选择性封闭肿瘤stat3的新型溶瘤腺病毒构建体的获得及用途的制作方法

专利名称：：选择性封闭肿瘤stat3的新型溶瘤腺病毒构建体的获得及用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种人类5型腺病毒(Humanadenovirustype5，Ad5)重组体的构建方案，其技术特征在于定向缺失Ad5基因组的第920-946nt，即GATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTT，该序列编码E1A蛋白121至129位氨基酸，在此基础上，进一步缺失Ad5E3区29477-29714nt,在上述缺失区域引入一个Clal酶切位点；在Clal酶切位点中反向插入770bp的外源性STAT3cDNA片段，相当于STAT3mRNA的第960-190nt，从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺病毒构建体A/5/ziw//UD/y^ss:wn。
发明内容属于医学基因工程
技术领域：
。一、冃乐坟不恶性肿瘤正在成为危害人类健康的首要疾病。据国内最新流行病学调查资料显示我国现有癌症病人300多万人，每年死于恶性肿瘤的患者约为130万人，每年有160万到200万新发的恶性肿瘤病例，并以3%的速度递增，给我国人民的生活和健康造成巨大威胁。目前常规的肿瘤治疗手段都无法从根本上清除恶性肿瘤，多数常见肿瘤的治疗仍面临着严峻的挑战，恶性肿瘤的彻底治疗需要肿瘤治疗方法的革新。在肿瘤发病内在分子机制日益明了的新历史条件下，肿瘤分子医学理论和方法学的突破引发了一系列发展新型肿瘤治疗模式的尝试，大量分子靶点特异性抗癌化合物进入临床试用，标志着肿瘤治疗的突破到了一个关键的转折点,并己获得阶段性成果,初步凸显出未来肿瘤问题解决的基本轮廓，其最为核心的解决方法之一就是要从肿瘤繁复的基因调控网络中分解出最为关键的分子靶标，实施分子靶向治疗。截止至2001年底，获美国FDA批准进入临床实验阶段的分子治疗品种巳超过三千种，包括细胞传导阻断剂、血管生成抑制剂、肿瘤疫苗和单克隆抗体，为肿瘤问题的最终解决带来了新的希望，可以说，未来人类肿瘤的有效控制在根本上依赖分子治疗的发展和完善。分子治疗的主要手段主要分为三类单克隆抗体、小分子化合物和基因治疗，其中，基因治疗作为近年医学领域发展中最具有生命活力的部分之一，已广泛应用于多种肿瘤的临床试验性治疗，显示出良好的应用前景。从1989年至2000年底，美国生物制品评价和研究中心(CenterforBiologiesEvaluationsandResearch,CBER)批准的临床基因治疗试验项目已超过350项，其中约有70%的项目为肿瘤基因治疗，部分已经进入III期临床试验，取得较好疗效，在巨大的医疗需求的推动下，基因治疗制剂将有可能在近年内正式上市成为临床治疗药物，成为肿瘤现有治疗体系的一个不可缺少的组成部分。重组Ad5载体作为肿瘤基因治疗应用最为广泛的载体之一，其临床可行性和安全性己获公认，腺病毒基因治疗载体具有以下突出的生物学优势和临床应用优势感染谱广；不整合入宿主基因组，无致突变、致癌的危险性；临床应用安全，副作用轻微；临床应用方便；腺病毒在细胞体内持续表达时间短，尤其适合肿瘤治疗；临床级数量、质量的病毒易于生产、纯化。目前肿瘤临床试用的绝大部分载体为缺失了El及E3区的复制缺陷性腺病毒，进入肿瘤病灶后，对肿瘤的杀灭效应依赖于体外高浓度治疗病毒的输入，距离注射点较远的病灶的杀灭效应较弱。为此，近年来，出现了从复制缺陷性腺病毒载体向条件复制性腺病毒载体(conditionallyreplicativeadenovirus)转化的新的发展趋势，所谓条件性复制腺病毒载体是指载体能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖，将肿瘤细胞作为生产病毒的场所，最终达到裂解杀灭肿瘤细胞的治疗目的，肿瘤细胞裂解释放出高浓度的病毒后，可进一步感染距离注射点较远的病灶肿瘤细胞，形成新一轮的感染波，周而复始形成一种正反馈，达到最大的治疗效应。此类载体另一个非常理想的优势是它们不能在正常细胞内完成复制，因此对正常细胞无任何杀伤效应。在第21届美国肿瘤研究年会上，来自休斯顿Anderson肿瘤中心的一份研究报告表明局部注射后，复制缺陷性腺病毒在人体恶性胶质瘤病灶中的分布较局限，在一定程度上影响了疗效的发挥，与此形成鲜明的对比，—能在肿瘤细胞内特异性复制的腺病毒ONYX-015，通过在肿瘤局部的增殖，其分布遍及全瘤灶，取得显著疗效。ONYX-015是美国ONYX药物生物技术公司近年研制出的能在肿瘤细胞内选择性复制的腺病毒，其构建特点是在wt-Ad5的基因组上，部分缺失ElB55kDa的编码序列，并加入翻译终止信号，但保留19kDaElB的编码序列。作为条件复制性腺病毒载体代表产品的ONYX-015在1996年进入临床试验以来，已经取得了非常令人鼓舞的临床疗效。目前，美国辉瑞(;^m)药物公司已从ONYX生物技术公司购买使用专利，并已在多种肿瘤进行临床期试验，其中，对复发性，难治性头颈部肿瘤的治疗正进行临床m期试验，已取得非常满意的疗效，对其他肿瘤如转移性结肠癌、肺癌、胰腺癌、口腔粘膜白斑病(oralleukoplakia)和恶性胶质瘤的临床I-II期试验正在进行中。国内已有4例与ONYX-015类似原理的专利申请，其中专利申请(一种缺陷型病毒及其构建方法)99124030.8通过缺失E1B55kDa位于2809-3329bp编码序列，并在缺失部位插入终止码的方法得到ElB55kDa部分缺失的构建体。