一种细胞外比率型氧传感探针及其制备方法和应用与流程
本发明属于纳米医用材料领域，涉及一种比率型氧传感探针及其制备方法和应用，尤其涉及一种细胞外比率型氧传感探针及其制备方法和应用。
背景技术：
氧气对于环境、海洋、农业、工业、健康等来说是非常重要的元素。在生物领域，氧气在耗氧细胞核组织中作为一个关键的基本物质，在包含能量生产、能量平衡和生物质生成等许多核心细胞生理和发育过程中扮演了极为重要的角色。作为电子受体，氧气对于在线粒体和ATP生产中的电子转移(ETC)功能是至关重要的。至始至终，氧气有效性和/或利用性会导致病理和疾病态，因此，其代表了医疗诊断和基础研究的重要目标。例如，它已经被证实在低氧状态(缺氧态)下会直接或间接地对基因表达调控产生的影响，这可致使恶性肿瘤更具有转移性和耐药性。癌细胞中从有氧化磷酸化作用到有氧酵解的新陈代谢转换(瓦尔保效应)是一个新兴的癌症标记之一。氧化已被证明在心血管缺血和再灌注损伤中的组织生存和再生下起到决定性作用。缺氧已被证实是不同疾病中的重要因素，其中包括阿尔茨海默症、炎症、心脏病、中风、慢性肺病和癌症。这些疾病导致了美国60％的死亡率。因此，实时测量细胞氧气的能力对进一步了解细胞氧化动力学、线粒体活动和能量生产及生物质合成内平衡是十分重要的。此外，细胞呼吸关乎细胞活性，因此它也可以通过细胞呼吸测量实现高通量药物筛选。
液态、光纤、水凝胶、溶胶凝胶、聚合物薄膜、微纳米颗粒等各种形式的氧传感器得到了长足的发展，同时一些最新的综述也得到了发表。为了进一步了解氧气测量和细胞新陈代谢，一些基于光学氧传感器先进的、商业化的仪器已经得到了发展。例如，海马生物科技(Seahorse Bioscience)为细胞呼吸和细胞外酸化测量研发了XF96新陈代谢测量仪。XF96仪器中的传感器是属于一种溶胶的传感器。为了测量细胞呼吸和酸化，海马的XF仪器运用了一个特别的芯片设计以获得高通量分析细胞外pH和氧气测量。为了获得高通量分析，如果材料可以很容易被运用在许多商业仪器中，这就能使得许多研究人员和科学研究受益。因此，如果这些探针/传感器可以溶解或悬浮在细胞培养基中，这些材料可能是一类理想的材料以获得简便的运用及高通量应用。为了简单化，我们统一将这类探针/传感器命名为液态探针/传感器。许多运用有机化合物、大分子和/或纳米颗粒的液态氧传感器探针/传感器得到了发展。在这些探针/传感器中，虽然有很多是针对细胞内氧测量的；一些液态传感器被验证可以作为细胞外传感器，并且运用在细胞呼吸和线粒体活性测量当中。Papkovsky等人将含有异氰酸盐的卟啉铂(II)(platinum(II)-coproporphyrin，PtCP)与牛血清蛋白(BSA)、氨基聚乙二醇(amino-PEG)、氨基-葡聚糖(amino-dextran)结合以构建大分子探针。Papkovsky也报道了包含八乙基卟啉铂(II)(platinum(II)-octaethylporphine，PtOEP)和铂(II)-八乙基卟啉酮(platinum(II)-octaethylporphine-ketone，PtOEPK)的单分散聚苯乙烯/二乙烯苯(polystyrene/divinylbenzene)纳米颗粒。这两种大分子氧传感器和纳米颗粒传感器对大肠杆菌都具有细胞不可渗透性。这些特征使得这些水溶性传感器成为了理想的细胞外传感器。Borisov等人报道了一种含有五氟四苯基卟啉铂(PtTFPP)的聚苯乙烯-嵌段-聚乙烯吡咯烷酮胶束，同时研究了其在水溶液中的氧气响应，作者证实这些胶束拥有大约为250nm的平均直径，并且对大肠杆菌具有不可渗透性。
为了传感，量子效率是必须关注的。一些由金属卟啉(PtCPK、PtCP、PdCPK或PtTCPP)制备的亲水氧探针展现了0.001到0.0095的极低的量子效率。为了获得高量子效率，赋予氧传感器以新的特性，Vinogradov等人展现了一系列树枝状氧传感器。这些树枝状传感器的核心是铂卟啉，而外壳是疏水的。在这些探针中，磷光金属卟啉被转载进疏水的树枝中，这就形成了一个保护层包裹住了发色团，控制氧转变为三线态同时能够控制方法的灵敏性。树枝状外围的PEGylation或carboxylication确保了较高的水溶性，同时又防止了探针与生物大分子之间的相互作用。最终，含有卟啉的树枝状量子效率提升到了0.017到0.073。
本课题组曾进行了一个不定型嵌段共聚物的研究(参见Fengyu Su等，Nanostructured Oxygen Sensor-Using Micelles to Incorporate a Hydrophobic Platinum Porphyrin，PLOS ONE，第7卷第3期，2012年5月)，用纳米胶束装载着一个高效但极度疏水的PtTFPP氧探针，确保了PtTFPP可以运用在水溶液中并拥有0.107到0.111的量子效率。
