本申请为专利申请201310298737.1的分案申请，原案发明名称为“一种禽流感疫苗组合物及其制备方法和应用”。
本发明涉及兽用生物制品，特别是涉及一种禽流感疫苗及其在预防和/或治疗不同亚型禽流感病毒的药物中的应用。
背景技术：
禽流感(avianinfluenza，ai)是禽流行性感冒的简称，由禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)引起的多种禽类感染的急性呼吸道传染病，也能感染人类，被国际兽医局(oie)和我国《家畜家禽防疫条例》列为a类烈性传染病。
流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属，含有囊膜、为多形态的负链rna病毒。根据流感病毒内部核蛋白(nucleoprotein，np)和基质蛋白(matrixprotein，mp)抗原及其基因特性的不同，可将流感病毒分为甲(a)、乙(b)、丙(c)三种类型，其中，能够引起大流行的流感病毒主要是甲型。禽流感病毒即为甲型流感病毒，其基因组共由8个单独的负链rna片段组成，由片段1至片段8依次为pb1、pb2、pa、ha、np、na、m、ns。
根据位于禽流感病毒囊膜上的血凝素ha(hemagglutinins，由禽流感基因组的第4个片段编码)和神经氨酸酶na(neuraminidase，由禽流感基因组的第6个片段编码)抗原性的不同，禽流感病毒可分为若干个亚型，目前已知的ha有16个亚型(h1-h16)、na有9个亚型(n1-n9)，这两种不同的亚型之间可以进行自由组配，从而形成一个庞大而复杂的禽流感病毒家族。正是由于流感病毒基因组自身的特点决定了其不断发生抗原漂移和抗原转换，从而使得新的流行毒株不断出现。目前，世界上的许多国家和地区都对该病进行过相关报道，常见的且能感染人的高致病性禽流感病毒以h5n1、h7n7、h9n2为代表，以快速爆发和高死亡率为主要临床特征，常常导致饲养的鸡群全部死亡；这一事件也表明家禽是人畜传播潜在的中间宿主。特别地，近期发生的禽流感h7n9疫情，不仅使感染的人类出现高死亡现象，而且带来恶性的连锁反应，使家禽业这一整个产业都遭遇重大的危机，给人类和家禽的预防、控制流感疫情带来了严峻的挑战。
截止到目前，接种疫苗仍然是预防和控制禽流感病毒大流行的最有效手段。由于禽流感病毒的变异速度远远大于变异株相应疫苗的制备速度，尤其是ha和na抗原性的变异频率较高，而且不同亚型之间几乎上不产生交叉免疫保护。如果禽流感疫苗的生产随着病毒的变异而不断更新，那么针对流感病毒流行株相应疫苗的生产周期较长、生产成本较高，造成人力、物力的浪费，还可能达不到预想的防控效果。因而，制备通用流感疫苗已博得世界各国科学家和疫苗生产公司的青睐，所谓的通用流感疫苗是指一种能够预防所有流感病毒毒株，并可诱导持久性保护性免疫的流感疫苗。
由禽流感病毒基因组第7片段编码的m蛋白(matrixproteins)为基质蛋白，其基因含有两个开放的阅读框(orf)，可转录出两个rna分子，分别翻译出两种基质蛋白m1和m2。其中，基质蛋白m2是禽流感病毒蛋白中除ha、na外的第三种跨膜蛋白，由三个区域(即n端24个氨基酸残基组成的胞外域、19个氨基酸组成的跨膜区、54个氨基酸残基组成的胞浆尾)组成，不含糖基，具有高度保守性。特别地，m2胞外部分的n端24氨基酸肽段(即m2e)在所测得的禽流感和人流感病毒中，其基因序列几乎完全相同。这表明以m2蛋白作为抗原的主要成分，可对不同亚型的禽流感病毒产生保护性免疫，是研究交叉保护性流感疫苗的理想候选抗原。另外，现有的研究结果还表明：m2蛋白的功能主要包括两点，(1)在流感病毒表面血凝素糖蛋白的合成过程中，m2蛋白作为质子通道控制高尔基体跨膜转移通道的ph值，从而导致ha的结构发生改变；(2)在病毒脱壳时，m2蛋白可酸化病毒粒子形成病毒包涵体颗粒的内部环境，引起细胞质内的ha和m1、m1和rnps之间或者rnps蛋白自身解聚。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种新型的禽流感疫苗，该疫苗既能对不同亚型禽流感病毒产生交叉保护性免疫，又能在减少免疫剂量的条件下达到明显的免疫效果，还能延长疫苗的免疫保护时间。