专利申请(缺失凋亡抑制基因病毒的构建及在肿瘤基因治疗中的应用)96013494.7通过部分缺失E1B55kDa编码序列，并在该缺失部位插入标志基因LacZ,得到E1B55kDa部分缺失同时携带标志基因的病毒构建体，该构建体的另一特点是有E3区的缺失。另外两项为申请人领导的研究小组提交的申请，专利号01144628.5"一种缺失E1A编码序列的重组腺病毒构建体的获得及用途"，缺失E1A382-1630nt序列，筛选出不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体，专利号01144629.3"—种联合缺失19kDa、55kDaElB编码序列重组腺病毒构建体的构建及用途"，筛选出不能表达E1B功能蛋白的重组腺病毒构建体。国内外现有的条件复制性腺病毒载体发明与第一代Ad5基因治疗载体相比，无论在治疗原理上，还是在实际治疗效果上均具有明显的改进，并取得突破性进展，被称为第二代Ad5基因治疗载体。然而，第二代Ad5基因治疗载体均有一些共同的缺点<1〉、基于腺病毒生物学基础设计的载体虽然具备肿瘤条件复制性的治疗优势，由于设计上的种种不足，获取的腺病毒在肿瘤细胞中的复制、裂解肿瘤细胞的效力远远弱于wt-Ad5，如单用ONYX-015的抗癌有效率仅为0-14%。<2>、第二代Ad5基因治疗载体的应用仍以肿瘤局部注射为主，在应用中受到极大的限制，在绝大部分情况下，肿瘤是一种全身性疾病，需经静脉用药的途径，进行系统性治疗，以控制原发及转移病灶，因此，第二代Ad5基因治疗载体的选择性和对肿瘤细胞的杀伤效率须进一步加强，以适应改进用药途径的需要。<3>、第二代Ad5基因治疗载体均未携带有效的治疗性目的基因，使治疗效应的发挥受到限制。<4>、由于现有的分子耙点绝大部分缺乏肿瘤特异性，以第二代Ad5基因治疗载体结合外源性启动子、治疗基因的策略虽然具有相对的肿瘤选择性，但仍不能避免对正常组织细胞的毒性作用。<5>、现有的携带治疗基因的Ad5载体感染靶细胞后，携带的治疗基因即获得表达的能力，不能避免地产生对正常组织细胞的毒性作用，尤其毒性或杀伤力较大的外源基因。<6>、第二代Ad5基因治疗载体结合的外源性启动子在细胞中的活性不稳定或较低。<7>、即使现有Ad5基因治疗载体有强大的溶瘤效应，但对肿瘤细胞过早的裂解导致携带的治疗基因不能有效表达，加上体内免疫对病毒的清除，使得病毒的治疗效果较低。另一方面，近年来已经确定了许多肿瘤分子药靶，针对这些分子药耙设计单克隆抗体、小分子化合物，已成为肿瘤治疗发展的主要趋势，其中部分已经成为处方药，尚有大量的分子治疗手段正在临床试用评估阶段，取得了较好的初步结果。尽管如此，由于这些新的分子靶点及其分子阻遏手段，绝大部分缺乏肿瘤特异性，由此产生的剂量限制性毒性，仍然是这些疗法目前普遍面临和亟待解决的关键问题，极大地限制了肿瘤问题的解决。
发明内容基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明将公开一种新的第三代AD5基因治疗载体的构建方案，通过该方案获得的构建体具有肿瘤特异性复制、高度肿瘤特异性大量表达外源性插入基因、强大的肿瘤特异性旁观者效应等明显的优势，并具备高度的治疗指数，适于静脉用药，可以解决目前肿瘤治疗技术和实践中关键的不足之处。本发明的理论基础基于现有研究对Ad5病毒生物学的深入认识。当AD5进入细胞后1小时内，Ad5就会表达出ElA功能蛋白，其生物学效应主要包括两方面，首先，E1A蛋白结合视网膜母细胞瘤突变基因(Rb)蛋白，使宿主细胞内源性转录因子E2F从Rb-E2F的复合物中释放出来，与此同时，ElA蛋白将激活Ad5表达出ElB功能蛋白，以此灭活宿主细胞内源性转录因子P53对细胞周期驱动激酶的抑制，在E1A、E1B和E2F的共同驱动下，宿主细胞进入DNA合成期，为病毒基因组的自我复制提供前提条件；其次，Ad5依赖ElA蛋白激活Ad5的早期基因(E1B，E2，E3，E4)和晚期基因(Ll-6)的表达，为病毒基因组的自我复制、病毒颗粒的包装、逃避宿主细胞的免疫清除、裂解细胞、释放病毒颗粒、再感染等完整的生命周期提供允许环境。由此可见，Ad5依赖ElA蛋白启动其它蛋白的序贯性合成，完成病毒的生命周期，最终裂解宿主细胞。功能蛋白E1A的编码序列位于Ad5基因组560-1112nt,1229-1545nt，包含三个重要序列，分别为677-799nt，此序列为E1A保守序列1(CR1)，用于结合转录辅助因子P3(K)，917-979nt为E1A保守序列2(CR2)，用于结合视网膜母细胞瘤突变基因(Rb)，1007-1115nt为保守序列3(CR3),为基因转录激活区。由于几乎所有的肿瘤均存在Rb调控径路的缺陷，如果对E1A917-979nt的CR2区加以不同的缺失改造，达到灭活E1A蛋白的RB结合特性的同时尽可能保留E1A转录激活特性的效果，由此获取的腺病毒重组体将有可能在肿瘤细胞内有效复制，最终杀灭肿瘤细胞，另一方面，正常细胞具有的Rb调控径路，可以有效遏止腺病毒重组体依赖E1A蛋白启动其序贯性的生命周期，最终仅形成流产感染。这一理论推测已经为近来两个独立的研究组的工作所证实，Fueyo等(Oncogene,2000,19:2-12)构建了缺失E1A923-946nt的腺病毒重组体，观察到该腺病毒重组体选择性地在肿瘤细胞内复制，其复制特性强于wt-Ad5,而对正常细胞无任何毒性作用，单用该腺病毒重组体可显著抑制肿瘤生长;Heise等(NatureMedicine,2000,10:1134-1139)更深入地证实该构建体对肿瘤细胞具有高度选择性，从静脉单用该腺病毒重组体可显著抑制肿瘤生长并抑制肿瘤转移。尽管Fueyo与Heise等的前期工作为发展第三代Ad5基因治疗载体提供了关键的理论线索，他们的工作仍有明显的不足之处，他们发展出的Ad5基因治疗载体不包含任何插入性外源性治疗基因，限制了抗肿瘤效应的发挥。