白介素25在银屑病的发育中的作用的制作方法

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及白介素25在银屑病的发育中的作用。更具体地，本发明涉及试剂在制备药物中的用途、制剂在制备药物中的用途、激活免疫细胞的方法、抑制免疫细胞激活的方法、疫苗以及筛选药物的方法。

背景技术：

银屑病俗称牛皮癣，是一种慢性炎症性皮肤病，病程较长，有易复发倾向，有的病例几乎终生不愈。该病发病以青壮年为主，对患者的身体健康和精神状况影响较大。其特征是表皮的过度增殖和真皮的炎症细胞浸润，临床表现以红斑、鳞屑为主，全身均可发病，以头皮、四肢伸侧较为常见，多在冬季加重。

然而，目前对于银屑病仍有待研究。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了试剂在制备药物中的用途、制剂在制备药物中的用途、激活免疫细胞的方法、抑制免疫细胞激活的方法、疫苗以及筛选药物的方法。

在本发明的一个方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于抑制免疫系统激活，所述试剂选自下列的至少之一：(1)白介素25拮抗剂或其功能类似物；(2)il-17rb拮抗剂或其功能类似物；(3)stat3拮抗剂或其功能类似物；(4)白介素17拮抗剂或其功能类似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表达抑制剂。由此，根据本发明实施例的试剂能够有效地抑制免疫细胞活化，从而抑制免疫系统的激活。

根据本发明的实施例，上述试剂在制备药物中的用途还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗自身免疫性疾病。由此，根据本发明实施例的试剂能够有效地抑制免疫细胞活化，抑制免疫系统的激活，从而起到治疗自身免疫性疾病的效果。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗银屑病。由此，根据本发明实施例的试剂能够有效地抑制免疫细胞活化，抑制免疫系统的激活，从而起到治疗银屑病的效果。

在本发明的另一方面，本发明提出了制剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于激活免疫系统，所述制剂选自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能类似物；(b)分泌白介素25或其功能类似物的细胞；(c)白介素25激动剂或其类似物；(d)il-17rb或其功能类似物；(e)il-17rb激动剂或其功能类似物；(f)stat3或其功能类似物；(g)白介素17或其功能类似物；以及(h)(a)～(g)任一项的表达促进剂。由此，根据本发明实施例的制剂能够有效地促进免疫细胞活化，从而激活免疫系统。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗免疫缺陷性疾病。由此，根据本发明实施例的制剂能够有效地促进免疫细胞活化，激活免疫系统，从而起到治疗免疫缺陷性疾病的效果。

根据本发明的实施例，所述分泌白介素25的细胞为角质形成细胞。由此，根据本发明实施例的制剂能够有效地促进免疫细胞活化，激活免疫系统。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种激活免疫细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使免疫细胞与选自下列的至少之一接触：(a)白介素25或其功能类似物；(b)分泌白介素25或其功能类似物的细胞；(c)白介素25激动剂或其类似物；(d)il-17rb或其功能类似物；(e)il-17rb激动剂或其功能类似物；(f)stat3或其功能类似物；(g)白介素17或其功能类似物；以及(h)(a)～(g)任一项的表达促进剂。由此，根据本发明实施例的方法能够有效地激活免疫细胞。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抑制免疫细胞激活的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使免疫细胞与选自下列的至少之一接触：(1)白介素25拮抗剂或其功能类似物；(2)il-17rb拮抗剂或其功能类似物；(3)stat3拮抗剂或其功能类似物；(4)白介素17拮抗剂或其功能类似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表达抑制剂。由此，根据本发明实施例的方法能够有效地抑制免疫细胞激活。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗含有抗原以及选自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能类似物；(b)分泌白介素25或其功能类似物的细胞；(c)白介素25激动剂或其类似物；(d)il-17rb或其功能类似物；(e)il-17rb激动剂或其功能类似物；(f)stat3或其功能类似物；(g)白介素17或其功能类似物；以及(h)(a)～(g)任一项的表达促进剂。由此，根据本发明实施例的方法能够有效地促进免疫细胞活化，从而激活免疫系统，产生相应的抗体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将候选试剂与细胞接触，所述细胞分泌白介素25；以及确定所述接触前后，所述细胞的白介素25表达水平，其中，所述接触后所述白介素25表达升高，是所述候选试剂作为免疫缺陷性疾病药物的指示；所述接触后所述白介素25表达降低，是所述候选试剂作为自身免疫性疾病药物的指示。由此，利用根据本发明实施例的筛选药物的方法能够获得自体免疫疾病药物或免疫激活药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的白介素25诱导小鼠皮肤增厚和炎症的分析示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的银屑病皮肤炎症在白介素25敲除的小鼠中的表型分析示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的白介素17介导的银血病发育过程中起始白介素25表达的分析示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的角质形成细胞中白介素25的敲除对小鼠银屑病症状影响的分析示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的白介素25的受体il-17rb在非髓系中的敲除对imq诱导的银屑病表型影响的分析示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例的银屑病25促进皮肤表皮细胞的增殖且调节皮肤增殖与炎症相关基因的表达的分析示意图；