本发明的主要目的在于提供一种禽流感疫苗组合物，所述的禽流感疫苗组合物包括脂质体、免疫量的m2和/或3m2e蛋白；所述m2蛋白的序列为seqidno.2，所述3m2e蛋白的序列为seqidno.4。
本发明所述的m2蛋白基因的核苷酸序列可以为seqidno.1。
本发明所述的3m2e蛋白基因的核苷酸序列可以为seqidno.3，其中，所述的3m2e是指将m2蛋白膜外部分n端的24个氨基酸肽段m2e串联成三拷贝的形式。
优选地，所述的脂质体膜材包括磷脂、固醇类；更优选地，所述脂质体的膜材包括卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇乙酰、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、硬质酰胺、二氧乙烯十六烷基醚、四氧乙烯十二烷基醚中的一种或几种。
脂质体的膜材主要由磷脂与胆固醇构成，这两种成分不但是形成脂质体双分子层的基础物质，而且本身也具有极为重要的生理功能。其中，磷脂类包括天然磷脂和合成磷脂二类，磷脂的结构特点为一个磷酸基和一个季铵盐基组成的亲水性基团，以及由两个较长的羟基组成的亲脂性基团；胆固醇是两亲性物质，与磷脂混合使用，可以调节双分子层的流动性、减低脂质体膜的通透性等。由它们所形成的“人工生物膜”易被机体消化分解，不像合成微囊(如尼龙微型胶囊)那样往往在机体中难以排除。
优选地，所述的脂质体是中性脂质体、负电性脂质体或正电性脂质体；更优选地，所述的脂质体为正电性脂质体。
优选地，所述的脂质体将m2和/或3m2e包裹于脂质体内或镶嵌于脂质体膜中或由于电荷作用而吸附于膜上。
优选地，所述的脂质体为小单室、大单室和多室脂质体共存的脂质体。
优选地，所述的流感疫苗单位剂量中含流感病毒m2和/或3m2e蛋白组分的含量为40-500μg，优选为50-100μg。
本发明所述的脂质体是一种生物膜双分子层囊性微球，由水相中脂质双层疏水区的脂肪链通过疏水键相互聚集自行收缩排列而形成。
本发明所述的流感疫苗在脂质体的作用下，可在注射部位形成抗原库，使抗原缓慢释放，引起注射部位的炎性反应，增加细胞的穿透能力，提高注射部位的抗原递呈细胞浓度，使抗原易被抗原递呈细胞吞噬，并诱导产生细胞因子如il-2、il-4、il-6、il-12、tnf-α、ifn-α、il-10、ifn-γ等；而且由于巨噬细胞摄取脂质体后破坏其膜结构，以及补体依赖的脂质体免疫溶解作用，产生抗原释放并形成免疫复合物，而经后者又能使其维持长期的效价抗体及产生免疫记忆所致。在脂质体膜的保护下，抗原分子可以不受体液成分的破坏，脂质体类疫苗可用于多种黏膜途径的免疫接种。更重要地，脂质体还是理想的免疫佐剂，能同时激活机体产生细胞免疫和体液免疫，通过诱导抗原递呈细胞产生协同刺激因子，增加主要组织相容性抗原的表达，使抗原递呈成熟，增强抗原的递呈作用。
总而言之，脂质体是用作疫苗的传递载体和免疫佐剂的良好选择。
优选地，所述的禽流感疫苗组合物进一步包括免疫调节组分，所述免疫调节组分优选维生素e。
本发明的另一目的在于提供一种制备所述的禽流感疫苗组合物的方法，所述制备方法包括：
(1)将m2、3m2e蛋白分别用含稳定剂的缓冲液制备成禽流感抗原原液；
(2)将脂质体原料溶于有机溶剂中，将所述脂质体溶液于旋转蒸发仪中真空旋转蒸发，成膜；在膜材中加入所述缓冲液，并加入几粒小玻璃珠，旋转蒸发，待薄膜从瓶壁上完全脱落后，静置得空脂质体；
(3)将所述禽流感抗原原液加入制得的空脂质体中，用高压匀浆机高压均质循环脂质体颗粒，除菌过滤，即成所述禽流感疫苗组合物。