另一方面，最近，一种含有聚集诱导发光(AIE)的新式荧光素得到了发展。AIE荧光素在聚集态展现了很高的量子效率。考虑到分子内旋转可以大大地影响激发态的辐射与非辐射再复合过程，受限分子内旋转被认为是AIE效应较为可能的机制。在生物研究领域，AIE荧光素也被广泛用作DNA、肝素、二氧化碳、葡萄糖和生物成像的传感器。
因此，在本领域，期望能够运用AIE荧光素结合PtTFPP来开发一种新型的比率型氧传感探针。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种比率型氧传感探针及其制备方法和应用，特别是提供一种细胞外比率型氧传感探针及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种比率型氧传感探针，所述比率型氧传感探针包括载体和包裹在载体中的氧敏感化合物，所述载体由两亲性接枝聚合物和连接在所述两亲性接枝聚合物上的聚集诱导发光基团(AIE基团)构成。
优选地，所述聚集诱导发光基团连接在两亲性接枝聚合物的疏水支链末端；
优选地，所述聚集诱导发光基团连接在两亲性接枝聚合物的主链上形成从主链上接出的聚集诱导发光分子支链。
优选地，所述载体为具有式I或式II所示的聚合物：
式I中，R1和R2独立地为H、C1-C5烷基或R-CN，R为C1-C5亚烷基或不存在；R3为疏水聚合物基团；R4为亲水性基团；A为聚集诱导发光基团；0＜x＜1，0＜y＜1，且x+y＝1；m为10-1000的整数；
式II中，R1、R2和R5独立地为H、C1-C5的烷基或R-CN，R为C1-C5的亚烷基或不存在；R3为疏水聚合物基团；R4为亲水基团；A为聚集诱导发光分子基团；0＜x1＜1，0＜x2＜1，0＜y＜1，且x1+x2+y＝1；m为10-1000的整数。
在本发明中，所述C1-C5烷基可以为C1、C2、C3、C4或C5烷基，优选甲基或乙基。
在本发明中，所述C1-C5亚烷基可以为C1、C2、C3、C4或C5亚烷基，优选亚甲基或亚乙基。
在本发明中，所述疏水聚合物基团是指带有疏水聚合物片段结构的基团，所述疏水聚合物片段结构使得疏水聚合物基团呈现疏水性，构成本发明所述两亲性接枝聚合物的疏水支链。
在本发明中，所述亲水性基团构成本发明所述两亲性接枝聚合物的亲水支链。
优选地，在式I中R3为其中n1为10-300的整数，例如n可以为10、12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、130、150、180、200、230、250、280或300；或者式I中R3为其中n2为10-300的整数，例如n2可以为10、12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、130、150、180、200、230、250、280或300。
优选地，在式I中R4为或中的任意一种，p为1-100，例如1、3、5、7、9、12、15、18、20、22、25、28、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100，以及3.5、5.5、7.5、10.5、13.5、11.5、20.5、30.5、40.5等小数值。
；其中在中表示基团的连接位点，*端代表聚合物的延伸端，并不表示基团的连接位点。
优选地，在式I中A为Ra为C1-C8的直链烷基或支链烷基，Rb为C1-C8的直链亚烷基或支链亚烷基。
在本发明中，C1-C8的直链烷基或支链烷基可以为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7或C8直链烷基或支链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基或正己基等。
优选地，在式I中A为
优选地式I中A基团的供体为
优选地，所述载体为具有以下式a-d所示结构的两亲性接枝聚合物中的一种或至少两种的组合：
在式a中，A为0＜x＜1，0＜y＜1，且x+y＝1；m为10-1000的整数；
在式b中，A为0＜x＜1，0＜y＜1，且x+y＝1；m为10-1000的整数；
在式c中，A为0＜x＜1，0＜y＜1，且x+y＝1；m为10-1000的整数；
在式d中，A为0＜x＜1，0＜y＜1，且x+y＝1；m为10-1000的整数。