图7显示了根据本发明一个实施例的接头蛋白act1和stat3的信号通路对于白介素25诱导角质形成细胞增殖影响的分析示意图；以及

图8显示了根据本发明一个实施例的白介素25激活接头蛋白act1和stat3来发挥在角质形成细胞上的功能的分析示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

定义和一般术语

本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。

应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。

除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。

除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。

术语“含有”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

术语“功能类似物”是指具有相似功能的物质，其结构不限定相同，只要具有相同或类似的功能即可。

术语“激动剂”是指与某生物活性物质的受体结合，呈现该活性物质的作用的物质或药品。

术语“拮抗剂”是指能与受体结合，但不具备内在活性的一类物质。拮抗剂分为竞争性拮抗剂和非竞争性拮抗剂。

本发明所使用的“自身免疫性疾病”是指与体液或细胞介导的对身体自身组分应答相关的组织损伤的任意疾病的集合。

本发明提出了试剂在制备药物中的用途、制剂在制备药物中的用途、激活免疫细胞的方法、抑制免疫细胞激活的方法、疫苗以及筛选药物的方法。下面将分别对其进行详细描述。

试剂在制备药物中的用途

在本发明的一个方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于抑制免疫系统激活，所述试剂选自下列的至少之一：(1)白介素25拮抗剂或其功能类似物；(2)il-17rb拮抗剂或其功能类似物；(3)stat3拮抗剂或其功能类似物；(4)白介素17拮抗剂或其功能类似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表达抑制剂。

发明人发现，白介素25能够激活免疫系统，导致一些自身免疫性疾病的发生，例如银屑病。白介素25在银屑病人的皮肤中以及银屑病小鼠模型中高表达，在小鼠皮肤中注射白介素25可以直接诱导出类似银屑病的表型，而类似银屑病表型在白介素25敲除的银屑病小鼠模型中有显著下降。体外实验证明白介素25对角质形成细胞的刺激可以引起多种炎症细胞因子和趋化因子的高表达，且这种作用是通过stat3的激活实现的。发明人经过深入研究发现，白介素25可以刺激其受体il-17rb的酪氨酸磷酸化，从而招募并且激活stat3来产生下游反应。另外，发明人发现，白介素17可以显著诱导白介素25的表达，而白介素17的缺失使得白介素25的表达不管在mrna水平还是蛋白水平都有显著下降。因此，推断出白介素25在银屑病的发病过程中作为白介素17的一个重要的下游因子。为此，白介素25拮抗剂或其功能类似物、il-17rb拮抗剂或其功能类似物、stat3拮抗剂或其功能类似物、白介素25表达抑制剂、il-17rb表达抑制剂以及stat3表达抑制剂均能够有效地抑制炎症细胞因子和趋化因子的高表达，抑制免疫系统激活，从而可以起到预防或者治疗自身免疫性疾病的效果。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗自身免疫性疾病。由此，根据本发明实施例的试剂能够有效地抑制免疫细胞活化，抑制免疫系统的激活，从而起到治疗自身免疫性疾病的效果。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗银屑病。由此，根据本发明实施例的试剂能够有效地抑制免疫细胞活化，抑制免疫系统的激活，从而起到治疗银屑病的效果。