优选地，所述步骤(1)中的所述稳定剂为氨基酸、单糖、二糖、多元醇中的一种或几种；所述步骤(2)中的所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一种或几种；所述步骤(2)中所述膜材的终浓度为1％-5％(w/w)，优选为2％(w/w)；所述步骤(2)中所述旋转蒸发温度为30-65℃,所述高压压力为15-30kpa；所述步骤(1)、(2)中的所述缓冲液为ph值为5.4-7.8范围内的磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、碳酸钠缓冲液、生理盐水中的一种或几种。
本发明所述禽流感疫苗组合物制备方法，还包括薄膜法与冷冻干燥法相结合法、逆相蒸发法与冷冻干燥法结合、薄膜分散法、冷冻干燥法、注入法、加压挤出法、熔融法、复乳法、冻融法、表面活性剂处理法、前脂质体法、空白前脂质体法、ph及醋酸梯度法等。
本发明的再一目的在于提供所述的禽流感疫苗在制备预防和/或治疗不同亚型禽流感的药物中的应用。
本发明提供了所述的m2或3m2e蛋白以及流感疫苗在制备预防和/或治疗不同亚型禽流感的药物中的应用。
本发明所述的流感疫苗在制备用于保护动物免患不同亚型禽流感所引起的疾病的疫苗中的应用时，所用流感疫苗的免疫量为0.3ml/羽。所述流感疫苗在给予免疫动物时，可以通过腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服途径、静脉注射或鼻内途径，优选为通过皮下注射或肌肉注射。
基于此，本发明具有以下突出的优点：
(1)本发明所述的流感疫苗具有广谱性，能抗多种型或亚型的禽流感病毒，免疫动物后可诱导动物产生抗多种亚型禽流感病毒的抗体；
(2)本发明所述的流感疫苗具有持久性，在脂质体的作用下具有缓慢释放抗原的效能，给予动物免疫后可使机体延缓肾排泄和代谢，从而延长作用时间。
(3)本发明所述的禽流感疫苗利用脂质体所具有的生物膜双分子层形成的囊泡微球将流感疫苗所含抗原的主要组分m2和/或3m2e蛋白进行包含。该疫苗在脂质体的作用下，能将包含的抗原高效、靶向地载给抗原递呈细胞，能同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，具有广谱性和持久性，且可被机体降解无毒副作用，该疫苗有利于大规模生产。
序列表中：
序列1为m2核苷酸序列；
序列2为m2氨基酸序列；
序列3为3m2e核苷酸序列；
序列4为3m2e氨基酸序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本实施例中所用的“免疫量”是指提供针对流感疫苗的免疫剂量，主要取决于以下因素：被免疫动物的物种、品种、年龄、重量大小、健康状态以及动物之前是否接受过对抗同样病毒的疫苗。
本实施例中所用的免疫调节组分优选为维生素e(ve)。
本实施例中所用的稳定剂优选为海藻糖。
本实施例中所用的h9亚型禽流感病毒分离株包含禽流感病毒h9亚型sz株(aivaninfluenzavirush9subtypestrainsz)，其保藏编号为：cctccno:v201240，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)，保藏日期：2012年9月16日。
下述实施例中所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1人工合成m2、3m2e蛋白
根据ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)报道的a/duck/hongkong/y439/97(h9n2，登录号：af156462)中m2、m2e蛋白基因的核苷酸序列(详见序列表seqidno.1和seqidno.3)，经人工分别合成m2、3m2e蛋白的氨基酸多肽序列(详见序列表seqidno.2和seqidno.4)，所合成多肽序列经高效液相色谱纯化，分别得到纯化后的m2、3m2e蛋白。然后，将m2、3m2e蛋白分别用含1％海藻糖的生理盐水制备成1mg/ml的储备液。
实施例2流感疫苗的制备
本发明所述的流感疫苗的制备方法之薄膜法与冷冻干燥法相结合，包括以下操作步骤：
