专利名称：：一种Ⅱ型胶原海绵支架及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物医学领域，涉及一种组织工程中软骨修复用的II型胶原海绵支架。
背景技术：
：软骨缺损在临床上尚无特效治疗方法，组织工程软骨移植是目前治疗软骨缺损最新、最有希望的治疗技术之一，即将体外培养的种子细胞种植于天然或人工合成的、可在机体降解和吸收的材料支架上，然后将复合物移植入动物或人体内的缺损部位，形成具有类似软骨结构和功能的组织，从而完成缺损部位的修复与再造。组织工程对支架材料的要求较高，它决定了组织工程软骨的质量。为了寻找理想的软骨移植材料，国内外的学者对各种材料做了大量研究。如对聚乳酸、聚乳酸二聚羟基乙酸(PLGA)、聚酐等多种人工合成材料进行了体外或在体实验研究后发现，人工合成材料缺乏粘附能力，细胞容易滑落，难以进入多孔的支架材料中生长繁殖，另外其降解产物还有一定的毒性。胶原是人体内含量最丰富的蛋白，具有良好的生物相容性，生物降解性，低免疫原性，广泛应用于生物医用材料领域，胶原作为支架材料在组织工程研究应用中主要以广泛存在于体内的I型胶原为主，如人工骨、人造皮肤、人造血管的研究等等。II型胶原是透明软骨的主要成份之一，是维持软骨细胞功能的关键角色，在体内主要存在于透明软骨及弹性软骨中，II型胶原由正常软骨细胞分泌。II型胶原在维持软骨组织结构完整性方面具有多种生理功能，例如，传送营养到细胞，通过细胞表面受体的相互作用进行生理上的调节，支持从基质到细胞之间传送信息等，其在调节细胞的存活、繁殖、分化、骨重塑和软骨形4成中扮演重要角色。但由于n型胶原提取方法复杂，材料支架成形的研究及动物实验相对困难，目前有很多n型胶原提取方法的文献报道，但提取的多为混合物或粗提物，中国第200810045418号专利申请"一种医用级II型胶原的制备方法"及叶春婷、李斯明等在《中国矫形外科杂志》2001年1月第8巻第l期上的"II型胶原的研制及其在软骨细胞培养中的应用"和《生物医学工程学杂志》上的"高纯度猪软骨n型胶原的制备与检测，，等文献公开了的目前较为理想的n型胶原的提取方法，可以得到高纯度的n型胶原。以此为基础，把提取得到的n型胶原冷冻干燥，得到的胶原海绵易溶于水，难以作为细胞培养支架材料；也有文献报道采用凝胶状II型胶原作为组织工程移植材料，但其缺乏力学强度，移植到体内后迅速被机体溶解吸收，由于该n型胶原支架分解吸收速度过快，软骨组织还没有成型，难以达到软骨修复的目的。
发明内容为了克服上述缺陷，本发明提供一种具有合适孔径及力学性能的软骨ii型胶原海绵支架。本发明的n型胶原海绵支架，是通过如下方法制备的(1)n型胶原溶液的制备，提供高纯度n型胶原溶液；(2)n型胶原溶液的浓缩，将步骤(i)得到的n型胶原溶液注入透析袋中，用足量的聚乙二醇粉剂包埋透析袋，然后置于低温下浓缩，收集备用；(3)冷冻干燥，将步骤(2)得到的浓缩n型胶原溶液注入冻干瓶中，于-80。C低温冰箱中冷冻，然后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即得均匀连通孔径的n型胶原海绵；(4)交联，配制碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液作交联剂，将步骤(3)得到的n型胶原海绵浸泡在上述交联剂中进行交联，交联后的n型胶原海绵用蒸馏水清洗干净，再进行步骤(3)的冷冻干燥步骤，即得n型胶原海绵支架。其中，步骤(2)中用聚乙二醇粉剂包埋透析袋后，置于4。C下浓缩1.5小时。步骤(3)中浓缩n型胶原溶液在冻干瓶中于-80。C低温冰箱中冷冻24小时。步骤(3)中-80。C冷冻后的II型胶原海绵在冷冻干燥机中于-30-4(TC下进行冷冻干燥25小时。