制剂在制备药物中的用途

在本发明的另一方面，本发明提出了制剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于激活免疫系统，所述制剂选自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能类似物；(b)分泌白介素25或其功能类似物的细胞；(c)白介素25激动剂或其类似物；(d)il-17rb或其功能类似物；(e)il-17rb激动剂或其功能类似物；(f)stat3或其功能类似物；(g)白介素17或其功能类似物；以及(h)(a)～(g)任一项的表达促进剂。

发明人发现，白介素25能够激活免疫系统，体外实验证明白介素25对角质形成细胞的刺激可以引起多种细胞因子和趋化因子的高表达，且这种作用是通过stat3的激活实现的。发明人经过深入研究发现，白介素25可以刺激其受体il-17rb的酪氨酸磷酸化，从而招募并且激活stat3来产生下游反应。另外，发明人发现，白介素17可以显著诱导白介素25的表达，而白介素17的缺失使得白介素25的表达不管在mrna水平还是蛋白水平都有显著下降。因此，推断出白介素25作为白介素17的一个重要的下游因子。为此，上述制剂能够有效地促进免疫细胞的高表达，激活免疫系统。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗免疫缺陷性疾病。由此，根据本发明实施例的制剂能够有效地促进免疫细胞活化，激活免疫系统，从而起到治疗免疫缺陷性疾病的效果。

根据本发明的实施例，所述分泌白介素25的细胞为角质形成细胞。发明人发现，角质形成细胞是白介素25的主要来源。由此，根据本发明实施例的制剂能够有效地促进免疫细胞活化，激活免疫系统。

激活免疫细胞的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种激活免疫细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使免疫细胞与选自下列的至少之一接触：(a)白介素25或其功能类似物；(b)分泌白介素25或其功能类似物的细胞；(c)白介素25激动剂或其类似物；(d)il-17rb或其功能类似物；(e)il-17rb激动剂或其功能类似物；(f)stat3或其功能类似物；(g)白介素17或其功能类似物；以及(h)(a)～(g)任一项的表达促进剂。由此，根据本发明实施例的方法能够有效地激活免疫细胞。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对制剂在制备药物中的用途所描述的特征和优点，同样适用于该激活免疫细胞的方法，在此不再赘述。

抑制免疫细胞激活的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抑制免疫细胞激活的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使免疫细胞与选自下列的至少之一接触：(1)白介素25拮抗剂或其功能类似物；(2)il-17rb拮抗剂或其功能类似物；(3)stat3拮抗剂或其功能类似物；(4)白介素17拮抗剂或其功能类似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表达抑制剂。由此，根据本发明实施例的方法能够有效地抑制免疫细胞激活。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对试剂在制备药物中的用途所描述的特征和优点，同样适用于该抑制免疫细胞激活的方法，在此不再赘述。

疫苗

在本发明的又一方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗含有抗原以及选自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能类似物；(b)分泌白介素25或其功能类似物的细胞；(c)白介素25激动剂或其类似物；(d)il-17rb或其功能类似物；(e)il-17rb激动剂或其功能类似物；(f)stat3或其功能类似物；(g)白介素17或其功能类似物；以及(h)(a)～(g)任一项的表达促进剂。由此，根据本发明实施例的方法能够有效地促进免疫细胞活化，从而激活免疫系统，产生相应的抗体。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对制剂在制备药物中的用途所描述的特征和优点，同样适用于该疫苗，在此不再赘述。

筛选药物的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将候选试剂与细胞接触，所述细胞分泌白介素25；以及确定所述接触前后，所述细胞的白介素25表达水平，其中，所述接触后所述白介素25表达升高，是所述候选试剂作为免疫缺陷性疾病药物的指示；所述接触后所述白介素25表达降低，是所述候选试剂作为自身免疫性疾病药物的指示。