为此，本发明在此基础上构建一种新型的Ad5重组体，其技术特征在于定向缺失Ad5基因组的920-946nt序列，并进一步缺失Ad5E3区29477-29714nt，在该缺失区域引入一个Clal酶切位点；在Clal酶切位点中反向插入770bp的外源性STAT3cDNA片段，该片段相当于STAT3mRNA的第960-190nt，从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺病毒构建体j必/zl￡7/4^Z)尸A45^Z4r3。STAT3基因全称为信号转导及转录活化因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3)，在大部分肿瘤细胞中异常表达或呈持续活化状态，其功能在于促进肿瘤细胞增值抑制其凋亡，促进肿瘤血管生成，使肿瘤细胞获得免疫逃避的能力，而正常细胞并不依赖于这些功能。因此，在本发明中被选为分子药靶。与现有的重组腺病毒构建体相比，本发明达到了以下效果1、本重组腺病毒构建体缺失EIA蛋白的920-946nt序列，在理论和实际上达到了在灭活E1A蛋白的RB结合特性的同时尽可能保留E1A转录激活特性的效果。更为重要的是，我们在/19M-^/6A/5载体的E3ADP区反向插入770bp的外源性STAT3cDNA片段，该片段相当于STAT3mRNA的第960-190nt，使反义STAT3cDNA的表达依赖Ad5自身E3区转录单位的内源性启动子，该启动子具有类似CMV启动子的高活性，启动子的开放完全依赖于病毒基因组DNA在细胞内的复制，病毒如不复制，外源性反义STAT3cDNA将不表达；并且由于ADP基因的缺失，重组腺病毒裂解细胞的能力相对降低，但细胞内病毒一的扩增量显著增加，因而被病毒感染的细胞就成为治疗基因的加工厂。由于这种全新的设计，使这一新的构建体可通过三重机制达到选择性杀灭肿瘤细胞的治疗目的，即构建体只在肿瘤细胞内复制且裂解细胞的时间相对滞后，可使外源性反义STAT3cDNA拷贝数大大增加；构建体携带的反义STAT3cDNA只在肿瘤细胞内表达，该表达完全依赖于病毒基因组DNA在细胞内的复制，因此能特异性封闭肿瘤细胞的STAT3基因表达，达到杀灭肿瘤细胞的目的，避免了对正常细胞的攻击；构建体以肿瘤细胞为复制宿主，在肿瘤局部可产生高浓度病毒，形成强效旁观者效应。构建体的免疫调节蛋白功能完整，一定程度上避免了机体对重组腺病毒的清除。此外，本发明也将为后继其他分子治疗提供一种新的设计模式。2、进年来大量的研究表明，STAT3在大部分肿瘤细胞中异常表达或呈持续活化状态，且肿瘤细胞更依赖于这种活化而存活，对这种活化的抑制也更为敏感。因而为对STAT3短暂的部分封闭提供了较为理想的治疗窗。3、对肿瘤细胞系及正常对照细胞体外实验结果表明，该重组腺病毒构建体对正常细胞STAT3基因的表达无明显影响，对细胞活性无明显影响，相反，它可特异性封闭肿瘤细胞内STAT3基因的表达，有显著的杀灭肿瘤细胞的效应。4、对肿瘤动物模型的体内模型研究证实，通过肿瘤局部注射或静脉注射的用药途径，该重组腺病毒构建体对受试的所有肿瘤动物模型均具显著的治疗作用，并可有效抑制肿瘤转移，且对动物无明显的治疗相关毒性。四附图l:Ad5E3区结构图，该区域编码7种蛋白，要缺失的区域为29477-29714bp，为E3ADP基因，在该区域反向插入770bp的外源性STAT3cDNA片段,该片段相当于STAT3mRNA的第960-190nt。附图2:组病毒构建体j必/4M/」^D/yAss:^7^结构示意图。附录1:重组腺病毒构建体^/5/4五〃^UD尸/ASS:C4r3序列及结构说明。五、具体实施例下列实施例中，除特别注明外，技术流程中所用的酶和PCR引物均购自美国Gibco公司。例l、pXCl系列突变体(」920-^6pJV:C7)的构建pXCl购于MicrobixBiosystemInc.(Toronato,Ontario,Canada,目录号PD-01-03),该质粒包含人类5型腺病毒(Ad5)21-5790nt序列。采用3次PCR法缺失920-946nt,片段1的获取弓l物1=5'-CGGGATCCGGGCCCCCATTTCC-3'，相当于9883-9902nt,下划线部分为BamHI酶切位点；引物2=5'誦GTCACTGGGTGGATCGATCACCTCCGGTAC隱3'，相当于922-卯5nt，下划线部分为与引物3互补部分；以pXCl为模板，行PCR反应，反应体系总体积为lOOul包括含MgCl2的10xPCR缓冲液10ul2mMdNTP10lUIOpM引物1lullOuM引物2UlpXC110ng/ullulpfu高保真Taq酶2.5u加水至100iU;反应条件为95°C30秒；95°C45秒、60°C1分钟、72°C2分钟共28循环；72°C延伸10分钟。PCR产物长940bp，形成片段l，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。片段2的获取弓|物3=5'-GAGGTGATCGATCCACCCAGTGACGACGAG-3'，相当于911-947nt,下划线部分为与引物2互补部分；引物4=5'-TGCTCTAGACACAGGTGATGTCG-3'，相当于1344-1325nt，下划线部分为Xbal酶切位点；以pXCl为模板，行PCR反应，反应条件同上，产物长400bp，形成片段2，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。