(1)将大豆卵磷脂m1、胆固醇m2、维生素e(ve)m3按表1的量混合溶于v1三氯甲烷中，将该溶液置于旋转蒸发仪的茄型瓶中，45℃水浴作为蒸发温度，真空旋转蒸发，成膜。
(2)按膜材终浓度为2％(w/w)加生理盐水v2，加入几粒小玻璃珠，45℃旋转蒸发，待薄膜从瓶壁上完全脱落后，静置约25min，使瓶中液体呈乳白色悬浊液。
(3)将不同浓度和体积的禽流感抗原液(含1％海藻糖)v3加入制得的空脂质体中，用高压匀浆机在15-30kpa的高压下均质循环脂质体颗粒5次，除菌过滤后即为所制备的流感疫苗，单位剂量中含流感病毒m2和/或3m2e蛋白组分的含量分别为500、80、80、40μg(详情见表1)。并对制得的流感疫苗进行适当的稀释，使单位剂量所含含流感病毒m2和/或3m2e蛋白组分的含量均为40μg，灭菌后进行分装，5ml/瓶。
表1不同膜材和抗原液制备出的流感疫苗
附：抗原液160μg/ml为抗原储备液稀释6.25×所得，抗原液80μg/ml为抗原液160μg/ml稀释2×所得。
同时制备不含禽流感抗原组分的空白脂质体，作为阴性对照。
实施例3动物实验
选用3周龄spf鸡120只，随机分成6组，20只/组，分别经皮下注射自制的流感疫苗、空白脂质体、生理盐水(作为空白对照)，注射剂量0.3ml/羽。
于免疫后的第0天、第15天、第30天、第45天、第60天、第90天，分别采集并分离各试验组的血清。同时，以间接elisa法检测血清抗m2或m2e抗体效价，具体操作步骤为：将m2或m2e蛋白储备溶液用生理盐水稀释至1μg/ml，包被96孔板，50μl/孔，4℃包被过夜；使用含5％脱脂奶粉的封闭液进行封闭；洗涤后，加入待检的稀释血清，50μl/孔，37℃反应2h；洗涤后，加入酶标二抗，50μl/孔，37℃孵育2h；然后，加入底物进行显色，使用酶标仪读取吸光光度值，检测结果如表2所示。
表2不同时间段各试验组elisa抗体效价的检测结果汇总
由表2可知：不同抗原含量的流感疫苗免疫后的抗体滴度均于免疫后15天开始上升，并于第30天达到最大值，即流感疫苗1、2、4均达到1:2048，流感疫苗3的最高，高达1:4096；且持续至第60天左右，而空白脂质体对照组和生理盐水空白对照组均未产生特异性抗体。
实施例4攻毒保护实验
免疫后第90天，将每个免疫组和对照组的20只随机分成10只/亚组。每个免疫亚组和对照亚组分别用禽流感sz株(cctccno:v201240)及hl株(见文献：禽流感病毒(h9n2亚型，hl株)与国内部分省禽流感病毒(h9亚型)流行株相关性及交互免疫的研究，2007年畜牧兽医学会年会论文集，2007，35-38)进行攻毒。
其中，禽流感病毒sz株(avianinfluenzavirus(h9subtype)strainsz)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2012年9月16日，保藏编号为cctccno:v201240。
通过皮下注射攻毒，攻毒剂量为0.2ml/羽攻毒。攻毒后第5天，采集气管与泄殖腔拭子，每个样品分别接种于5枚10日龄的spf鸡胚，37℃继续孵育，每日照检，死胚及时取出(24h内死胚弃去)，并检测鸡胚液血凝价，至接种后5天，将剩余活胚全部冻死后，逐胚测定血凝价，以5枚鸡胚中至少有1枚鸡胚液血凝价≥1:16(微量法)判为感染。对病毒感染为阴性的鸡胚，应盲传1次，再测定血凝价，检测结果详见表3。
表3可知：免疫后第90天，不同抗原含量的流感疫苗各免疫亚组可完全抵抗h9亚型禽流感病毒sz株(cctccno:v201240)和hl株毒株的攻击，可获得完全保护；而空白脂质体对照各亚组病毒分离率分别为80％和90％，生理盐水空白对照各亚组病毒分离率分别为90％和100％。
表3各亚组攻毒后的病毒分离结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>普莱柯生物工程股份有限公司
<120>一种禽流感疫苗组合物及其制备方法和应用
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