如前所述，白介素25的高表达能够促进免疫细胞活化，进而激活免疫系统，起到预防和治疗免疫缺陷性疾病的效果；白介素25表达被抑制会抑制免疫细胞活化，进而抑制免疫系统，起到预防和治疗自身免疫性疾病的效果。由此，利用根据本发明实施例的筛选药物的方法能够获得自体免疫疾病药物或免疫激活药物。

需要说明的是，“细胞分泌白介素25”应作广义理解，主要是指该细胞能够分泌白介素25或者具有分泌白介素25的潜能。根据本发明的具体实施例，所述细胞为角质形成细胞。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

为了研究白介素25在银屑病中的作用，首先检测了在银屑病病人中白介素25的表达。和正常病人的皮肤相比，银屑病病人皮肤中的白介素25的表达在mrna和蛋白水平都有显著上升。imq是一种普遍用来在小鼠身上诱导银屑病表型的一种药，采用该方法建立了小鼠银屑病模型，在小鼠皮肤中，白介素25在mrna和蛋白水平均高表达。

为了进一步探索25的作用，采用在皮肤中直接注射白介素25的蛋白。在一段时间的注射之后，皮肤表现出类似银屑病的特征，包括表皮的过度增殖，真皮炎症细胞的浸润。更为重要的是，白介素25的注射显著地在皮肤中提高了白介素25本身以及其受体的表达，还包括白介素17、白介素17c的表达，而白介素17和17c是已经被证实在银屑病发育过程中起重要作用的。

以上的数据暗示了白介素25在银屑病的发育过程中可能的重要作用。为了进一步确证这种作用，在白介素25缺失的小鼠上诱导了imq银屑病模型，结果如图1和图2所示。图1中，a：白介素25在正常皮肤和牛皮癣患者中的基因表达；b：白介素25在正常和银屑病患者皮肤石蜡切片中的免疫荧光染色；c：白介素25在正常和imiquimod处理的小鼠皮肤中mrna水平的表达；d：在正常小鼠皮肤以及imq处理过的小鼠皮肤切片中白介素25的免疫荧光染色；e：分别用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射的c57bl/6小鼠背部皮肤然后进行色；f：用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射c57bl/6小鼠的耳朵，进行的h&e染色；g：用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射c57bl/6小鼠耳朵，每天测试小鼠耳朵厚度；h：用pbs或者il-25注射小鼠皮肤后两组间部分基因的表达变化。实验结果重复三次，结果一致。比例尺在(b)和(d)中代表100μm，在(e)和(f)中代表50μm(放大图)或100μm(缩小图)。*p<0.05，**p<0.01；n.s.，没有差别，p值用t-test来决定，数据以平均值正负标注误的形式来表示。

图2中，a：野生型小鼠和白介素25基因敲除小鼠分别涂抹imq(咪喹莫特)来诱导银屑病，持续3.5天做h&e染色并做表皮与真皮厚度统计。同时，分离真皮细胞并做流式分析髓系细胞比例，即cd45+细胞在各组中的比例(见b)；c：分析真皮髓系细胞同时分析在cd45+细胞中各种类型细胞的比例变化。实验结果重复三次,结果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，没有差别，p值用t-test来决定，数据以平均值正负标注误的形式来表示。

结果表明，这种小鼠的银屑病表型的严重程度要远远轻于野生型的诱导了银屑病模型的小鼠，而且这种小鼠皮肤中免疫细胞的数量和比例也要远低于野生型的小鼠。真皮中减少的免疫细胞包括树突状细胞、巨噬细胞和γδt细胞。除了中性粒细胞的比例相对于野生型有略微上升，这些细胞的比例和总细胞数都相对于野生型有较明显的下降。同时，白介素25的缺失还导致了例如白介素17、22、6、23的mrna表达量下降。

