专利名称：：含16型hpv反义e7基因的重组腺相关病毒的构建方案及用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种人类5型腺相关病毒(Humanadeno-associatedvimstype5，AAV5)重组体的构建方案，其技术特征在于Notl酶切位点中反向插入315bp的外源性16型HPVE7基因工程cDNA片段，该片段相当于16型HPVE7mRNA的858-544nt，从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺相关病毒构建体rA4K-//i>P76￡Z4S。本
发明内容属于医学基因工程
技术领域：
。二
背景技术：
：在导致女性死亡的恶性肿瘤中，宫颈癌居于第二位。由于缺乏合适的筛查方法，在发展中国家宫颈癌发病率位于第一位。流行病学调查资料显示我国是宫颈癌的高发国家之一，每年发病率为14.6/10万，新增病例约15万；全世界每年有50万新发病例，中国就超过了1/4。宫颈癌发病率呈上升趋势，且年轻妇女宫颈癌的发病率明显上升。女性是社会经济建设的重要部分，妇女的健康和生活质量的高低直接影响到家庭生活的完美，是关系到社会稳定的大事，与我国经济的可持续发展和建设和谐社会的发展大计息息相关。然而目前常规的肿瘤治疗手段无法从根本上清除恶性肿瘤，多数常见肿瘤治疗的现状仍面临着严峻的挑战，肿瘤的彻底根治需要治疗方法的革新。这种革新在宫颈癌的传统治疗中尤其明显，早期宫颈癌的治疗主要为根治性全子宫切除，晚期宫颈癌则主要为放射治疗，这两种方法都不可避免地部分或完全破坏了女性生殖道，无法生育、性生活丧失或不满意成为不可忽视的后遗症，宫颈癌发病年轻化的特点使得这种矛盾在近年显得尤为突出。对新型治疗手段的需求迫使人们不得不从分子水平寻找靶点。宫颈癌病因学研究表明95%宫颈癌的原发因素是人乳头瘤病毒(HPV)，HPV感染是多数宫颈癌变的第一步。HPV属于乳头多瘤空泡病毒科乳头瘤病毒属，是由DNA核心和蛋白衣壳组成的无包膜DNA病毒，衣壳由主要(Ll)和次要(L2)衣壳蛋白组成，HPV具有明显的种属特异性，它们不能在动物体内感染，也不能作体外细胞培养。不同型别的HPV基因结构基本相似，是双股环状DNA，由三个基因区组成，按其功能可分为早期区(E区)、晚期区(L区)和上游调节区(URR)。早期区含有6个开放阅读框(ORF)，其中E6、E7基因主要与病毒细胞转化功能及致癌性有关。E6不仅通过结合并降解p53从而导致细胞周期细胞永生化，E7则通过与控制细胞周期有关的肿瘤抑制蛋白Rb的相互作用，使细胞周期失控而发生永生化，两种癌蛋白的表达是维持肿瘤细胞处于转化状态所必须的。16型是最常见的高危型别，其E6、E7基因的表达产物是上皮细胞的恶性转变必不可少的条件，与宫颈癌的发生及发展有极密切联系，我国的流行病学表明宫颈癌患者中HPV16型阳性率达到50%-87%。在HPV16阳性宫颈癌细胞中，HPVDNA以整合的形式存在于宿主细胞基因组中，E7基因均是持续表达.Howley等证实了病毒E6、E7基因的持续表达可能是肿瘤恶性表型得以维持的必要因素，其中E7癌蛋白是HPV的主要转化蛋白。因此，将癌蛋白E7视为肿瘤特异性抗原，是研究开发新型治疗方法的主要着眼点之一。如何通过抑制E7基因的复制、转录和翻译来达到逆转宫颈癌细胞恶性表型，已成为研究的热点。在肿瘤发病内在分子机制逐渐明了的新的历史条件下，肿瘤分子医学理论和方法学的突破引发了一系列发展新型肿瘤治疗模式的尝试，大量分子靶点特异性抗癌化合物进入临床试用，标志着肿瘤治疗的突破到了一个关键的转折点,并已获得阶段性成果,初步凸显出未来肿瘤问题解决的基本轮廓，其最为核心的解决方法之一就是要从肿瘤繁复的基因调控网络中分解出最为关键的分子靶标，实施分子靶向治疗。截止至2001年底，获美国FDA批准进入临床实验阶段的分子治疗品种已超过三千种，包括细胞传导阻断剂、血管生成抑制剂、肿瘤疫苗和单克隆抗体，为肿瘤问题的最终解决带来了新的希望，可以说，未来人类肿瘤的有效控制在根本上依赖分子治疗的发展完善。分子治疗的主要手段主要分为三类单克隆抗体、小分子化合物和基因治疗，其中，基因治疗作为近年医学领域发展中最具有生命活力的部分之一，已广泛应用于多种肿瘤的临床试验性治疗，显示出良好的应用前景。