在本发明中，所述m为10-1000的整数，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、130、150、180、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。
优选地，在式II中R3为中的任意一种，其中R6为H、取代的或未取代的C1-C12的直链烷基或取代的或未取代的C1-C12的支链烷基；q为1-300的整数，例如q可以为2、5、8、10、12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、130、150、180、200、230、250、280或300。
如上所述取代的或未取代的C1-C12的直链烷基可以是取代的或未取代的C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11或C12的直链烷基，例如甲基、乙基或丙基等。
如上所述取代的或未取代的C1-C12的支链烷基可以是取代的或未取代的C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11或C12的直链烷基，例如异丙基、异丁基或异戊基等。
优选地，在式II中R4为中的任意一种，p为1-100，例如1、3、5、7、9、10，12、15、18、20、22、25、28、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100，以及3.5、5.5、7.5、10.5、13.5、11.5、20.5、30.5、40.5等小数值。；其中在中表示基团的连接位点，*端代表聚合物的延伸端，并不表示基团的连接位点。
优选地，在式II中A为中的任意一种，其中R7、R8、R9和R10独立地选自C1-C8的直链烷基或支链烷基，优选甲基、乙基或丙基，X为Cl或Br。
与式II中A基团相对应的供体为中的任意一种。
优选地，所述载体为具有以下式e或式f所示结构的两亲性接枝聚合物或两者的组合：
在式e中，A为0＜x1＜1，0＜x2＜1，0＜y＜1，且x1+x2+y＝1；m为10-1000的整数；
在式f中，A为0＜x1＜1，0＜x2＜1，0＜y＜1，且x1+x2+y＝1；m为10-1000的整数。
在本发明中，所述氧敏感化合物为五氟四苯基卟啉铂(PtTFPP)，其结构式如下：
另一方面，本发明提供了如上所述的比率型氧传感探针的制备方法，所述方法为：制备得到连接有聚集诱导发光基团的两亲性接枝聚合物载体，利用所述两亲性接枝聚合物载体进行自组装包裹氧敏感化合物得到所述比率型氧传感探针。
优选地，所述连接有聚集诱导发光基团的两亲性接枝聚合物载体为具有式I或式II所示的聚合物。
优选地，式I所示的聚合物的制备方法包括以下步骤：
(1)以聚集诱导发光分子A-OH为引发剂引发疏水单体B发生聚合反应，得到连接有聚集诱导发光分子基团A的疏水聚合物A-R3-H，反应式如下：
A-OH+B→A-R3-H
(2)将步骤(1)得到的疏水聚合物A-R3-H与式III所示酰氯化合物反应得到式IV所示疏水聚合物单体，反应式如下：
(3)将步骤(2)得到的式IV所示疏水聚合物单体与式V所示亲水单体发生聚合反应得到式I所示聚合物，反应式如下：
在以上所述反应式中对于各基团的限定如上文所述。
优选地，步骤(1)所述疏水单体B为丙交酯或ε-已内酯，优选ε-已内酯。
优选地，步骤(1)所述聚集诱导发光分子A-OH与疏水单体B的摩尔比为1:(2-500)，例如但不局限于1:2、1:4、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30、1：40、1:60、1:80、1:100、1:120、1:150、1:180、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450或1:500，优选1:(5-100)。
优选地，步骤(1)所述聚合反应在催化剂存在下进行。
优选地，所述催化剂为辛酸亚锡。
优选地，步骤(1)所述聚合反应在保护性气体存在下进行，所述保护性气体优选氮气。
优选地，步骤(1)所述聚合反应的温度为60-160℃，例如60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、110℃、120℃、140℃或160℃。
优选地，步骤(1)所述聚合反应的时间为1-24小时，例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时，优选6-12小时。