总之，以上数据表明白介素25确实在银屑病的发生发育过程中起重要作用。

实施例2

免疫荧光的数据证明了白介素25只在银屑病皮肤的表皮层有表达，暗示了角质形成细胞可能是白介素25的主要来源。由于缺乏托样受体7/8，角质形成细胞不能直接对imq做出反应。为了证实白介素25是如何在皮肤中被起始表达的，在体外培养了角质形成细胞并用不同的已经被证实在银屑病发生过程中有作用的因子去刺激这些细胞来检测白介素25的表达被诱导的情况，这些因子包括白介素17、17c和tnf-α等。结果如图3所示。其中a：在体外培养角质形成细胞并用不同的细胞因子去刺激来检测白介素25的表达被诱导的情况；b和c：在银屑病模型中，白介素25的表达在白介素17的缺失小鼠中不管在mrna水平还是蛋白水平都有显著下降。实验结果重复三次，结果一致。比例尺在(c)中代表100μm，*p<0.05，**p<0.01；n.s.，没有差别，p值用t-test来决定，数据以平均值正负标注误的形式来表示。

结果表明，在这些因子当中，只有白介素17可以显著地诱导白介素25的表达。而白介素17的缺失导致在银屑病模型中白介素25的表达不管在mrna水平还是蛋白水平都有显著下降。因此，白介素25可能在银屑病的发病过程中作为白介素17的一个重要的下游因子。

实施例3

因为白介素25的表达主要局限于高增生角质形成细胞在银屑病人的损伤皮肤中，从而假设在角质形成细胞中表达的白介素25可促进银屑病的发展。图4表明了角质形成细胞中特异性的白介素25敲除使得小鼠中银屑病症状下降。其中，a：野生型小鼠和白介素25特异性皮肤表皮细胞基因敲除小鼠(il-25f/fk5cre)分别涂抹imq(咪喹莫特)来诱导银屑病，持续3.5天做h&e染色并做表皮与真皮厚度统计，同时，分离真皮细胞并做流式分析髓系细胞比例，即cd45+细胞在各组中的比例(见图b)；c：分析真皮髓系细胞同时分析在cd45+细胞中各种类型细胞的比例变化。实验结果重复三次,结果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，没有差别，p值用t-test来决定，数据以平均值正负标注误的形式来表示。

白介素25基因(il25)的floxed小鼠与k5cre基因小鼠杂交可在角质形成细胞中选择性去除角质形成细胞的il25表达。il25的表达在诱导了银屑病模型的小il25f/fk5cre小鼠相比imq诱导wt小鼠皮损中明显降低。类似于il25生殖系基因敲除小鼠，白介素25在角质形成细胞中的缺乏大大降低表皮棘细胞增生，真皮厚度和真皮层免疫细胞浸润。此外，树突状细胞(cd45⁺、cd11c⁺)、中性粒细胞(cd45⁺、cd3^-、cd11b⁺、gr1⁺)和δt细胞(cd45⁺、cd3⁺、δt⁺)的数量和百分比的都降低，但与il25f/fk5cre的银屑病模型小鼠相比，il25f/f组中，巨噬细胞(cd45+cd3-cd11b+f4/80+)的数量没有明显减少。这些数据表明，表皮角质形成细胞产生的白细胞介素25可以作为驱动的牛皮癣病理发展的主要来源。

实施例4

白细胞介素25可以通过靶标到白介素受体复合物il17rb和il17ra作用到机体的免疫及非免疫细胞。为了确认白介素25如何通过激活的il17rb的活动，首先用重组白细胞介素25来刺激小鼠角质形成细胞。结果如图5所示。其中，a：在体外培养角质形成细胞并用白介素25去刺激来检测白介素25和其受体il-17rb的表达；b：野生型小鼠和白介素25基因受体敲除小鼠分别涂抹imq(咪喹莫特)来诱导银屑病，持续3.5天做h&e染色并做表皮与真皮厚度统计，同时，分离真皮细胞并做流式分析髓系细胞比例，即cd45⁺细胞在各组中的比例(见图c)；d：分析白介素25受体在白介素25敲除的小鼠的银屑病模型皮肤的mrna水平的表达。实验结果重复三次，结果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，没有差别。p值用t-test来决定，数据以平均值正负标注误的形式来表示。