截至目前，在全世界260多家以基因治疗为核心业务的公司中，有128家在进行肿瘤的基因治疗研究和开发，全世界已经批准的基因治疗临床试验方案共有1145个，其中肿瘤基因治疗方案有762个，占66.6%。我国近年来也逐渐加大对这方面的研究和开发力度，我国自行研制生产了世界上第一个上市销售的肿瘤基因治疗药物-重组人p53腺病毒注射液。在巨大的医疗需求的推动下，基因治疗制剂将有可能成为肿瘤现有治疗体系中不可或缺的组成部分。反义基因技术是基因治疗的重要手段之一，为保证反义技术的特异性，我们选择了针对包括E7基因阅读框在内的全长片段，片段经测序为100%吻合。而腺相关病毒是目前发现的唯一无病原性的人DNA病毒，也是已知的唯一能与人基因组特异染色体(19q13.3—19qter)定点整合的真核细胞缺陷病毒。因此，基于以上特点而开发的腺相关病毒载体是继腺病毒和4逆转录病毒载体后出现的新型基因治疗工具，具有低免疫原性、低毒性、可长期稳定表达携带的外源基因以及可感染分裂期和非分裂期的宿主细胞等特点，同时在理论上，能够减少由于转基因的随机整合而导致的插入突变机率，为分子治疗手段的开发提供了一种可能的理想载体。
发明内容基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明将公开一种含16型HPV反义E7基因的重组人类5型腺相关病毒(AAV5)重组体的构建方案，通过该方案获得的构建体具有明显的治疗和预防作用，可以解决目前肿瘤治疗的困难与不足。HPV16是感染宫颈的最常见高危型别，与各级上皮瘤及侵袭性鳞状细胞癌均有关。研究表明HPVE7基因在大多数宫颈癌及癌前期病变中均持续表达,而在正常组织中不表达。大多数肿瘤特异性抗原起源于正常或突变的蛋白，E7完全是外来的病毒蛋白，并因此可能包含比细胞蛋白更多的抗原性表位。另外E6和E7对诱导和维持癌细胞的恶性表型是必需的，因此癌细胞在抗原丢失中不太可能逃过免疫反应。在E6和E7基因中，E7基因表达量更多且具有更好的免疫学特征，而且序列比E6基因更保守，因而得到更多研究者的关注。动物实验结果已经证明，以乳头瘤病毒的早期蛋白为靶抗原的疫苗即能产生预防作用；与己上市的HPV疫苗相比，以E7蛋白为靶点的宫颈癌抗原特异性免疫治疗或疫苗因兼具治疗作用和预防作用将成为更有前景的基因治疗方向。重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长以及可感染分裂期和非分裂期的宿主细胞等特点，被视为继腺病毒、逆^t录病毒之后最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。据不完全统计，已经有27项AAV载体基因治疗方案进入临床试验。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性已被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面巳经积累了许多资料。在医学研究中，i:AAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型，制备基因敲除鼠等方面。为此，本发明以AVV5重组腺相关病毒为载体，在NotI酶切位点中反向插入315bp的外源性16型HPVE7基因工程cDNA片段，该片段相当于16型HPVE7mRNA的858-544nt，从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺相关病毒构建体rA47-/^F76￡Z4S。本发明达到了以下效果1、肿瘤细胞系体外实验结果表明，该重组腺相关病毒构建体可特异性灭活HPV16型E7基因的表达，达到抑制HPV16型阳性的肿瘤细胞的增殖和生长，诱导其凋亡，阻遏肿瘤细胞的成瘤、侵袭能力，而且可以使己形成的肿瘤縮小，以及预防肿瘤的形成。2、对肿瘤动物模型的体内研究证实,通过肿瘤局部注射的给药途径,该重组腺相关病毒构建体对受试的肿瘤动物模型有显著的治疗和预防作用，且对动物无明显治疗相关毒性。四附图l:pUFl-HPV16E7AS测序报告。