优选地，步骤(1)所述聚合反应的溶剂为二氧六环和/或N,N-二甲基甲酰胺。
步骤(1)所述的聚合反应液可以在无溶剂下进行。
优选地，在步骤(2)中，将式III所示酰氯化合物滴加至含有疏水聚合物A-R3-H的反应体系中。
优选地，步骤(2)所述疏水聚合物A-R3-H与式III所示酰氯化合物的摩尔比为1:(1-100)，例如1:1、1:3、1:5、1:8、1:10、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100，优选1:(1-10)。
优选地，步骤(2)所述聚合反应在碱性化合物存在下进行，所述碱性化合物优选三乙胺。
优选地，步骤(2)所述反应的溶剂为干燥的二氯甲烷和/或三氯甲烷，优选干燥的二氯甲烷。所述干燥的二氯甲烷和/或三氯甲烷是指经过除水干燥处理的二氯甲烷和/或三氯甲烷。
优选地，步骤(2)所述反应在冰浴下进行；
优选地，步骤(2)所述反应的时间为4-12小时，例如4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时，优选6-10小时。
优选地，步骤(3)所述式IV所示疏水聚合物单体与式V所示亲水单体的摩尔比为1:100-100:1，例如1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，优选1:50-50:1。
优选地，步骤(3)所述聚合反应的引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈或过氧化苯甲酰中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(3)所述聚合反应在保护性气体保护下进行，所述保护性气体优选氮气。
优选地，步骤(3)所述聚合反应的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或N,N-二甲基乙酰胺。
优选地，步骤(3)所述聚合反应的温度为60-90℃，例如60℃、63℃、65℃、68℃、70℃、73℃、75℃、78℃、80℃、83℃、85℃、88℃或90℃。
优选地，步骤(3)所述聚合反应的时间为10-30小时，例如10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时或30小时。
优选地，式II所示聚合物的制备方法包括以下步骤：
(A)使式VI所示的疏水聚合物单体和式VII所示的聚集诱导发光化合物反应得到式VIII所示的接枝聚合物，反应式如下：
(B)使步骤(A)得到的式VIII所示的接枝聚合物与式V所示亲水单体发生聚合反应得到式II所示聚合物，反应式如下：
在本发明中，式VI所示的疏水聚合物单体可以利用本领域已知的制备方法制备得到，例如可以利用开环聚合，而后将开环聚合产物与带有双键的酰氯化合物反应，从而得到式VI所示的疏水聚合物单体；或者可以通过本领域已知的原子转移聚合方法制备得到所述疏水聚合物单体。本发明所述聚集诱导发光化合物可以通过购买得到或者可以根据已知的合成方法来合成。
优选地，步骤(A)所述式VI所示的疏水聚合物单体和与式VII所示的聚集诱导发光化合物的摩尔比为1:100-100:1，例如1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，优选1:50-50:1。
优选地，步骤(A)所述聚合反应的引发剂为偶氮二异丁腈。
优选地，步骤(A)所述聚合反应的温度为60-90℃，例如60℃、63℃、65℃、68℃、70℃、73℃、75℃、78℃、80℃、83℃、85℃、88℃或90℃。
优选地，步骤(A)所述聚合反应的时间为10-30小时，例如10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时或30小时。
优选地，步骤(B)所述式V所示亲水单体与步骤(A)所述式VI所示的疏水聚合物单体的摩尔比为1:100-100:1，例如1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，优选1:50-50:1。
优选地，步骤(B)所述聚合反应的引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈或过氧化苯甲酰中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(B)所述聚合反应的温度为60-90℃，例如60℃、63℃、65℃、68℃、70℃、73℃、75℃、78℃、80℃、83℃、85℃、88℃或90℃。
