单线态氧产量的增强不仅发生在ctab溶液中，而是一种正电荷高分子链的普遍效果，带负电的高分子链并不能影响icg的单线态氧产量。从icg本身的紫外-可见吸收光谱可以看出(图1)，随着ctab浓度的增加，icg的单体峰(780nm处)变小，在长波侧和短波侧吸收峰变强，吸收峰的这种变化表明由于与正电荷高分子链的静电相互作用，icg形成了更多的聚集体(j.photochem.photobiol.b:biol.,1998,47,155-164)，这种聚集体的增多起到一种对icg的保护作用(acsnano,2014,11,11529-11542)，使icg单线态氧产量增加。icg作为一种光敏剂应用时，需要载体将icg运入体内。最后为了实现本发明中发现的对icg单线态氧产量增强效果的实际应用，用金纳米颗粒作为载体，表面分别用ctab和pddac包覆(表1)，用金纳米颗粒负载之后，icg会表现出与相同量高分子链孵化时一致的单线态氧增强效果(图4b/c)，用ctab包覆的金纳米颗粒负载icg之后，氧化降解naa时会导致金颗粒的团聚，这种现象在不负载icg的情况下没有出现，是负载在金纳米颗粒表面的icg光降解产物导致了金颗粒的团聚(图4a/b)，进一步表明了对icg的成功负载。表1表面电势(mv)ctabpsspddacaus31.6±3.2-41.5±2.454.1±5.1aus-icg17.7±1.4-42.6±4.3申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页12