附图2:重组腺相关病毒制备及滴度检测图。附图3:重组腺相关病毒抑制CaSki细胞生长率。附图4:重组腺相关病毒促进CaSki细胞凋亡率。附图5:重组腺相关病毒阻碍细胞侵袭的体外验证及抑制CaSki细胞HPV16E7的表达。附图6:重组腺相关病毒抑制CaSki细胞成瘤力。附图7:重组腺相关病毒治疗和预防CaSki细胞成瘤。五具体实施例方式除特别注明外，在下面的实施例中，技术流程所用的酶和PCR引物均购自美国Gibco公司。例l、含目的基因骨架质粒pUFl-HPV16E7AS的构建与鉴定在两个NotI位点之间区域反向插入315bp的外源性HPV16E7cDNA片段，该片段相当于HPV16E7mRNA的858-544nt。—'—〈1〉RT-PCR法扩增目的基因(DTRIZOLTM试剂一步法提取SiHa细胞总RNA;将25cm2培养瓶中培养基弃尽，用无RNase的PBS洗涤一遍，吸尽PBS;加入TRIZOLTM试剂1ml，使之均匀覆盖瓶底，室温放置5~15min，将瓶内液体转入EP管内；加入氯仿0.2ml，剧烈振匀15秒，室温放置10~15min;4'C，12000rpmxl5min离心；将上层水相转移至另一EP管内，加入0.5ml冰异丙醇，混匀，室温放置10min;4°C，12000rpmxl5min离心；去掉异丙醇，加入75%乙醇重悬RNA;4°C，7500rpmxl5min离心；用真空泵抽吸上清，使沉淀干燥，加入适量DEPC水溶解沉淀，取部分样品测纯度及浓度。②RNA的逆转录；A反应体系RNA2jig01igo(dT)15(0.5一1)1piRNasin(40u/|il)1(al70°C加热5min，冰浴5min;B依次加入5xbuffer5juldNTP5|alMMLV逆转录酶1|nlDEPC水补至25piC混匀，短暂离心，42°C水浴60min;D95°C水浴5min灭活逆转录酶终止反应，4°C冰浴5min冷却反应液，一20°C保存备用。③PCR扩增；反应体系10xBuffer5^1MgCl2(25mM)3(ildNTP(10mM)Primer1(10pmol/|al)0.5Primer2(1Opmol/ul)0.5piCDNA5~10piTaq酶1^去离子水补至50[il扩增程序为94°C5min，94°C30sec，54°C30sec，72°C45sec，35个循环，最后72°C10min。目的扩增片段大小为315bp，GAPDH扩增片段大小为230bp。HPV16型E7基因引物上游引物5，-GCGGCCGCAGAAACCCAGCTGTAATCAT-3'下游引物5，-GCGGCCGCTTATCCTTTCTGAGAACAGA3'GAPDH引物上游引物5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3,下游引物5，-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3'④回收目的片段；取10plPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，切取目的片段的凝胶，放入EP管中，加入3倍体积的碘化钠，避光55"C水浴10min，加入玻璃奶5^1/0.3ml，充分摇匀，室温静置5min，室温离心12000rpmx5sec，弃上清并加入0.5ml欲冷的washbuffer重悬沉淀，室温离心12000rpmx5sec，弃上清并重复两次，弃上清后室温静置5~10min，取适量去离子水重悬沉淀，再次离心取上清备用。〈2〉将目的基因装入pGEM-Teasy载体系统并测序己纯化的PCR产物l3|al2xBuffer5T4连接酶1|al去离子水补至10pi反应条件室温反应至少lh。将反应产物转化入新鲜制备的DH5cx感受态细胞，常规LB琼脂平板蓝白斑筛选法，挑取白色菌落，常规扩增后质粒快速小量提取，酶切鉴定。选取克隆送测序，保存结果正确的菌种(图l)。〈3〉质粒的基因重组及酶切鉴定A将pGEM-Teasy-E7和pUFl质粒分别酶切线性化；pGEM-Teasy-E7,'pUF11010xBuffer2jalNotI1pi去离子水补至20^反应条件37°C水浴过夜。