白细胞介素25的刺激大大增强原发性角质形成细胞中il17rb和il25的表达(图5a)。接下来，应用il17rb^/-小鼠银屑病模型，发现银屑病病理在imq诱导il17rb^-/-的小鼠中大大减轻(图5b)。此外，还观察到il17rb的表达在il25缺陷小鼠的表皮中大大减少(图5c，5d)。为了进一步评估银屑病模型中白介素25的靶细胞，进行了骨髓转移实验，从骨髓细胞分离的wt和il17rb^/-小鼠分别转入受致死剂量照射wt或il17rb^-/-小鼠，8周后，受鼠用imq诱发银屑病。il17rb^-/-受体小鼠有明显缓解的银屑病样症状，而il17rb^-/-的供体骨髓细胞则无此表型(图5e)。综上所述，白介素25调节很大程度上是通过靶向非造血细胞来调节银屑病的发生，且很有可能是通过自分泌的形式。

实施例5

为了确定白介素25中角质形成细胞的功能下游因子，用白介素25刺激角质形成细胞8小时，然后用rna测序的方法研究白介素25调节的基因mrna情况。总体上，在白介素25的刺激下，8,449种基因表达上调，7,272种基因表达下调。白细胞介素-25诱导的基因中，其中有大量的趋化因子和细胞因子可以吸引或诱导各种银屑病相关免疫细胞到皮肤中，包括ccl2可以招募单核细胞、t细胞和树突状细胞，ccl7可以招募单核细胞、单核细胞和t细胞，cx3cl1和csf3可刺激粒系造血细胞。此外，许多白细胞介素25诱导的基因曾被报道可调控细胞增殖和细胞周期进程，包括ccl2，fn1。

因此，白介素25可能通过调节细胞增殖和诱导炎症基因来促进银屑病发展。为了做进一步的证实，用白细胞介素25在体外刺激角质形成细胞。具体地，从小鼠中分离培养角质形成细胞并用白介素25刺激8h，以培养基作为对照，提取rna做表达谱测序检测。结果如图6所示。其中，a：对白介素25调节的差异表达基因信号通路的分析；b：白介素25调节的基因的散点图；c：原代角质形成细胞用白介素25或是培养基刺激在不同浓度和时间点计算细胞数变化；e：培养小鼠皮肤角质细胞并用白介素25去刺激，48h后染ki67去看细胞增殖状态；f：培养小鼠皮肤角质细胞用白介素25去刺激，24h后染dapi看细胞周期变化；g：在野生型和白介素25缺失的小鼠皮肤中做ki67的免疫荧光染色(10x)；比例尺代表50μm；*p<0.05。**p<0.01；n.s.，没有差别。p值用t-test来决定。数据以平均值正负标注误的形式来表示。

发现白介素25在较后的时间点(图6d)以剂量依赖的方式(图6c)促进促进细胞增殖提高细胞数量。同样地，白介素25也提高了增殖标记ki67的表达比例(图6e)，且有更多的细胞进入活跃细胞周期(s和g2/m期)(图6f)。相反，il25缺失大大减少诱导银屑病的小鼠皮肤表皮层组化染色的ki67的比例和数量(图6g和图6a)，进一步表明白介素25在调节角质形成细胞在银屑病发病中的增殖的必不可少的作用。

实施例6

在此将研究白介素25介导角质形成细胞增殖和炎症因子产生的信号转导机制。此前已知act1作为接头蛋白，介导白细胞介素25信号通路，我们比较了wt和act1/-小鼠角质形成细胞中几种白介素25介导的相关基因表达与细胞增殖或或与炎症反应有关的基因。结果如图7所示。其中，a：在野生型和act1缺失的角质形成细胞中用白介素25刺激或是不刺激8h，观察由rnaseq挑选出的基因的表达诱导情况；b：在野生型和act1缺失的角质形成细胞中，用白介素25刺激或是不刺激24h去看细胞增殖标记ki67(左)以及细胞周期(右)变化；c：角质形成细胞用白介素25刺激或者24小时，观察stat3在两组中的磷酸化情况；d：磷酸化stat3(p-stat3)在用pbs或是经过白介素25注射诱导16天后的皮肤中的免疫组化；e：角质形成细胞用白介素25刺激或者不刺激24h，在stat3磷酸化抑制剂或者白介素6抗体处理或是不处理的情况下的ki67和细胞周期分析；f：角质形成细胞用白介素25刺激或是不刺激或是加上stat3的磷酸酶抑制剂之后并处理8h之后，观察挑选出来的rnaseq相关基因的表达变化。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，没有差别。p值用t-test来决定。数据以平均值正负标注误的形式来表示。