步骤(4)中所述交联剂为碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，溶解在95%乙醇里，配制成的碳化二亚胺浓度为33mmol/L、N-羟基琥珀酰亚胺浓度为8mmol/L的交联剂。所述II型胶原海绵在交联剂中交联的时间为24小时。进一步地，步骤(4)制备出来的II型胶原海绵支架，用0)6()进行消毒后备用。本发明中用到的高纯度II型胶原溶液的提取，可以采用现有的提取方法，详细可参照李斯明、叶春婷等在《生物医学工程学杂志》(2001,18(4)592-594)上的"高纯度猪软骨II型胶原的制备与检测"中公开的制备方法。该制备方法是以猪透明软骨为原料，采用盐酸胍抽提蛋白多糖，酸性条件下酶解，中间过程经多步纯化去除杂质、降解及变性产物，盐析纯化制备出产品，经SDS-PAGE电泳、氨基酸成份分析和紫外最大吸收光谱的结果表明，所提取的II型胶原为高纯度II型胶原，该提取方法采用猪作原料，来源丰富，成本低，是一种较理想的提取方法。本发明的II型胶原海绵支架制备过程中，采用聚乙二醇对提取后的II型胶原溶液进行浓缩，可以控制冻干后胶原海绵的孔径大小，未经过浓缩的n型胶原溶液的浓度为2.9mg/ml3.1mg/ml,其冻干后的海绵孔径为130mm左右，孔径偏大，经过本发明的提供的方法把II型胶原溶液可浓缩为4.1mg/ml，其冻干后制得的胶原海绵的孔径为92mm左右，孔径适中，更适合软骨细胞或骨髓间充质细胞的生长。II型胶原海绵制备之后还进行交联，用碳化二亚胺(EDC)和N-雍基琥珀酰亚胺(NHS)双重交联，提高了II型胶原海绵材料的力学强度，增加了孔径结构的三维稳定性，交联后的海绵支架在弹性模量及极限拉应力方面均有很大程度的提高。交联后的n型胶原海绵支架适合在水溶性培养基中作为支架材料与种子细胞长期共培养，而未交联的海绵材料易溶于水，难以进行三维细胞培养。本发明的n型胶原海绵支架可作为组织工程植入物，用于修复关节软骨缺损；从动物实验结果中显示本发明的n型胶原海绵支架在体内降解时间约为23个月，原缺损处由大片新生骨和软骨组织替代，有良好的修复效果。本发明的n型胶原海绵支架可作为组织工程植入物，细胞培养支架材料或药物控释等应用于软骨损伤修复的防治。图l为本发明的II型胶原海绵支架材料外观图2a为未浓缩的II型胶原海绵激光共聚焦显微镜扫描图(x200);图2b为浓缩的II型胶原海绵激光共聚焦显微镜扫描图(x200);图3为本发明的II型胶原海绵支架材料的电子显微镜扫描图4为荧光显微镜下(xl00)，转染GFP基因的3T3细胞在本发明的II型胶原海绵支架材料中增殖情况图5为激光共聚焦显微镜下(x400)转染GFP基因的软骨细胞在本发明的II型胶原海绵支架材料中立体培养，成团生长情况图，其中箭头所示为GFP转染软骨细胞集落；图6为本发明的II型胶原海绵支架材料移植动物实验术后2周显微镜下观察图，可见仍有大量支架材料存在于缺损区中，并有大量的纤维母细^^和类软骨细胞爬行进入材料中生长；图7为本发明的II型胶原海绵支架材料移植动物实验术后2周显微镜下观察图，II型胶原材料免疫组化染色显示移植材料呈现阳性，表明植入物为本发明的II型胶原海绵支架材料；图8为本发明的n型胶原海绵支架材料移植动物实验术后6周的显樣吏镜下观察图，可见大部分材料已经被降解和吸收，原缺损处由大片新生骨和软骨组织填充，仅余少量支架材料残留(方框内所示)。具体实施方式实施例一、1、高纯度n型胶原的制备参照李斯明、叶春婷等，高纯度猪软骨II型胶原的制备与检测，生物医学工程学杂志，2001,18(4)592-594材料新鲜猪关节软骨取材于屠场新鲜屠宰的猪的四肢关节软骨盐酸胍Farco500g/弁瓦胃蛋白酶Sigma100g/瓶其余均为国产分析纯试剂。