片段3的获取将50ng/2y1片段1与25ng/1lU片段2混合，作为模板行PCR反应，上游引物为引物1，下游引物为引物4，反应条件同上，产物约为1400bp，形成片段3，用QIAquick8PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN，German,Cat:28142)纯化后，用BamHI,Xbal双酶切过夜，酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切片段用于克隆。将pXCl用BamHI,Xbal双酶切过夜，酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离后产生2条带，约为1400bp和8500bp，回收8500bp酶切片段用于克隆。取40ng的8500bppXCl酶切片段及90ng片段3，用DNAT4连接酶做连接反应，取1.5Ul转化lOOulDH5a感受态细菌，铺皿过夜培养，第二天挑取单个菌落克隆，提取其内扩增的质粒，DNA测序鉴定筛选得到缺失12l-129AA920-946nt的pXCl质粒突变体-4W0-W(5p义C7，用于重组腺病毒的克隆。例2、a9M-W64rf5重组腺病毒的构建pBHGE3购于MicrobixBiosystemInc.(Toronato,Ontario,Canada,目录号PD-01-12),该质粒包含除ADd5包装信号(194-358nt)外的全部基因组序列。pBHGE3从MicrobixBiosystemInc.获取时，总量为10ug，先电转入感受态细菌，挑取阳性克隆，提取质粒，得到的质粒用CsCl2-EB超速离心法纯化。同源重组法获取^"0-^/6^必重组腺病毒构建体，方法如下在15cm培养皿中种入7.5x105293细胞，培养液为10%FBSDMEM，到第二天，细胞应为1-1.5x106，大约70%的细胞融合；转染前3-4小时，换成新鲜培养液。配制共转染DNA-磷酸钙溶液将1600|al灭菌的2xHBS(280mMNaCl,43mMHEPES,10mMKC1,10mMNa2HP04.7H20,2%dextrose,pH7.05-7.15)/pBHGE3和pXC7各42pg/加灭菌的双蒸水至2840pl混匀，缓慢加入50|al2.5M的CaCl2,颠倒混匀,在室温下让DNA/CaCl2沉淀45-60分钟，形成微混浊的沉淀。加500上述混合液至含5ml60mm培养皿的293细胞中，在37°C、5%C02中孵育4-6小时，吸去上述液体，用PBS洗一次。用含15%的甘油/DMEM处理1-2分钟以促进转染效率，用PBS洗一次，换为完全培养液。制备1.8%低溶点琼脂糖，高压灭菌，分装成5ml，用前在沸水中融化，保温在45。C，用时加入等量4%FBSDMEM，即刻铺入培养皿中。吸去培养液，加入5ml上述液体。每4-5天，加入3ml上述液体。14-21天，噬斑出现，选定6-12个噬斑。将噬斑转移到含无血清DMEM培养基的1.5ml的EP管中，在37。C孵育24小时。在24孔板培养皿中种入1x105293细胞，培养液为10%FBSDMEM,到第二天，细胞应为2x105，大约70%的细胞融合，吸去液体，从上述孵育液取100pi(大约为103病毒)加入，轻轻晃动液体3次，在37。C、5%C02中孵育90分钟。加入完全培养基至lml，将细胞放置于37。C,5%C02中孵育5-10天，直至完全的CPE出现，所谓CPE，即细胞毒效应，细胞表现为变圆、漂浮、细胞以核仁为主。假如10天后，完全的CPE未出现，则提示病毒的效价太低，需进行第二轮的扩增。将培养板进行三轮的冻/解冻的循环，释放出病毒，将裂解液收集于15ml试管，最大速度离心IO分钟，收集上清液，冻于-80。C，该液体称为第二代病毒，大约为5xl07/1111病毒。对以上病毒进行再次扩增，在75cm2培养皿中种入5x106293细胞，培养液为10ml10%FBSDMEM,到第二天，细胞应为1x107，大约70%细胞融合；转染前3-4小时，换成新鲜培养液；取1ml第二代病毒储存液加入完全培养基至1ml，用于转染；该MOI约为5;除去75cm2培养皿的液体，加入以上液体，轻轻摇动三次；在37。C、5%C02中孵育卯分钟；加入9ml2%FBSDMEM，在37°C、5%C02中孵育4-7天，用于提取病毒DNA用于阳性病毒的筛选。因为293细胞基因组包含完整的E1A基因，提取阳性病毒DNA时容易污染293细胞DNA，造成鉴定失败，为此将^"0-何6A/5在肿瘤细胞Hela中再扩增一次，用于鉴定，步骤如下在6孔板培养皿中种入lxl()5Hela细胞，培养液为10%FBSDMEM,到第二天，细胞应为2xl05，大约70%的细胞融合，吸去液体，从上述滤过液取100ial(大约为103病毒)加入，轻轻晃动液体3次，在37。C、5%C02中孵育90分钟。加入完全培养基至lml，将细胞放置于37。C、5%C02中孵育5-10天，直至完全的CPE出现，将细胞刮下，收集于1.5mlEP管，离心弃上清，加入300plPBS溶液，进行三轮的冻/解冻的循环，释放出病毒，将裂解液最大速度离心10分钟，收集上清液，冻于-80。C，用Qiagen公司试剂盒miniDNAisolationkit，参照试剂盒说明提取DNA。以病毒DNA为模板，行PCR反应，上游引物=5'-CGGGATCCGGGCCCCCATTTCC-3'，下游引物=5'-TGCTCTAGACACAGGTGATGTCG-3'，反应体系总体积为100y1包括含MgC12的10XPCR缓冲液10lU/2mMdNTP10y1/10uM上游引物1iU，10uM下游引物lU1/病毒DNA10ng/pfu高保真Taq酶2.5u/加水至100U1。反应条件为95°C30秒/95°C45秒、60°C1分钟、72°C2分钟共28循环/72。C延伸10分钟。