优选地，步骤(B)所述聚合反应的时间为10-30小时，例如10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时或30小时。
优选地，步骤(A)和步骤(B)所述聚合反应在保护性气体保护下进行，所述保护性气体优选氮气。
优选地，所述利用所述两亲性接枝聚合物载体进行自组装包裹氧敏感化合物的方法为：将所述两亲性接枝聚合物载体与氧敏感化合物溶解在有机溶剂中得到溶液，而后将该溶液加入去离子水中，透析，得到所述比率型氧传感探针。
优选地，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和/或二甲基亚砜(DMSO)，优选二甲基亚砜。
优选地，所述有机溶剂与去离子水的体积比为1:5-1:50，例如1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5、1:10、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。在该比例范围内，能够保证具有较好的自组装动力，能够保证形成稳定的纳米体系，而不发生胶束颗粒之间的过度聚集而导致产生沉淀。
另一方面，本发明提供了如上所述的比率型氧传感探针在水溶氧实时监测中的应用。
另一方面，本发明提供了如上所述的比率型氧传感探针在细胞生长监测中的应用。
另一方面，本发明提供了如上所述的比率型氧传感探针在药物筛选中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明将聚集诱导发光基团连接在两亲性接枝聚合物上构成载体，以该载体包裹氧敏感化合物得到所述比率型氧传感探针，该探针将氧传感效率高但是疏水性的PtTFPP包裹在载体内，使得PtTFPP能在水溶液中进行氧传感并在水溶液中保证较高的荧光强度。本发明的比率型氧传感探针可以测量大肠杆菌和GM12878人B淋巴细胞在不同细胞浓度下的氧消耗情况，同时其可以在7小时内原位测量至少100cfu/mL的细菌，还可用于药物筛选，并且其无细胞毒性，安全可靠。此外，由于PtTFPP探针胶束表现出极高的量子效率，而且这种氧传感探针可以进行水溶液中氧含量测量，因此可以广泛运用于一些类似于酶标仪等的商用仪器，能够为高通量测量、疾病诊断和新陈代谢研究提供帮助。
附图说明
图1为实施例3中自组装得到的载体浓度为0.01-100μg/mL的纳米体系在不同波长下的荧光强度曲线图；
图2为实施例3中自组装得到的载体浓度为0.01-100μg/mL的纳米体系在530nm波长下的荧光强度图；
图3A为本发明的氧传感探针对氧气的响应曲线图；
图3B为聚合物载体中PtTFPP在650nm下的I0/I强度比率曲线图以及聚合物载体中聚集诱导发光基团AIE在520nm的强度与聚合物载体中PtTFPP在650nm的发射强度的比率(I520/I650)随溶解氧溶度的变化曲线图；
图4为本发明的氧传感探针在饱和氧和缺氧条件下的荧光强度变化；
图5为加入葡萄糖氧化酶后，本发明的比率型氧传感探针荧光强度变化图；
图6为本发明的比率型氧传感探针在大肠杆菌浓度为1.25x 107cfu/mL以及在细胞培养基中的氧呼吸与AIE参比探针在大肠杆菌以及细胞培养中的氧呼吸的对比图；
图7为本发明的比率型氧传感探针在不同大肠杆菌浓度下的氧呼吸图；
图8为本发明的比率型氧传感探针在不同大肠杆菌浓度下消耗氧的时间曲线图；
图9为本发明的比率型氧传感探针在不同大肠杆菌浓度下消耗氧的时间和图8中荧光强度为1000、1100和1200时的浓度和强度关系图；
图10为GM12878人B淋巴细胞在不同细胞浓度下的氧消耗情况；
图11为在不同探针PtTFPP浓度下，细胞浓度为5x107cfu/mL的大肠杆菌的细胞生长曲线图；
图12为在相同氧探针浓度下(5ug/mL PtTFPP)，不同浓度大肠杆菌的细胞生长曲线图；
图13为不同药物浓度刺激下的大肠杆菌氧消耗图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，通过如下流程合成式a所示聚合物载体：
其中A为
合成步骤如下：
P1合成过程：
