专利名称：用于治疗鼻咽癌的Bc1－2基因的反义核苷酸制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种Bcl-2基因的反义核苷酸制剂，具体地说涉及用于治疗鼻咽癌的Bcl-2基因的反义核苷酸制剂。
本发明还涉及Bcl-2基因的反义核苷酸制剂在治疗鼻咽癌中的应用。
Bcl-2基因被发现是广泛存在于恶性肿瘤细胞中的一种癌基因，其表达与恶性肿瘤的发生、发展具有密切的联系。在NPC组织中，Bcl-2基因和Bcl-2表达的蛋白质的两个断点已经通过在杂交和免疫化学技术分析清楚。大多数NPC病例表达Bcl-2蛋白质，阳性率接近83％。Bcl-2基因蛋白质的表达在鼻咽的上皮进行，并产生致癌作用，诱导鼻咽癌的发生。
反义核苷酸技术是近年来得到迅速发展的能有效抑制肿瘤细胞基因表达的分子生物学技术，它是根据碱基互补原理，用人工合成或生物合成的的针对目的基因的特定互补的DNA或RNA序列，导入靶细胞，形成mRNA-DNA或mRNA-RNA杂交双链，从而抑制或封闭目的基因的表达，使其丧失活性，达到基因控制和治疗的目的。反义核苷酸的安全性高，不存在外源性DNA整合到靶细胞DNA的问题，而且设计方便，序列短、易于合成，反义核苷酸还具有剂量调节效应。经过多年的基础研究，伴随着先进的基因克隆和基因测序技术的出现，以及DNA合成技术的迅速发展，针对癌基因、生长因子及其受体、信号传导通路等设计的反义核苷酸药物可调控基因表达或抑制一些有害基因或失控基因的过度表达，有希望成为分子水平治疗各种疾病如爱滋病、癌症、病毒感染、高血压、慢性感染疾病和遗传病等的新的突破口，正日益受到世界范围内的广泛重视。
目前，现有技术中尚没有治疗鼻咽癌的反义核苷酸酸制剂。
根据本发明的一方面，提供一种具有SEQ ID NO.1的反义核苷酸序列，它可以与Bcl-2基因开放阅读框(open reading frame)mRNA的前6个密码子形成DNA/RNA双链体，而抑制Bcl-2 mRNA的表达，Bcl-2 mRNA随后被水解。
根据本发明的另一方面，提供一种治疗鼻咽癌的反义核苷酸制剂，其含有SEQ ID NO.1的核苷酸，并且添加药学上可接受的载体或赋形剂或可选的其它成分，而制成反义核苷酸制剂。
根据本发明的又一方面，本发明的反义核苷酸制剂的剂量形式可以包括适于静脉注射或皮下注射的针剂以及适于局部给药的乳剂、悬浮剂、溶液以及其他适当的制剂形式。
根据本发明的再一方面，提供Bcl-2基因的反义核苷酸制剂在治疗人鼻咽癌中的应用。通过静脉、皮下或局部给予鼻咽癌患者以治疗有效量的本发明Bcl-2反义核苷酸制剂而有效地治疗鼻咽癌。本发明的反义核苷酸制剂通常可以与放疗或化疗联合应用来治疗鼻咽癌。
本发明的Bcl-2基因的反义核苷酸可以与鼻咽癌细胞中的Bcl-2基因的mRNA杂交形成mRNA-DNA，抑制Bcl-2基因在NPC细胞中的表达，在临床治疗中，结合辐射和化疗来诱导NPC细胞凋亡，并经过放大而有效地治疗鼻咽癌。应用本发明的Bcl-2基因的反义核苷酸来治疗鼻咽癌最终将增加辐射治疗的功效，减少毒副影响。
发明的
具体实施例方式
针对Bcl-2基因的核苷酸序列设计了SEQ ID NO.1的反义核苷酸序列，该反义序列是由18个核苷酸所构成的短链寡聚脱氧核糖核酸。该18-mer全磷酸反义寡核苷酸与Bcl-2基因开放阅读框mRNA的前6个密码子形成一个DNA/RNA双链体，使Bcl-2mRNA不能表达，mRNA随后被酶水解。
实施例1 Bcl-2基因反义核苷酸G51的人工合成寡聚核苷酸G51是用标准DNA合成仪合成，合成的寡核苷酸在氨水60℃保存4小时。将产物重新溶于水，用HPLC强离子交换树脂和盐析进行纯化，经分光光度计检查和聚丙烯酰胺凝胶电泳，测得其纯度为99％。
实施例2G51注射溶液的制备对于静脉注射和皮下注射的G51注射溶液可以用PBS溶液来制备。通过测定合成的反义核苷酸在260nm的光密度值而定量G51寡聚核苷酸的浓度，将需要浓度的G51与PBS在37℃保温4小时，即制得G51注射溶液。
实施例3G51反义核苷酸用于临床治疗鼻咽癌Bcl-2基因用于治疗鼻咽癌，我们得出的5年存活率局部控制为86.4％，疾病消除存活为84.7％，保险存活为88.5％，完全存活为84.2％。其次，对于低于40岁和那些接受了颈部电子束照射的病人有更好的疾病控制。多因素分析显示，一旦治疗组进入模型，年龄的预测功能将更加重要。在局部复发消除存活、疾病消除存活和保险存活方面，女性似乎有更好的5年存活率。
以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的范围。
SEQUENCE LISTING<110>深圳市生尔易实业发展有限公司<120>用于治疗鼻咽癌的bcl-2基因的反义核苷酸制剂及其应用<130>PI01925<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>反义核苷酸<222>(1)..(18)<223><400>1tctcccagcg tgcgccat 18
权利要求
1.一种治疗鼻咽癌的反义核苷酸制剂，其特征在于它含有SEQ IDNO.1序列的反义核苷酸。
2.根据权利要求1所述的反义核苷酸制剂，其特征在于它进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或可选的其它成分。
3.根据权利要求2所述的反义核苷酸制剂，其特征在于将人工合成的所述具有SEQ ID NO.1序列的反义核苷酸溶于PBS溶液制得注射剂。
4.一种含有Bcl-2基因反义核苷酸的反义核苷酸制剂在治疗鼻咽癌中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中所述反义核苷酸制剂与放射治疗联合应用治疗鼻咽癌。
6.根据权利要求4所述的应用，其中所述反义核苷酸制剂与化学治疗联合应用治疗鼻咽癌。
7.根据权利要求4所述的应用，其中所述反义核苷酸制剂通过静脉或皮下给药治疗鼻咽癌。
8.根据权利要求4所述的应用，其中所述反义核苷酸制剂通过局部给药治疗鼻咽癌。
全文摘要
本发明提供一种具有SEQ ID NO.1序列的反义核苷酸制剂，它针对Bcl－2基因设计，采用人工合成，添加药学上可接受的载体、赋形剂或可选的其它成分，可有效地抑制鼻咽癌细胞中Bcl－2基因的表达。本发明的反义核苷酸制剂可单独或与放、化疗联合应用治疗鼻咽癌。
文档编号A61P35/00GK1418639SQ01134680
公开日2003年5月21日 申请日期2001年11月12日 优先权日2001年11月12日
发明者杨大俊, 周向阳, 周国庆 申请人:深圳市生尔易实业发展有限责任公司