PCR产物为1400bp，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于DNA测序，测序引物为5'-AGCCGGAGCAGAGAGCCTTG-3'，挑出正确克隆用于构建^必/4￡7/^^AP/AS5T4n重组腺病毒。例3、Ad5E3区的亚克隆载体/)0)]\^0./-4/^)尸的构建Ad5E3区全称为Ad5早期区域3，该区域在内源性启动子的驱动下，编码7种蛋白，序列、结构、功能参见附图l:12.5k,27858-28179nt,功能未明；6.7k，27547-28736nt,和RID复合体一起抑制TRAIL受体1、2在细胞表面的表达；gpl9k,28735-29215nt,结合MHCI类抗原，抑制其至细胞表面的呈递，逃避CTL的清除;ADP,29419-29770nt,裂解细胞，释放病毒；RIDa,29784-30057nt，与RIDP形成复合物，防止TNF的裂解，清除FAS抗原；RIDP,30062-30458nt及14.7k,30453-30837,抑制TNF的裂解。本实验的目的是要缺失E3区29477-29714nt区域，并在重组腺病毒的E3ADP区域插入外源性治疗基因。采用3次PCR法缺失Ad5E3区29477-29714nt:片段1的获取弓l物1=5'-ATACGCGCCCACCGAAAC-3'，相当于27306-27323nt;引物2=5'-AATCTATGGATATCGATAGGGTGGGTCGCTGTAGTT-3',相当于29477-29495nt，(下划线部分为与引物3互补部分,ATCGAT为Clal酶切位点)；以Ad5DNA为模板，行PCR反应，反应体系总体积为100lU包括:含MgCl2的10XPCR缓冲液10lU2mMdNTP10ii110uM引物11iUlOuM引物21ulAd5DNA200ng/nl1ulpfu高保真Taq酶2.5u加水至100ill;反应条件为94°C30秒；94°C30秒、46°C1分钟、72°C1分钟共30循环；72°C延伸10分钟。PCR产物为2207bp(片段l)，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。片段2的获取引物3=5'-CGACCCACCCTATCGATATCCATAGATTGGACGGACTG-3'(相当于29714-29734n)(下划线部分为与引物2互补部分，ATCGAT为ClaI酶切位点)引物4=5'-ATGTCTTTGAGGCTTGGAGG-3'(相当于30137-30118nt);PCR反应条件同上，产物为422bp(片段2)，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。片段3的获取将片段l与片段2等量混合，作为模板行PCR反应，上游引物为引物1，下游引物为引物4，反应条件同上，产物约为2612bp(片段3)，用QIAquick8PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN,German,Cat:28142)纯化后，用EcoRI酶切过夜，酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收，酶切片段用于后继连接反应。将pCDNA3.1(Invitrogen,U.S.A.,Cat:V79020)用EcoRI酶切过夜，酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切片段，去磷酸化后用于后继连接反应。将PCR反应产物片段3与酶切、去磷酸化后pCDNA3.1连接，取1.5yl转入100y1DH5a感受态细菌，挑取阳性克隆，质粒小提，DNA测序鉴定筛选得到缺失29477-29714nt的pCDNA3.1质粒突变体-户CZ)A^3.7-zUDP，用于插入外源性治疗基因的亚克隆。例4、在载体pCDiVA./-」AD/的中反向插入770bp的外源性STAT3cDNA片段STAT3cDNA片段从乳腺癌细胞系MDA-MB-231的RNA中扩增而来，逆转录条件5XMMLV缓冲液4iU10mMdNTP1y1OligdT(50ng/ml)1yl总RNA2ixlRnasin0,5y1MMLV逆转录酶1ul加无RNA酶水至20nl;逆转录反应产物用于PCR反应。上游引物为5'-CCATCGATGGCCTCTCGGCCTCTGCC-3'，该片段相当于STAT3cDNA编码序列的第190-1207nt(下划线部分为Clal酶切位点)；下游引物为5'-CCATCGATTTGCCGCCTCTTCCAGTCAGC-3'，该片段相当于STAT3cDNA编码序列的第960-961nt(下划线部分为ClaI酶切位点)，扩增片段包括STAT3cDNA编码序列的第960-190nt，全长约为770bp。反应体系总体积为100y1包括含MgCk的10XPCR缓冲液10ul2mMdNTP10u1lOuM上游引物1ullOuM下游引物1u1逆转录反应产物2pfo高保真Taq酶2.5u加水至100ul;反应条件为94。C30秒；94°C30秒、52°C1分钟、72°C1分钟共30循环；72°C延伸10分钟。PCR产物为776bp，Clal酶切后，常规电泳分离纯化，检测浓度用于后继PCR反应。载体pCZ)A^3.7-^UD尸用ClaI酶切线形化后，常规电泳分离纯化，去磷酸化后与770bp的外源性STAT3cDNA片段连接，取1.5u1转入100u1DH5a感受态细菌，挑取阳性克隆，质粒小提，DNA测序鉴定筛选得到在ClaI酶切位点反向插入770bp的外源性STAT3cDNA片段的质粒突变体？《);^3./-4^z)PA4SS:C4n，用于后继重组腺病毒的克隆。