将988mg(8.7mmol)ε-已内酯和61.1mg(0.1mmol)聚集诱导发光分子A-OH(根据以下文献资料合成：Hongguang Lu，et al,JOURNAL OF POLYMER SCIENCE PART A:POLYMER CHEMISTRY 2012,50,890–899)在烧瓶中充分混合，并在氮气氛围下110℃油浴搅拌5min，之后注射两滴催化剂辛酸亚锡(Sn(Oct)2)，搅拌反应一夜后，将反应物在冰浴中迅速冷却得到固态聚合物。之后固态聚合物重新溶解在5mL二氯甲烷中，之后溶液缓慢滴加至在100mL冰甲醇中，得到聚合物沉淀，此沉淀过程重复一遍。最终得到600mg聚合物P1，产率71％。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ(ppm)):8.39(m,br,4H,ArH),7.80(d,4H,ArH),7.60(d,4H,ArH),7.46(br,4H,ArH),6.99(d,4H,ArH),6.88(d,4H,ArH),4.05(t,186H,OCH2-),3.66(br,2H,-CH2OH),2.30(t,180H,-CH2CO),1.64(m,376H,-CH2CH2CH2-),1.37(m,190H,CH3CH2-&-CH2CH2CH2-).n＝90；Mn(NMR)＝10860。
P2合成过程：
440mg(0.4mmol)P1和1.39mL(20mmol)三乙胺溶解于60mL超干二氯甲烷中。之后将0.97mL(20mmol)甲基丙烯酰氯溶解于20mL超干二氯甲烷中，并将混合液在冰浴条件下经过一个小时缓慢滴加至反应瓶中。经过一夜反应后，反应液旋蒸浓缩后在100mL冰甲醇中沉淀，此过程重复一遍。最终得到300mg绿色聚合物，产率68％。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ(ppm)):8.39(m,br,4H,ArH),7.80(d,4H,ArH),7.60(d,4H,ArH),7.46(br,4H,ArH),6.99(d,4H,ArH),6.88(d,4H,ArH),6.10(br,1H.CH2＝),5.55(br,1H.CH2＝),4.05(t,188H,OCH2-),2.30(t,180H,-CH2CO),1.64(m,376H,-CH2CH2CH2-),1.37(m,193H,CH3CH2-&-CH2CH2CH2-).n＝90；Mn(NMR)＝10940。
P3合成过程：
将500mg(3.49mmol)N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺，220mg(0.2mmol)的P2和10mg AIBN溶解在5mL超干DMF中溶液通过标准的冻抽氮气过程对反应溶液进行三次除气过程。这些单体在氮气环境下75℃反应24小时。最终的聚合物在200mL乙醚中沉淀出来。得到400mgP3，产率56％。Mn(GPC)＝58000,Mw(GPC)＝106000,Mw/Mn＝1.82。
实施例2
本实例中，通过如下反应制备式d中的聚合物载体
73mg(0.06mmol)P2,440mg(0.8mmol)寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA，分子量为550)，10mg AIBN放入10mL Schlenk管中，利用传统的除氧方法后，充氮气抽换气三次，加热至70℃搅拌，反应24小时。反应完毕后逐滴加入冰乙醚中，得粘稠状聚合物P4。产率84％。Mn＝35400，Mw＝43200。x:y＝7.5:72.5。
实施例3
对实施例1制备得到的聚合物载体在水溶液中形成胶束的能力进行考察，通过测定其临界胶束浓度进行考察，在胶束形成过程中，荧光发射会被水淬灭而获得较弱的荧光。一旦胶束形成，荧光强度将会极大地增强。通过测试P3在水溶液中0.01μg/mL到100μg/mL浓度下荧光强度变化，通过荧光强度突变点判断实施例1制备得到的聚合物载体的CMC。测试过程荧光强度随着浓度的变化如图1所示，可见纳米体系在波长530纳米处具有强吸收，随着聚合物浓度的增大荧光强度增强。以浓度和530nm波长下的荧光强度值作为横坐标和纵坐标作图得到图2，由图2中荧光强度突变点即图2中两条直线的交点得出P3的聚合物载体的CMC值为5.0μg/mL。
实施例4
在该实施例中，对实施例1制备得到的聚合物载体进行自组装包裹PtTFPP得到比率型氧传感探针，自组装方法如下：
将实施例1制备得到的P3聚合物载体5mg和0.1mg氧敏感化合物PtTFPP溶于200μLDMSO溶液中，得到澄清溶液，将该澄清液缓慢地注射至1mL去离子水中，然后将溶液放置于透析袋中，至于搅拌的去离子水中进行透析，透析过程持续两天，每12个小时换水一次以去除有机DMSO溶剂。透析后，溶液用0.45mm的滤膜过滤以去除可能存在的聚合物沉淀、未包裹的PtTFPP及较大的颗粒。最终的溶液保存在4℃冰箱中。