B回收所需片段回收所需片段A:-NotI-pUFl-NotI-和B:-NotI-E7-NotI-，具体方法同上。C将两片段进行连接反应反应前取线性化片段A进行去磷酸化，反应条件如下:A10^10xBufferCIAP去离子水补至5^11pi50(il去磷酸化反应条件37°C水浴反应30min，加入5mmol/LEDTA(PH8.0)，65°C水浴反应lh灭活酶，酚/氯仿抽提，乙酸钠沉淀，回收去磷酸化片段A，并测定其浓度。B片段A片段5xBufferT4连接酶去离子水补至连接反应条件16°C反应20hr。D双酶切鉴定；pUFl-E7AS10xBufferAccIKpnl去离子水补至4pi1pi20|il10(il2^11pi1pi20|il反应条件37°C水浴过夜。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察结果(图2)。例2、重组腺相关病毒的包装、纯化将对数生长期的293细胞接种至75cm2的培养瓶中，近70%融合时，用磷酸钙沉淀法进行细胞转染，将pUFl陽E7AS、pXX2、pXX6或pdxll-lacZ、pXX2、pXX6按摩尔比l:1:1共转染293细胞，12h后换液，72h吸出培养基，用细胞刮匙收集细胞，两组各收集细胞60瓶，将细胞置于-80。C冰箱，反复冻融3次，12000rpm4°C离心20min，取上清备用。使用氯化铯梯度离心法纯化并浓縮病毒。例3、重组腺相关病毒滴度及活力测定〈1〉斑点杂交法测定rAAV-E7AS和rAAV-Laz病毒滴度。(D样品的稀释取含重组腺相关病毒的上清液40nl，在200^1含Dnasel和RNase及相应缓冲液的体积中37'Clh，后加入400ul含10ng/ml蛋白酶K体系，37°C2-3h等体积酚、氯仿、异成醇抽提，12000rpm4。C离心15min,取上清400^1与等体积的0.4MNaOH/10mmEDTA混合。将对照质粒pdxll-lacZ、pUF广E7AS和经上述方法处理后的rAAV-E7AS、rAAV-lacZ100。C加热5min，置冰上冷却2min，用0.4MNaOH/10mMEDTA按1011、5xl010、2.5><1010、lx1010、5xl09、2.5x109、lx109、5xl08、2.5x108、108、107、1(^个分子数/ml比例稀释。②常规装置点样，8(TC烤膜2小时，按试剂说明进行杂交。③化学发光法显色，选择适宜时间曝光洗片。实验结果见图2。〈2〉重组腺相关病毒的活力测定将处对数生长期的293细胞接种至6孔板，分两组，分别加入含rAAV-Laz/rAAV-E7AS的完全培养基，24小时后，吸干培养基，用PBS洗1次，1%戊二醛固定15min，用x-gal染色液300nl/well避光染色24h,光镜下观察30个400倍视野，以含蓝绿色颗粒细胞占细胞总数的百分比评价其转染效率。例4、重组腺相关病毒抑制细胞生长的体外验证在96孔板上接种细胞lxl(^个/L，37°C、5。/。C02培养箱中孵育过夜，加入适宜浓度的病毒转染，完全培养基和磷酸盐缓冲液分别作为空白对照和阴性对照，另设一组在转染前固定，每组设8个复孔。培养24、48、72小时后弃去培养基，10。/。TCA液4i:固定lh，倒掉固定液，去离子水洗5遍，甩干，空气干燥，每孔加入100^1SRB液，在室温放置10min,1%醋酸液洗5遍，空气干燥，1Ommol/L非缓冲Tris碱液(PH10.5)溶解，用自化分光度平板读数计在515mn波长处测定每个小孔OD值。按公式计算生长率。实验证实处理72h后肿瘤细胞生长率达到最低，以术处理组和AXV^iacZ作用组作为对照组，对照组则没有变化(图3)。例5、重组腺相关病毒促进细胞凋亡的体外验证收集细胞，用预冷的75。/。乙醇固定，PBS洗涤、离心，加入含有10吗/mlPI和0.1。/。RNaseA的PBS室温处理至少20min后，流式细胞仪检测。实验证实处理72h后肿瘤细胞凋亡率达到最高，以未处理组和AAV-lacZ作用组作为对照组，对照组则没有变化(图4)。例6、重组腺相关病毒阻碍细胞侵袭的体外验证在^m孔径的聚碳酸酯微孔滤膜(SPI公司)上均匀平铺按l:5稀释的DMEM基底膜基质胶Growthfactor-reducedMatrigel，约120吗/cm2，37°C放置3小时，后转入室温下过夜干燥。