方法从新鲜屠宰的猪四肢关节中切取透明软骨，切成薄片，脱脂、捣碎、制匀浆，然后用10倍体积的4M(pH7.5)盐酸胍搅拌24小时，离心分离；沉淀径充分洗涤，称取沉淀湿重约为260g软骨颗粒，用质量比l/50的胃蛋白酶在酸性条件下酶解24~48h,离心，上清液经EDTA终止酶解后用10%NaCl盐析，沉淀用2000ml的0.5MHAc使其充分溶解，对水透析脱盐和脱酸，得到"交原溶液原液(浓度为2.9mg/ml左右，以下实验都以此浓度的胶原溶液为基础进行检测及实验)。上述制备方法制备的II型胶原溶液，纯度较高，若需要进一步得到更高纯度的II型胶原溶液，可将上述制备方法制备出的II型胶原溶液进一步上SepharoseH.P.阴离子柱,再进行层析纯化。2、II型胶原溶液的纯度检测根据李斯明、叶春婷等在《生物医学工程学杂志》2001，18(4)592-594上的"高纯度猪软骨II型胶原的制备与检测，，中公开的检测方法对II型胶原溶液进行纯度检测，此处不再赘述。3、II型胶原溶液的浓缩，将上述得到的初始浓度为2.9mg/ml的II型胶原溶液注入长约15cm直径约为5cm的透析袋中，密封后置于500ml的烧杯中，再加入足量的聚乙二醇粉剂(分子量6000D)包埋透析袋，然后置于干燥皿中在4'C下浓缩1.5小时，收集备用。4、冷冻干燥，上述得到的浓缩后的II型胶原溶液注入冻干瓶中，于-80。C低温水箱中冷冻24小时，然后置于真空冷冻干燥机中在-30。C-4(TC下冷冻干燥25小时取出，即得均匀连通孔径的II型胶原海绵。5、交联，将碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在95%的乙醇溶液中，配制成EDC浓度为33mmol/L,NHS浓度为8mmol/L的交联剂，将上述得到的均匀连通孔径的II型胶原海绵浸泡在上述交联剂中，室温下交联24小时，交联后的II型胶原海绵用蒸馏水清洗干净，再进行上述的冷冻干燥步骤，即得n型胶原海绵支架材料。把n型胶原海绵支架用co6Q消毒备用。图1所示为本发明的II型胶原海绵支架外观结构图。实验例一、II型胶原海绵支架材料的孔径检测按上述方法制得n型胶原海绵材料，分为原液无交联组、原液交联组、浓缩无交联:组、浓缩交联:组。采用激光共聚焦显微镜对各种孔径的胶原海绵进行胶原自发荧光分层扫描，激发波长为488nm,发射波长为520nm，以自发焚光信号强度为限进行测量，测定海绵材料的孔径大小；使用CLSM图像分析系统进行操作和分析，然后以SPSS13.O软件包对数据处进行统计。如图2所示，激光共聚焦显微镜结果显示各组的胶原海绵均具有明显的自发荧光，表明制备的材料具有胶原特有的生物学特性，经聚乙二醇浓缩后，本发明的II型月交原海绵孔径明显缩小。激光共聚焦显微镜结果显示经聚乙二醇浓缩后胶原海绵的孔径明显缩小，92.17±29.55^m的孔径符合软骨细胞的生长要求。交联前后材料孔径变化不大，结果如表1所示。由表中看出，本发明的胶原海绵支架(浓缩交联组)具有适宜的软骨细胞生长的孔径。而未经浓缩的原液组海绵孔径偏大。表in型胶原海绵孔径分析结果比较(<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注原液组与交联组比较代0.01,各组交联前后比较》0.05实验例二n型胶原支架材料的溶解度检测按上述方法制得II型胶原海绵材料，分为交联组和未交联组。将II型胶原海绵材料剪裁成1xlcm2大小，放入6孔培养板中，加入DMEM培养基3ml，37°C条件下观察海绵状况。结果显示未交联的II型胶原海绵材料加入培养液后即出现膨胀现象，部分溶解，材料变软，呈半透明状态；7日后材料完全溶解。经过交联后的海绵材料加入培养液后外观保持不变，种入细胞后至50天时仍能保持完整状态。实验例三扫描电镜观察II型胶原支架材料表面结构将实施例一制得的冻干的海绵支架材料制备成直径4腿,厚2腿的圓柱形，密封备用。取备用的支架材料行离子溅射仪真空镀金，扫描电镜观察II型胶原海绵材料的表面结构。