例5、重组腺病毒构建体Jrf5/df7/MADiy/!S^7MrJ的获取重组腺病毒构建体v4必/MW/」^D尸A45^7^r3的获取按照参考文献"Adenovirusmethodsandprotocol,editedbyWilliamS.M."Wold,constructionofmutationsintheadenovirusearlyregion3(E3)transcriptionunits,11-24"建立的连接法(ligationprotocol)进行，主要步骤包括TPDNA的提取；用于重组腺病毒构建E3区DNA的准备；连接反应；共转染293细胞同源重组；噬斑的挑取和鉴定；阳性病毒的扩增和纯化。详细方法参见该文献。通过以上实验步骤得到重组腺病毒构建体^^DiV^SSL47X该腺病毒缺失了Ad5920-946nt序列(GATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTT)，该序列编码E1A蛋白121至129位氨基酸，并缺失Ad5E3区29477-29714nt，在Clal酶切位点中反向插入770bp的外源性STAT3cDNA片段，该片段相当于STAT3mRNA的第960-190nt，其他基因组结构与wt-Ad5完全相同，其序列及结构见附图2及附录1。例6、重组腺病毒构建体Jrf5/ME7/^UZWyAS^2Mrj特征鉴定1、重组腺病毒构建体的体外肿瘤特异性复制的鉴定本实验的目的在于鉴定A/5/zl￡7/zUZ^/AS5TJn重组腺病毒在一系列肿瘤及正常细胞中的复制特点，实验将以wt-Ad5为阳性对照，以复制缺陷型病毒Ad5CMV-GFP为阴性对照。选用细胞系为人肺癌细胞系A549(P53+，RB-)，人高转移性前列腺癌细胞系PC3M-lE8(P53-，RB-),人成骨细胞瘤细胞系U-20S(P53+，RB-)，人结肠癌细胞系HCT-8(P53+，RB+),人乳腺癌细胞系MCF-7(P53+，RB+)。选用的细胞系具有不同的P53，RB基因表型；具有不同组织源性，因此实验结果可代表不同类型的肿瘤。选用的正常细胞为原代的血管内皮细胞、原代的肺小气管上皮细胞、前列腺上皮细胞、骨髓单个核细胞，选用原则为静脉用药后将接触大量腺病毒的正常组织细胞。在24孔板培养皿中种入lxl()S肿瘤或正常骨髓单个核细胞，培养液为10。/。FBSDMEM或RIPM1640,到第二天大约70%的细胞融合，吸去液体，加入达到70。/。所需的MOI稀释至100|il加入，轻轻晃动液体3次，在37°C、5%C02中孵育90分钟。加入含2%FBSDMEM或RIPM1640培养基至1ml，将细胞放置于37°C5%C02中孵育3-10天，观察细胞出现完全CPE所需的时间。实验结果表明，阳性对照wt-Ad5无选择性地裂解肿瘤和正常细胞；复制缺陷型腺病毒Ad5CMV-GFP不能裂解任何细胞，重组腺病毒构建体^必/M￡//^UD/VASST4r3选择性地杀伤肿瘤细胞，其效应显著强于wt-Ad5对细胞的裂解效应，同时该重组腺病毒构建体对正常对照细胞系无明显影响。结果充分表明重组腺病毒构建体^/5/z!57/MJi)尸/^S^L4r3选择性杀灭肿瘤细胞，具体数据见下表-<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>为进一步进行定量检测^^/M五〃zUD尸/ASS7^n重组腺病毒构建体在肿瘤细胞中复制效率，进行了以下实验''-在24孔板培养皿中各种入1x105各种肿瘤细胞或原代正常细胞，培养液为10%FBSDMEM或RIPM1640,到第二天，大约70%的细胞融合，吸去液体，加入A/5/M￡7/^UZ)/y^SSZ471310MOI稀释至100pl加入，轻轻晃动液体3次，在37。C、5%C02中孵育90分钟。加入含2%FBSDMEM培养基至1ml，将细胞放置于37°C、5%C02中孵育3天。加入300^1PBS溶液，进行三轮的冻/解冻的循环，释放出病毒，将裂解液最大速度离心10分钟，收集上清液，冻于-80。C，TCID5o法检测病毒的滴度。结果表明A^/M五〃4^D/VASS7^rJ在肿瘤细胞中复制后其效价强于起始的3000-5000倍，而在正常细胞中感染效价无明显变化，结果充分表明该重组腺病毒构建体具有在肿瘤细胞内特异性复制的特性。2、重组腺病毒构建体的体外选择性灭活肿瘤细胞STAT3表达特性的鉴定本实验的目的在于鉴定A/5/M五7/ZUZ)P/』5^7^"重组腺病毒在对一系列肿瘤及正常细胞STAT3表达的影响，实验选用细胞系为人肺癌细胞系A549(P53+，RB-)，人成骨细胞瘤细胞系U-20S(P53+，RB-)，人转移性前列腺癌细胞系PC3M-1E8(P53-，RB-)，人结肠癌细胞系HCT-8(P53+，RB+)，人乳腺癌细胞系MCF-7(P53+，RB+)。选用的细胞系具有不同的P53，RB基因表型；具有不同组织源性，因此实验结果可代表不同类型的肿瘤。选用的正常细胞为原代的血管内皮细胞、原代的肺小气管上皮细胞、前列腺上皮细胞、骨髓单个核细胞，选用原则为静脉用药后将接触大量腺病毒的正常组织细胞。在24孔板培养皿中种入1x105肿瘤或正常细胞，培养液为10%FBSDMEM或RIPM1640,到第二天大约70%的细胞融合，吸去液体，加入达到70%所需的MOI稀释至100ial加入，轻轻晃动液体3次，在37。C、5%C02中孵育90分钟。加入含2%FBSDMEM或RIPM1640培养基至1ml，将细胞放置于37。C、5%C02中孵育3-10天，提取细胞总蛋白检测STAT3蛋白表达水平的变化。实验结果表明，重组腺病毒构建体A/5/4五7/zUZ)/V^5T4n能选择性封闭肿瘤细胞STAT3蛋白的表达，同时该重组腺病毒构建体对正常对照细胞系STAT3蛋白表达无明显影响。