将Boyden小室按常规装置，下室各孔加入25ul含一定浓度的LGMCSF的DMEM，10上室加入3T3和CaSki细胞，细胞浓度为2x105/ml，每孔25nl，细胞数5000个/小室，每组设3个复孑L，37'C、5。/。C02培养10小时，取出膜拭去上层剩余细胞，90%甲醇室温固定45min，苏木素染色10min，流水冲洗，风干，在光学显微镜下每孔计数5个视野中的全部细胞。以不涂Matrigel的膜作为对照，瘤细胞穿过数作为100%，实验组与之比较的相对百分率表示趋化活性。实验证实处理72h后肿瘤细胞侵袭力达到最低，以未处理组和AAV-lacZ作用组作为对照组，对照组则没有变化(图5)。例7、重组腺相关病毒抑制HPV16E7表达的实验验证NorthernBlot法检测HPV16E7基因的表达水平提取细胞总RNA并测纯度及浓度，进行RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，转膜，参照试剂说明书标记探针(全长DNA探针)、杂交、增强化学发光显色系统显色、曝光，重复三次。以GAPDH作为内参照。WesternBlot法检测HPV16E7基因的表达水平三去污法提取细胞胞浆蛋白，取50吗蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，室温封闭2h后，用TBST漂洗3次，加入相应的抗HPV16E7抗体(1:500)，4°C孵育过夜；TBST漂洗3次后加入相应的碱磷酶标记的二抗(1:500)，37。C摇床孵育2h，NBT/BCIP显色系统显色,重复三次。以p-actin作为内参照。实验结果见图5。例8、重组腺相关病毒抑制肿瘤细胞成瘤能力的验证选取适宜浓度病毒转染CaSki细胞，作用72小时后收获细胞，制成细胞悬液，浓度为106个/100^1,对照组为未经转染的CaSki细胞，取低龄组裸小鼠，每组5只，于小鼠肩胛区皮下注射细胞，接种100nl/只，观察肿瘤的形成，计算成瘤率。实验证实处理72h后肿瘤细胞侵袭力达到最低，以未处理组和AAV-lacZ作用组作为对照组，对照组则没有变化(图6)。例9、重组腺相关病毒治疗和预防宫颈癌的裸鼠实验验证实验分为5组，分别为空白对照组(A组)，rAAV-lacZ治疗组(B组)，rAAV-E7AS治疗组(C组)，rAAV-lacZ预防组(D组)，rAAV-E7AS预防组(E组)。每组6只，预防组于3周时即给予相应处理因素即rAAV-lacZ、rAAV-E7AS在预接种部位肌肉注射，其他组注射生理盐水，6组裸鼠在相同条件下词养，1周后即同时皮下接种肿瘤细胞。当皮下瘤形成0.5x0.5x0.5ci^大小时，治疗组即给予相应的处理因素，预防组则注射生理盐水。评价指标含肿瘤直径、成瘤时间、生存时间。肿瘤直径以三相的平均数值为评定指标，其中含最大直径，其余两相与之成90'角度(长、宽、高)。成瘤时间为自接种日起至形成0.5x0.5x0.5cmS大小瘤体时的时间。生存时间即为自接种日起至死亡的时间。A、B、C、D四组的成瘤时间相近，差异无显著性意义(P>0.05)，仅在E组则出现成瘤时间明显后延，差异有极其显著性意义(PO.01)(图7)表lA、B、C、D四组成瘤时间、肿瘤直径、生存时间比较<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注众E组与A、B、C、D组比较PO.Ol▲C、E组与A、B、D组比较PO.OlAE组和C组比较P=0.038★C、E组与A、B、D组比较PO.OlA、B、C、D、E组肿瘤直径分别为2.23士0.21、2.29士0.14、0.92士0.10、2.28士0.12、0.66士0.33cm，C组肿瘤直径明显小于对照A、B组，E组肿瘤直径明显小于对照A、D组，PO.01;而C、E两组比较，E组小于C组，P=0.038，五组中生存时间最短96天，最长130天，A、B、D三组生存时间相近，分别为102.83±4.75、102.17±4.36、103.67±3.67，C、E两组生存时间亦相近，分别为124.00±4.20、124.67±3.50，差异均无显著性意义(P>0.05);而后两组与前三组相比，生存时间明显延长，差异有极其显著性意义(PO,Ol)，结果显示rAAV-lacZ无论是用于治疗还是预防，生存时间与空白对照组相比差异无显著性，一定程度上验证了重组腺相关病毒用于基因治疗的安全性。