结果如图3所示，电镜下扫描本发明的n型胶原海绵支架材料有均匀的连通孔径。实验例四n型胶原支架材料的生物力学分析按上述方法制得n型胶原海绵材料，分为交联组和未交联组；将n型胶原海绵材料剪裁成O.5xl.5cm2大小，备用。用卡尺精确量度材料的宽度和厚度，换算出横截面积。以拉力测试机对II型胶原海绵材料以1GOmm/min的速度进行单轴拉伸力学测试，材料断裂时终止力学测试，使用拉力测试机自带软件测定材料的极限抗张强度、最大应变、拉伸率、最大负荷、弹性模量等指标，并分析其力学性能。以SPSS13.0软件包对数据结果进行单因素方差分析，如表2所示，结果显示交联后II型胶原海绵支架材料的极限抗张强度较未交联组明显升高；弹性模量明显增大，表明交联后的海绵支架材料韧性增强。综合分析交联后的海绵材料学性能有明显改善。表2II型胶原海绵力学性能分析比较(；±^胶原浓度4.lmg/ml)极限抗张强度(N)弹性模量(MP/m"已交联II型胶原海绵(n==10)1.47±0.110.098±0.0017未交联n型胶原海绵(n-=10)4.27±1.542.18±0.47注两组比较代O.01实验例五n型胶原海绵支架材料的细船目容性观察接种3T3细胞于25cm2培养瓶中，接种密度为1x106个细胞/瓶。加入DMEM完全培养基(含有血清和抗生素)，37°C,5%0)2条件下孵育过夜。加入携带绿色荧光蛋白(GFP)的病毒上清液感染细胞，用DMEM培养基，37。C,5%C02条件下培养过夜，在荧光显微镜下观察GFP的绿色荧光表达。将转染了GFP基因的3T3细胞接种于本发明的II型胶原海绵支架材料中在DMEM完全培养基(含有血清和抗生素)进行立体培养，隔天换液，长期培养观察细胞在材料中的生长情况；一周内每天观察，一周后每三天观察一次。在激光共聚焦显微镜下三维立体观察GFP的绿色荧光表达，可见大量的细胞成团生长，在支架材料中(本发明的II型胶原海绵支架材料)附着良好，并随着时间的延长，如图4所示，细胞集落逐渐增多，细胞与材料之间呈现着良好的相容性。实验例六(GFP)转染软骨细胞构建组织工程软骨移植材料原代分离兔软骨细胞，将第三代软骨细胞接种于25cn^培养瓶中，接种密度为7.5x105个细胞/瓶。加入DMEM完全培养基(含有血清和抗生素)，37。C,5%(:02条件下孵育过夜。加入携带绿色荧光蛋白(GFP)的病毒上清液感染软骨细胞，用而EM-F12培养基，37°C,5%C02条件下培养过夜，在荧光显微镜下观察GFP的绿色荧光表达。将转染GFP基因的软骨细胞接种于本发明的II型胶原海绵支架材料中，在DMEM-F12完全培养基(含有血清和抗生素)进行立体培养，隔天换液，长期培养观察细胞在材料中的生长情况；一周内每天观察，一周后每三天观察一次，观察时间最长为60天。在激光共聚焦显微镜下三维立体观察GFP的绿色荧光表达，如图5所示，可见大量的细胞成团生长，在支架材料(本发明的II型胶原海绵支架材料)中附着良好，并随着时间的延长，细胞集落逐渐增多，细胞与材料之间呈现着良好的相容性。实验例七n型胶原海绵支架材料的降解性II型胶原海绵支架材料的制备方法如前所述。动物实验在体重质量为3.0~3.5kg的成年新西兰雄兔股骨髁负重面正中钻直径5mm、深3mm的小孔造成软骨缺损，深达软骨下骨，然后植入本发明的II型胶原海绵支架材料，术后分别于2、6、12周取材，大体观察并作组织学检查。从HE染色结果来看，术后2周仍有大量支架材料存在于缺损区中，并有大量的纤维母细胞和类软骨细胞爬行进入支架材料中生长；术后6周可见大部分胶原海绵支架材料已被降解和吸收，原缺损处由大片新生骨和软骨组织填充，仅仅余少量材料残留；术后12周，本发明的II型胶原海绵材料已被完全吸收，原缺损处大片新生骨和软骨与周边组织整合良好。