对包裹在P3聚合物载体中的PtTFPP的荧光量子效率(η)通过利用390nm的光激发PtTFPP在二氯甲烷中的量子效率(η＝0.088)进行计算，计算公式如下所示。
其中，ηr和ηs是标准荧光量子效率和样品的荧光量子效率。Ar和As是标准样品和测试样品在激发波长下的洗手。Ir和Is是标准样和测试样发射强度的积分，nr和ns是各样品溶剂的折射系数。水和二氯甲烷的折射系数分别是1.333和1.424，最终的量子效率通过测量吸收值在0.03至0.09范围的四组数据的平均值而得到。标准差小于10％，最终得到其包裹在P3聚合物载体中的PtTFPP的荧光量子效率η＝0.20。
P3聚合物载体中聚集诱导发光基团的荧光量子效率通过聚合物荧光光谱积分对比硫酸奎宁在1.0N硫酸中的荧光光谱(激发波长为365nm)，在修正的折射系数下运用方程(1)得到，其荧光量子效率η＝0.55，荧光量子效率高。
实施例5
在本实施例中对实施例5制备得到的比率型氧传感探针的氧传感性能进行测试，氮气和氧气的混合气体被用作调节溶液中氧气浓度。混合气体通过定制内嵌数字气体流量控制器进行精准控制。所有的传感测量都在大气压(760mmHg or 101.3kPa)下进行。23℃时，在氧分压为21.4kPa的空气饱和条件下，水中的溶解氧浓度为8.58mg/mL。
图3A为氧传感探针对氧气的响应曲线图，由于聚合物中聚集诱导发光基团是很微弱的，因此其对PtTFPP的发射不产生影响，从图中可以看出PtTFPP的发射随着氧浓度的增加而降低。图3B为聚合物载体中PtTFPP在650nm下的I0/I(I0表示在无氧或氮气气氛下的荧光强度，I表示在某一溶解氧浓度下的荧光强度)强度比率曲线图以及聚合物载体中聚集诱导发光基团AIE在520nm的强度与聚合物载体中PtTFPP在650nm的发射强度的比率(I520/I650)随溶解氧溶度的变化曲线图，根据强度比(I0/I)曲线图可知该探针对氧浓度呈现线性响应；I520/I650曲线也同样给出线性关系，浓度和荧光强度的线性关系有利于获得测量的准确数据。
实施例6
在本实施例中对实施例5制备得到的比率型氧传感探针的响应时间进行测试，方法如下：
(1)通过通入氮气氧气混合气体测试传感探针响应时间：
3mL的PtTFPP胶束溶液置于石英比色皿中，在激发光为405nm时，测量传感器650nm峰值的发射。为了改变缓冲液中溶解氧的浓度，通过小管和针头将管路中的气体通入缓冲液中。通气孔安装在比色皿上方以针管插入及让气体排出。氧气和氮气气流速率设置为50立方厘米/分钟。测量开始后将100％氧气和100％氮气进行快速切换。如图4所示，从氮气条件下通入氧气，达到90％变化时的时间t90为30s，达到95％变化的时间t95为33秒。相反，氧气条件下通入氮气，t90-r为100s，t95-r为132s。响应时间比PtTFPP物理混合在PHEMA阵列的t90＝50s及物理混合在聚苯乙烯阵列的t90＝84s都要快很多。说明本发明制备得到的比率型氧传感探针在氧传感方面是很理想的材料。通过重复性测试发现PtTFPP是十分稳定的，相比PtTFPP，AIE分子在一小时实验周期中有5％的下降。这都归因于长期光照射的光漂白和/或长期暴露在空气中氧化现象。因此，对于实际运用中，如果可以尽量减少长时间的曝光，这样可以更好发挥其性能。
(2)运用葡萄糖氧化酶测量传感探针响应时间(静态响应时间)：
将2mL PtTFPP胶束置于石英比色皿，不同浓度的葡萄糖氧化酶注入溶液中，胶束中葡萄糖保持浓度为0.25M，葡萄糖氧化酶浓度保持在5×10-5至1mg/mL。葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖以消耗氧气。在405nm激发下发射650nm传感器发射峰，发射测量每0.06秒记录一个数据。如图5所示，通过葡萄糖氧化酶和葡萄糖消耗氧气，在没有油封和搅拌的情况下，测试得出了最快的0.7s响应时间。相比聚苯乙烯-嵌段-聚乙烯吡咯烷酮(polystyrene-block-polyvinylpyrrolidone)包覆的PtTFPP，虽然测试条件不一样，但是还是比其表现的4s响应时间要快很多。
实施例7
在该实施例中，考察本发明的氧传感探针对细胞呼吸中氧浓度的响应性，方法如下：