act1的缺失会使白介素25的刺激作用消失。此外，正如所预测的那样，被白介素25诱导的角质形成细胞增殖依赖于act1(图7b)。

stat3是众所周知的在不同细胞中控制细胞周期和细胞增殖的因子，其中包括角质形成细胞，并已被证明能够参与银屑病样皮肤炎症。为了确定白介素25是否可以调节通过活化stat3来调节角质形成细胞增殖，我们测试了角质形成细胞在白介素25的刺激下stat3的磷酸化。结果表明，白介素25的刺激在24个小时导致了明显的stat3磷酸化(图7c)。同样地，皮肤注射白细胞介素25也诱导明显stat3磷酸化(图7d)。此外，阻断stat3激活的stat3的抑制剂sttatic显著减少白细胞介素25诱导的角质形成细胞增殖和细胞周期变化，且这个过程是独立于白细胞介素6的作用的(图7e)。我们还发现与角质形成细胞增殖相关的基因表达或与招募炎症细胞相关的基因中，如ccl2、ccl7和csf3，取决于stat3的激活，而其他的基因，如naip5和dclre1c，则独立的stat3激活(图7f)。总之，act1和stat3信号对于白介素25诱导角质形成细胞增殖和细胞因子和趋化因子的表达是非常必要的。

实施例7

上述的数据表明，白介素25对角质形成细胞的有丝分裂影响依赖stat3激活但独立白细胞介素6介导的信号(图7e和7f)，由此，预测白介素25可以直接激活stat3。为了检验这种可能性，用白介素25体外刺激角质形成细胞，在较短的时间内进行stat3激活的检测以排除这种作用是二级作用。图8表明了白介素25可激活接头蛋白act1和stat3来发挥在角质形成细胞上的功能。其中，a：用白介素25刺激从野生型和act1缺失的乳鼠中分离的原代角质形成细胞细胞，在不同时间点收集细胞做免疫印迹实验，研究p-stat3和stat3的蛋白表达；b：野生型角质形成细胞用白介素25刺激，在白介素6中和抗体或是jak1/2抑制剂处理或者不处理情况下研究p-stat3和stat3的表达；c：在293t细胞中过表达ha标签的白介素25受体il-17rb和stat3或是空质粒和stat3，收集细胞裂解，免疫共沉淀il-17rb，接着免疫印迹stat3和ha标签；d：在293t细胞中过表达ha标签的白介素25受体il-17rb，不同的时间点用白介素25刺激，收集细胞免疫共沉淀ha标签蛋白，免疫印迹酪氨酸磷酸化抗体和ha标签抗体；e：培养小鼠原代角质形成细胞用白介素25刺激一小时，用受体白介素25的另一受体il-17ra进行免疫共沉淀，免疫印迹il-17ra和stat3。

与功能检测(图7e)结果一致，白介素25在10分钟后诱导明显stat3磷酸化，且这个过程依赖于act1，但是独立于白细胞介素6。并且，与报道的一样，这种作用在jak1/2抑制剂处理下完全消失(图8a、8b)。这一结果表明stat3可能被白介素25直接激活。接下来我们在293t细胞中用ha标记的il-17rb检验了stat3是否能与il-17rb直接相互作用。意外发现，在免疫沉淀后的含il-17rb的蛋白复合物中检测到stat3(图8c)。此外，白介素25能在10分钟后诱导il17rb上的酪氨酸磷酸化(图8d)。因为白介素25是通过结合到il-17ra/il-17rb复合物受体来进行下游信号转导，我们研究在小鼠角质形成细胞中白细胞介素25的刺激是否能促进il-17ra/rb复合物与stat3的相互作用。内源性白细胞介素-17ra被发现与stat3基因共同沉淀(图8e)。综上所述，研究结果为白介素25在角质形成细胞中可以直接激活stat3的磷酸化的提供了实验证据。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。