结果充分表明重组腺病毒构建体^必/^^7/z^D/yA^7^r3选择性灭活肿瘤细胞STAT3基因的表达。3、重组腺病毒构建体^/5/4五7/zMDPA45^7^n体内抗肿瘤效应的鉴定肿瘤细胞动物模型选择46周龄的BALB/c裸鼠，取对数生长期的胃癌细胞系MKN-45细胞，调整细胞密度lx106/100^，每只裸鼠右侧背部皮下接种200^1，待肿瘤平均直径达到0.4-0.6cm时，按肿瘤大小随机分为4组，即介质对照组、wt-Ad5组、Ad5CMV-GFP组和爿必/」五J/M爿D户/^SSZ473组，每组10只裸鼠，分别瘤内注射PBS，wt-Ad5，Ad5CMV-GFP和爿必/M五/zMADiy^S"S7^rJ，每只2x108pfu/(只次)，每天一次，连续5天。每周观察并测量肿瘤体积2次，直至实验终点(100天或肿瘤体积大于lcm3)。实验结果表明，在实验终点时，wt-Ad5组平均肿瘤抑制率为40%土2%;Ad5CMV-GFP组肿瘤抑制率为-2%±3%;A^/zl五7/zUDiVASS7^r3组三只裸鼠肿瘤完全消退，平均肿瘤抑制率为90%±3%，结果充分表明重组腺病毒构建体爿必/4五J/^AD尸A45^Z4ra具有确定的体内抗肿瘤效应。体静脉用药对胃原位癌模型的治疗及对肿瘤微转移的抑制当胃癌皮下肿瘤生长至0.7-0.8cm时，选择全身状况较好荷瘤动物，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出瘤块，用手术刀切割成l-2mm的瘤块，移植到胃小弯粘膜下。动物B超监测当肿瘤生长至3mm时，随机分为4组，即PBS对照组、wt-Ad5组、八350^^-0组和^/5/^1^//1^0/>/^^7^73组，每组10只裸鼠，用2xl()Spfo病毒静脉内注射，连续治疗5天。动物B超监测肿瘤体积。至实验终点(30天或肿瘤体积大于1.2cm3),取出肺、肝、空、结肠及腹膜后、门静脉和肺门淋巴结，病理检测微转移。实验结果表明，在实验终点时，PBS对照组全部有多器官、组织肿瘤转移，wt-Ad5组肿瘤抑制率为25%±2%,IO只裸鼠中8只发生肿瘤多器官转移；Ad5CMV-GFP肿瘤抑制率为-3%±4%;肿瘤转移的发生率为100%;/UZ)5/^l五7/」^D尸Z4然7^n/组3只裸鼠肿瘤完全消退，肿瘤抑制率为85%±4%，1只发生肿瘤空、结肠种植性转移。以上结果充分表明重组腺病毒构建体^A5/^￡〃」JD尸/^SS7^n静脉用药具有显著的体内抗肿瘤和抑制肿瘤转移的效应。附件DNA序列表<110>深圳市奥尼克斯基因技术有限公司<110>马丁周剑峰王世宣卢运萍韩志强<120>选择性封闭肿瘤STAT3的新型溶瘤腺病毒构建体的获得及用途<140><141><160>1<170><210>1<211><212>DNA<213>人工序列<220><223>misc—feature<400>catcatc犯ta已tatacctt￡Lttttgg￡Lttgaagccaatatgataatgagggggtggagt60ttgtgacgtggcgcggggcgtggg縦ggggcgggtgacgtagtagtgtggcggaagtgt120gatgttgc犯gtgtggcggagcgacggatgtggc^aagtgacgtttttg180gtgtgcgccggtgtacacsggaagtgacaattUcgcgcggtttt鄉cggatgUgtag240ta犯tttgggcgtaaccgagtaagatttggccattttcgcgggaaaactg300agtg￡L3￡LtCtgtgttactxatagcgcgtsatatttgtctagggccgcggg360gactttg已ccgUtacgtggagactcgcccaggtgtttttctcaggtgttttccgcgttc420cgggtca犯gttggcgtttttcagctgacgtgtagtgtatttatacccgg480tgagttcctcaagaggccactcttg已gtgccagcgagtagagttttctcctccgagccgc540tccgacaccgtatctgccacgg鄉tgUa600aatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaag鄉tactggctgataatcttccacc660tcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgt已tgatttagacgtg已cggcccc720cgaa,g&tccccggtttcgcagatUttcccgactctgtaatgttggcggL780gc鄉a鄉gattgacttactcacttttccgccggcgcccggttxtccggagccgcctca840cctttcccggcagcccgagc已gccggagcsg卿gccttgggtccggtttctettgccaaa900ccttgtaccgg鄉tgatcg3tc已cgsggctggctttccacccagtgacgacgaggatga960gagtttgtgtta^gattatgtggagcaccccgggcacggttgc鄉tcttg1020tcattstcaccgggggaccctgttcgctttgctatatgag1080gacctgtggcatgtttgtctacagtaagtg犯犯tt3tgggcagtgggtgELt卿gtggt1140gggtttggtgtggt犯ttttttttttaatttttacagttttgtggtttaaiag组tttgt菌attgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccg函gagcctgcaagacctscccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgaca1320tcacctgtgtC"t3g已g3已tgc已atagt已gtacggatagctgtgactccggtccttctaac1380acacctcctgagatacax;ccggtggtcccgctgtgccccattsiaaccsgttgccgtg卿1440gttggtgggcgtcgccaggctgtgg犯tgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaa1500cctttggacttgsgctgtaaacgccccaggccat犯ggtgt已aacctgtgattgcgtgtg1560tggttaacgcctttgtttgctgaatgagttg已tgtaagttt已at3犯gggtg已gataatg1620tttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggt3ta^aatgcgccgtggg1680ctaatcttgggtgcgtaactggctcatcccgagcttttg已ttcc肌gagagttgctttttteLCCtgctggctgctsctgtcagg郷肌ggaccctxgggtgacaattacgtattactttagtattccatctattagggtttgta犯tatcggaggatagtggacggggttcctggccaagtgtggaagc鹏tggtgtgccttgggtatgttgcttcatgcg鄉織gccattcacgtcccgctgttctgagtcacactgtttgacatgcagacGctgccg鄉agctgcgatga卿at3tataaggtgagcaccaacatgggccggccgca犯ctccctccgccgctcctgagccccggctctttttgttggatcttttattt已ggtcctgtgtattaagcccgtctgtagatgatttacatctgatgctggaaca3ggC3犯gttaatcctgtggaggtcatca已tgagttttatattttctggctgtcttccgtcc鄉cggcg卿ggatggggg鄉ctaggtcaacagatc卿gcagctgat已tgcaaagcaggaattgtggtggcctttggtt已ttatgtaccaaccttctggaccgattcgccccaaacctgtctgaggct已gtgaaaggcctctcagagccagccaccttgcatttggacceLtgaag卿gtgtggcg鄉CCCg3ttac已gattg已tgggggtcttctcgtttgatggtgcgtcagtactaccttgcgctixagccgcttgcaagcggcac犯ttggcgcc已gcagtaaaaaaccaggtntgcgctttttccaggtctggggtggccagtcgtagcctcatggaggagctctaacagtctgcagatgagctgtttgactttggatcatgcatctgccgcccggcggcggc郷3ggt織ggtggcaggggctaaaatctagcttaaggstaattaccacttactg"tggC3Ctt3tgctacatttagatgt已gcaatcctacacggtaagggttc鄉鄉gcttggtasctcca观cgtggctgatgctgaccttctcgc犯ggggt犯caggacttgagcccgatxtggaaggcacttggtgcggtactg犯satgtagttttggaagcattgaatgtgatgggctgceLgccaagtgcagcttgattxtttgagtttctgcccgactctgtttgcgcggtagg已Cgtggt333aggtagcacccaggagcgctgcttgggagtagtacctcttatt朋gg站ggattctttgattttccacactggagcg鄉tgg卿gcggatastaccgacagagcccat鄉gggt咖ttagcttaMgcgctaatgaggctgcagccggcc聊ttgctggg雄ggtgat犯at3tttactggcccgtgt犯gcttggggctgtgc鹏tgcgccstgatta^gcagctcgg已cggcctggccagtggggggtgttag3gcatgtctgctgaggtatggcctgcactgtgtgggcggtatctgttttgagctcatagctccagcatccgtgtctggccgc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技术领域：
。用PCR扩增定点缺失、酶切、连接、克隆、同源重组、转染、腺病毒单克隆纯化等技术，获得的一种重组腺病毒构建体，其技术特征在于Ad5基因组E1A保守序列2(CR2)区缺失27个碱基；E3区ADP基因的29477-29714nt缺失；同时在该缺失区反向插入部分STAT3cDNA片段。该构建体是一种具有更高的肿瘤选择性复制能力的新型溶瘤腺病毒载体。该构建体在肿瘤的生物治疗中具有独特的实用价值，也为肿瘤基因治疗提供了理想的基因靶点特异性治疗模式。文档编号A61K47/42GK101440379SQ20071018784公开日2009年5月27日申请日期2007年11月20日优先权日2007年11月20日发明者卢运萍,周剑峰,王世宣,韩志强,丁马申请人:深圳市奥尼克斯基因技术有限公司