在rAAV-E7AS治疗组中，肿瘤生长明显受到抑制，肿瘤直径明显小于对照组，生存时间亦明显延长；在rAAV-E7AS预防组中，成瘤时间较其他组明显推后，形成的肿瘤直径明显小于对照组，亦小于rAAV-E7AS治疗组。附件DNA序列表<110>深圳市奥尼克斯基因技术有限公司<110>马丁王世宣周剑峰卢运萍邬素芳<120>含16型HPV反义E7基因的重组腺相关病毒的构建方案及用途<140〉<141><160>1<170><210>1<211><212>DNA<213>人工序列<220><223><400>HPV16全基因组序列E7开放阅读框为544bp—858bp。1ttcatgtat已aaact^gggcgt已3ccgaaatcggttgaaccgaaaccgg61ttagtat犯aagcagacattttatgcaccagcaatgtttcaggscccaca121ggagcgacccag已aagttaccacagtt已tgcac3gagctgtacatgatat181tgtgtgtactgcaagcaacagttactgcgacgtgaggtatatgactttgc241ttttcgggatt3tat3gagatggg已atccatatgctgtatgtgataaatg301tttaaagttttattctaaaattagtgagtatagacattattgttatagtttgtatggaac361aacattag已acagcaa/tac已acaaaccgttgtgtgatttgttaattaggtgtattaactg421ctgtgtcctgaagac3tctggacaaaaagcaaagattcca481ggtcggtggaccggtcgatgtatgtxttgttgcagatcatcaagaacacg541tagagaaacccagctgtastcatgcatgg已g已t3C3cctaLatatatgtta601gatttgcaacC3g￡Lga<C3￡LCtgatctctactgttatgagccagctcagag661鹏gaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggac卿gcccattacaat721attgt犯ccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtaca781gtagscattcgtactttggasgacctgttaatgggcsceLCtaggaattgtgtgccccatc841tgttctcagaaaccataatctaccatggctgatcctgcsggtacc已3tgggga卿gggt901acgggatgtaatggatggtttt已tgtagaggctgtaigtgg郷,tgct961atatcsgatgacgagascgagatacaggtgaagatttggt1021gtaaatgataaacacaggcagaaacagagacagcacatgcgttgtttact腿gcacagg鄉caaaacaacatsgagatgcagtacsggttcta3aacgaaagtatttggta1141gtccacttagtgstattagtggatgtgtagacaataatattagtcctagattaaaagcta1201tatgtatagaagagctgcaaatttgaaagcga卿cagcg1261ggtatggcaatactgasgtgga_￡L￡LCtC￡LgCagatgttacaggt卿鄉gcgccatgaga1321ctgaascaccatgt已gtcagt由gtggtgg卿tgggggtggttgcagtcagtacagta1381gtggaagtgggttagtgsaagacacactatatgccaaacaCC3CttaC犯1441atat111aaaact3gtaatgcaaaggcagcaatgttagca1501agttatacggggtgagtttttxag3attagtaagaccatt￡L￡L￡LtCa_￡LCgt1561gttgcgattggtgtattgctgcatttggacttacacccagtatagctgac3gtataaaaa1621cactattacattatatttacacattcaaagtttagcatgttcatggggaa1681tggttgtgttactattagtagtgga犯aaatagsgaaacaattgaaaaat1741tgctgtctaagtgtctccaatgtgtatgatgatagagcctccaaaattgc1801gtagt已cagc3gcagc3t"ta3犯caggtatatcaaatattsgtg鄉tgt18613tgg3gac已cgcc卿atgg3ca^ca^agttttaatgatt1921gtacatttgagggcctacgataatgacata1981gtgaaattgcatataaatatgcacaattggtagtaatgcaagtgcctttx2041ttcacaggca郷sttgtgc犯CEL3tgtgtsgacattata2101atgagtatgagtC犯tgg3taaaatatagstgtgataggg2161t卿tgatggaggtg已Uggttatgtttttaaggtatc犯ggtgt卿gt2221ttatgtcatttttaactgcattttgcaaggcatacctaaaaaa3attgca2281tggtgcagctaatcEtttatttggtatgagtttaatgaaat2341ttctgcaagggtctgtaatatgttttgtaa3ttcta已a己gccatttttggttacaaccat2401t已gcagatgcatgttagatgatgCt3C8gtgccctgttgg2461atgacaatttttggatgg犯atttagtttctatggatgtaaagcatagac142521cattggtacacctccattattaattac已tcgctggtacag2581attctaggtggccttatttacataatagattggtggtgtttacatttcctaatgagtttc2641catttgacgaaaacggaaatccagtgtatgagcttaatgataagaactggaaatcctttt2701tctcaaggacgtggtcc卿ttaagtttgcacg已ggacgaggacaaggaaaacgatggag2761actctttgcctgtgtgtxaggacaaaatac2821agtacagacct已cgtg3ccatgcgcctagaatgtgctatt2881tattacaaggccagagaaatggg3ttt犯3accaagtggtgccaacactg2941gctgtatcaaagaMaaagcattgaactgcaactaacgtt3001tataactcactga^￡L￡Lgtggaceittacaagacgttagccttgaagtgtat3061ttaactgcaccaac3gga_tgtataaaaaaacatggat已tacagtggaagtgcagtttg￡Lt3121ggagacatatgcaat已caataactggacacatatatatatttgtgaagaa3181gcatcagtaactgtggt卿gggtc犯gttgtttatattatgttCELtg犯3241ggaatacgaacatattttgtgcagtttaa^gatgatgcag3301gtatgggaagttcatgcgggtggtc郷taa^tattatgtcctacatctgtgtttagcagc3361aacgaagtatcctctcctga33tt￡Ltt￡LggcagcacttggCC犯CC3CCCcgccgcgacc3421cataccaaagccgtcgccttgggcaccg朋gaaacacagaicgactatccagcgaccaaga3481tcagagccagacaccggaaacccctgccacaccactaagttgttgcacagagactcagtg3541gacagtgctccaatcctcactgcatttaacagctcacacat已actgtaat3601agtaacactacacccatagtggtgatgctaatactttaaaatgtttaaga3661tatagatttaaaaagcattgtacattgtatactgcagtgtcgtct已catggcattggaca3721ggeicataatg犯gtgcaMtgttacacttacatatgatsgtgaatggcaa3781cgtgaccaatttttgtctcattacagtgtctactggattt3841atgtctatatgacaaatcttgatactgcatccacaacattactggcgtgctttttgctU3901gctttgtgtgcttttgtgtgtxtgcctattagLtacgtccgctgcttttgtctgtgtctac3961atacaca*tcatggtattactattgtggataacagcagcctctgcgtt"tag德gtgttttatttatttgtttatata_cc3tt8tttttaatacatscacatgc4081acgctttttagtatatgtactgtt3CElt3taattgttgta4141taccataacttactattttttcttttttataatttttttttUgtttgtt4201tgtttgttttgttattacttaacaatgcgacscaaacgttctgcaaaacg<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage17</image>7741ttggcataaggtttaaacttctaaggccaactaaatgtcaccctagttcatacatgaact7801gtgtaaaggttagtcatacattgttcatttgtaaaactgcacatgggtgtgtgcaaaccg7861attttgggttac已catttacaagcaacttatataataatactaa权利要求1、一种重组腺相关病毒构建体，该构建体命名为rAAV-HPV16E7AS，其技术特征在于在野生型AAV5NotI酶切位点中反向插入315bp的外源性16型HPVE7cDNA片段，相当于HPV16E7mRNA的858-544nt，其他基因组结构与野生型AAV5完全相同。2、制备权利要求1所述的重组腺相关病毒构建体的方法，其特征在于用PCR法扩增全长序列片段，并将获得的片段装入载体，经测序并与NCBI数据库比对证实为100%吻合，而后与腺相关病毒骨架质粒pf/FJ进行基因重组，构建成功含HPV16型反义E7基因的新载体p"^7-/ffP76￡7AS<，；^W-//PW6E7A5质粒与包装载体和；^OT(5共转染293细胞，筛选出表达反义16型HPVE7mRNA的重组腺相关病毒构建体rAAV-HPV16E7AS。3、权利要求1所述的重组腺相关病毒构建体在制备用于基因治疗载体中的用途。4、权利要求1所述的重组腺相关病毒构建体在制备用于宫颈癌及其他与HPV16型感染有关疾病预防药物中的用途。全文摘要本发明公开了一种含人乳头瘤病毒(HPV)16型反义E7基因的腺相关病毒构建方案，以及用该方案获取的一种重组腺相关病毒构建体在肿瘤治疗中的具体用途。用PCR法扩增全长、酶切、连接、同源重组、转染、腺相关病毒纯化等技术，获得一种重组腺相关病毒构建体，其技术特征在于在NotI酶切位点中反向插入全长外源性HPV16型E7基因cDNA片段。该种重组腺相关病毒构建体具有以下突出的技术优势能定点整合入染色体；插入的反向外源性基因为全长片段，特异性好；对感染16型HPV的细胞具有强效应，具备预防效能。该重组腺相关病毒构建体为肿瘤基因治疗和预防提供了一种理想的基因靶点特异性治疗和预防应用途径。文档编号A61K48/00GK101440378SQ20071018784公开日2009年5月27日申请日期2007年11月20日优先权日2007年11月20日发明者卢运萍,周剑峰,王世宣,邬素芳,丁马申请人:深圳市奥尼克斯基因技术有限公司