大肠杆菌培养：将单菌落大肠杆菌置于液态Lysogeny Broth(LB)培养基。其中，LB培养基由10g胰蛋白胨，5g酵母膏和10g氯化钠溶于蒸馏水。通过测量600nm处的光学强度(OD600)来估计培养基中的大肠杆菌密度。特别是OD600在0.1至1之间时与大肠杆菌表现为良好的线性特征。通过UV-Vis光谱校准，在OD600为1的时候表现为5.0×108cfu/mL。通过一夜的培养，细菌的密度已经决定，用新鲜的LB培养基进行适当的稀释以获得适当的大肠杆菌浓度。
细胞呼吸测试：运用对氨苄西林敏感的JM109大肠杆菌来对细胞进行研究。将本发明的比率型氧传感探针溶液直接加到细胞培养基中，然后运用405nm激光激发后直接收集荧光信号。AIE发射峰在520nm，PtTFPP的峰在650nm，测试温度保持在37℃。本实验用的共聚物对一些包含大肠杆菌和HeLa细胞学等细胞有不渗透性。为了避免培养基中的氧气与大气中的氧气进行交换，在LB培养基上方运用一层矿油将空气隔绝。
图6所示为胶束氧气测试(在该图中1E4表示1×104,9E3表示9×103，以此类推)，在测试前20分钟，荧光强度的下降归因于温度效应。这对很多有机荧光素来说是很正常的，随着温度的升高荧光强度随之下降，温度稳定后，荧光强度也变稳定。不论是否含有细菌，在测试中的AIE荧光强度都不会发生变化。而PtTFPP的荧光强度在不含细菌的情况下不随时间发生变化，在有细菌的情况下，荧光强度随着时间的变化而变强，这都归因于细菌消耗了氧气。在氧气完全消耗后，高细胞浓度下的PtTFPP的荧光强度达到最大，但是之后又轻微的下降。对于低细胞浓度情况下只表现出更小的光降解。
如图7所示，在连续光照情况下传感器的光稳定性关乎细胞的浓度，更高的细胞浓度将会导致更严重的衰退。因此，对于长时间的应用，相对低浓度的测试是更好的。如图7所示，在不同细胞浓度下测试了氧传感器测试细胞呼吸。细胞浓度越高氧气消耗越快。对于细胞浓度在5×107cfu/mL，溶解氧在15分钟内消耗完毕。通过大肠杆菌氧气消耗速率以及初始细胞浓度计算。略受初始细胞密度的影响下，单细胞的氧消耗率为油封下4.72×10-18到6.44×10-18molcfu-1s-1，无油封下3.14×10-18-4.32×10-18mol cfu-1s-1。
监测水中的大肠杆菌对食品污染显得十分重要，如图8所示，本发明的氧传感探针可以在7小时内检测浓度至少在100cfu/mL大肠杆菌，细胞浓度越高，氧传感探针的检测响应越快。如图9所示，细胞浓度和测试时间显示出了很好的线性关系，因此可以通过测试时间很好地估算水体被细菌的污染程度。
哺乳动物细胞培养：GM12878人B淋巴细胞需用液态DMEM培养基培养，其中含有10v/v％FBS，然后在37℃，5％CO2氛围下培养。GM12878是悬浮细胞系，可以很好地计算细胞浓度，图10显示越高的细胞浓度氧气消耗越快，因此本发明的氧传感探针除了适用于大肠杆菌外，也适用于哺乳动物细胞。
实施例8
在本实施例中，考察本发明的氧传感探针的细胞毒性，方法如下：
运用5×107cfu/mL浓度的细胞在5-40μg/mL PtTFPP浓度下对细菌进行细菌生长测试，结果如图11所示。同时，在PtTFPP浓度为40μg/mL的情况下，在3.5×106到1×108cfu/mL的大肠杆菌细胞浓度下进行细菌生长测试，结果如图12所示。结果表明，两种毒性测试方式都显示本发明的比率型氧传感探针胶束对细菌生长没有影响，不会产生细胞毒性。本发明的比率型氧传感探针在1至5μg/mL就能表现出很好的传感性能。
实施例9
本实施例的氧传感探针在药物筛选测试中的应用：
抗霉素对很多不同的细菌来说是很强的电子传输链抑制剂和抗生素。众所周知，抗霉素A通过刺激氧化压力调节死亡来抑制不同细胞的生长。通过运用大肠杆菌系为代表测试抗霉素抑制氧气呼吸。通过观察氧气消耗的不同来反映药物筛选效果。将106cfu/mL浓度下的大肠杆菌混合不同浓度的抗霉素，利用本发明的氧传感探针来监控氧气浓度。如图13所示，没有添加任何抗霉素的细胞将在3小时完全消耗氧气，随着抗霉素浓度的增加，氧气消耗的速率也随之明显减弱。当抗霉素浓度达到100μg/mL的时候，氧气的消耗被完全抑制。因此，研究表明本发明的氧传感探针具有成为抗生素、毒素和药物筛选等方面应用的潜质。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的比率型氧传感探针及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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