结果如图6、7、8所示，图6为本发明的II型胶原海绵支架材料移植动物实验术后2周，仍有大量支架材料存在于缺损区中(图中箭头所示)，并有大量的纤维母细胞和类软骨细胞爬行进入支架材料中生长；图7为本发明的II型胶原海绵支架材料移植动物实验术后2周，II型胶原免疫组织化学染色显示移植材料呈现阳性，表明植入物为本发明的II型胶原海绵支架材料；图8所示为本发明的II型胶原海绵支架材料移植动物实验术后6周，可见大部分材料已经被降解和吸收，原缺损处由大片新生骨和软骨组织填充，仅余少量支架材料残留(方框内所示)。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。权利要求1、一种II型胶原海绵支架，其特征在于，是通过如下方法制备的(1)II型胶原溶液的制备，提供高纯度II型胶原溶液；(2)II型胶原溶液的浓缩，将步骤(1)得到的II型胶原溶液注入透析袋中，用足量的聚乙二醇粉剂包埋透析袋，然后置于低温下浓缩，收集备用；(3)冷冻干燥，将步骤(2)得到的浓缩II型胶原溶液注入冻干瓶中，于-80℃低温冰箱中冷冻，然后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即得均匀连通孔径的II型胶原海绵；(4)交联，配置碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液作交联剂，将步骤(3)得到的II型胶原海绵浸泡在上述交联剂中进行交联，交联后的II型胶原海绵用蒸馏水清洗干净，再进行步骤(3)的冷冻干燥步骤，即得II型胶原海绵支架。2、如权利要求1所述的II型胶原海绵支架，其特征在于，步骤(2)中用聚乙二醇粉剂包埋透析袋后，置于4。C下浓缩。3、如权利要求2所述的II型胶原海绵支架，其特征在于，步骤(2)中用聚乙二醇粉剂包埋透析袋后，置于4。C下浓缩1.5小时。4、如权利要求1所述的II型胶原海绵支架，其特征在于，步骤(3)中浓缩II型胶原溶液在冻干瓶中于-8(TC低温水箱中冷冻24小时。5、如权利要求4所述的II型胶原海绵支架，其特征在于，步骤(3)中-8(TC冷冻后的II型胶原海绵在冷冻干燥机中于-30—4(TC下进行冷冻干燥。6、如权利要求5所述的II型胶原海绵支架，其特征在于，步骤(3)中II型胶原海绵在冷冻干燥机中于-30-40。C下进行冷冻干燥25小时。7、如权利要求1所述的II型胶原海绵支架，其特征在于，步骤(4)中所述交联剂为碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在95%乙醇里，配制成的碳化二亚胺浓度为33mmol/L、N-羟基琥珀酰亚胺浓度为8mmol/L的交联剂。8、如权利要求1所述的II型胶原海绵支架，其特征在于，步骤(4)中II型胶原海绵在交联剂中交联的时间为24小时。9、如权利要求1所述的II型胶原海绵支架，其特征在于，步骤(4)制备出来的II型胶原海绵支架，用Co^进行消毒后备用。10、如权利要求1所述的II型胶原海绵支架，在软骨修复中的应用。全文摘要本发明属于生物医学领域，涉及一种组织工程中软骨修复用的Ⅱ型胶原海绵支架。本发明的Ⅱ型胶原海绵支架是在提取出的高纯度Ⅱ型胶原溶液后，用聚乙二醇浓缩法，对Ⅱ型胶原溶液进行浓缩，然后用EDC和NHS双重交联剂对浓缩后的Ⅱ型胶原进行交联制备得到的。本发明的Ⅱ型胶原海绵支架具有适合细胞生长的均匀连通孔径，还具有较好的力学强度和孔径结构的三维稳定性，能够在水溶性培养基中作为支架材料与种子细胞长期共培养。本发明的Ⅱ型胶原海绵支架可作为组织工程植入物，细胞培养支架材料或药物控释等应用于软骨损伤修复的防治。文档编号A61L27/56GK101549171SQ20091003966公开日2009年10月7日申请日期2009年5月21日优先权日2009年5月21日发明者杨小红,秦胜男,陈鸿辉申请人:广州市创伤外科研究所