肌 肉注射药液的吸收的药物中的应用。
[0036] 相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0037] 本发明冻干剂能最大程度的维持透明质酸酶在常温条件下的稳定性，冻干剂便于 储存、运输和使用，冻干剂中不含有人血白蛋白，降低病原体感染的风险，本发明冻干剂的 成分均为无毒安全成分，安全性高，临床上可用于促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散、 促进局麻药的浸润，减轻注射部位的疼痛，加速皮下注射或肌肉注射药液的吸收等适应症。
【附图说明】
[0038] 图1是实施例1制备得到的冻干制剂的稳定性曲线图；
[0039] 图2是实施例2制备得到的冻干制剂的稳定性曲线图；
[0040] 图3是实施例3制备得到的冻干制剂的稳定性曲线图；
[0041 ]图4是实施例4制备得到的冻干制剂的稳定性曲线图。
【具体实施方式】
[0042]下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明 了，所述实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0043] 实施例1
[0044]采用CH0细胞悬浮培养获得重组人透明质酸酶，经摇瓶培养逐步扩大到30L反应器 规模的生产。CH0细胞在本公司自主研发的无血清培养基中生长，以补料流加培养方式生 产，选择本公司自主研发的无血清补料培养基进行控制流加;培养至3-4天时，向生物反应 器中每天添加补料培养基的量为生物反应器中实际培养体积2%-5 %。培养温度控制在35-37°(：，通过补加10%恥2(：03及(：02控制？!17.0控制在器 ；反应器通气量控制在0.015~ 0.15vvm;转速控制在80-150rpm;溶氧值控制在20-40%。在细胞培养过程中，每天取样，监 测温度、pH、葡萄糖浓度、乳酸浓度、摩尔渗透压浓度及蛋白表达量;CH0细胞活率低于80 % 或培养周期达14-20天时，结束培养。
[0045] 将重组人透明质酸酶上清经过深层过滤，阴离子层析，亲和层析，疏水层析，阳离 子层析，超滤换液得到纯度大于99%的透明质酸酶，比活100000IU/mg。
[0046] 将纯化后的透明质酸酶1800000IU以及如表1所示的缓冲剂、冷冻保护剂、赋形剂、 酶活保护剂和表面活性剂用注射用水溶解，定容至6000mL，按0.6mL/支分装10000支，按照 表2所示冷冻干燥程序进行冻干。
[0047] 表 1
[0052] ~从冻干得到的A、B、C、D、E、F的每组样品中进行抽检，测定抽检样品的形状以及含 水量，结果如表3所示。
[0053] 表 3
[0054]
[0055]取液体制剂与抽检的样品同时放入40 °C培养箱，比较冻干制剂同液体制剂(每毫 升8 · 5mg氯化钠，1 · 4mg磷酸氢二钠，lmg人血白蛋白，1 · 5mg L-甲硫氨酸，0 · 2mg吐温80)的稳 定性，结果如图1所不。
[0056]由图1可以看出，43、(：、04、？冻干制剂稳定性均好于液体制剂。为了保持蛋白稳 定，冻干制剂中冷冻保护剂可以选择为以10000支计算，冷冻制剂中含有60g_180g的蔗糖或 海藻糖。
[0057] 实施例2
[0058]在本实施例中将重组人透明质酸酶1800000IU以及如表4所示的缓冲剂、冷冻保护 剂、赋形剂、酶活保护剂和表面活性剂用注射用水溶解，定容至6000mL，按0.6mL/支分装 10000支，按照表2所示冷冻干燥程序进行冻干。
[0059]表 4
[0061]从冻干得到的G、H、I的每组样品中进行抽检，测定抽检样品的形状以及含水量，结 果如表5所;
[0062]表 5
[0064]取液体制剂与抽检的样品同时放入40°C培养箱，比较冻干制剂同液体制剂(每毫 升8 · 5mg氯化钠，1 · 4mg磷酸氢二钠，lmg人血白蛋白，1 · 5mg L-甲硫氨酸，0 · 2mg吐温80)的稳 定性，结果如图2所不。
[0065] 由图2可以看出，G、H、I冻干制剂稳定性均好于液体制剂，为了保持蛋白稳定，冻干 制剂中赋形剂可以选择为以10000支计算，冷冻制剂中含有180g_300g的甘露醇。
[0066] 实施例3
[0067]在本实施例中将重组人透明质酸酶1800000IU以及如表6所示的缓冲剂、冷冻保护 剂、赋形剂、酶活保护剂和表面活性剂用注射用水溶解，定容至6000mL，按0.6mL/支分装 10000支，按照表2所示冷冻干燥程序进行冻干。
[0068]表 6
[0069]
[0070] 从冻干得到的J、K、L、M、N、0的每组样品中进行抽检，测定抽检样品的形状以及含 水量，结果如表7所示。
[0071] 表7
[0072]
[0073]取液体制剂与抽检的样品同时放入40 °C培养箱，比较冻干制剂同液体制剂(每毫 升8 · 5mg氯化钠，1 · 4mg磷酸氢二钠，lmg人血白蛋白，1 · 5mg L-甲硫氨酸，0 · 2mg吐温80)的稳 定性，结果如图3所不。
[0074] 由图3可知，】、1(、1^、10冻干制剂稳定性均好于液体制剂，为了保持蛋白稳定，冻 干制剂中表面活性剂可以选择为以10000支计算，冷冻制剂中含有〇. 3g-3.0g的吐温20或者 吐温80。
[0075] 实施例4
[0076] 将不同剂量的透明质酸酶以及如表8所示的缓冲剂、冷冻保护剂、赋形剂、酶活保 护剂和表面活性剂用注射用水溶解，定容至6000mL，按0.6mL/支分装10000支的制剂进行冻 干，按照表2所示冷冻干燥程序进行冻干。
[0077] 表 8
[0079] 从冻干得到的P、Q、R、S的每组样品中进行抽检，测定抽检样品的形状以及含水量， 结果如表9所示。
[0080] 表 9
[0082]将这四种不同透明质酸酶剂量的冻干制剂放入40°C培养箱中，比较高剂量透明质 酸酶和低剂量透明质酸酶的稳定性，结果如图4所示。
[0083]由图4可知，Q、R、S三种高剂量冻干制剂同P低剂量冻干制剂稳定性相当。冻干制剂 以10000支计算，透明质酸酶总活力可以在1400000~500000000IU之间。
[0084] 因此，在本发明中利用1400000~2000000IU的重组人透明质酸酶、5~10g缓冲剂、 60~180g冷冻保护剂、180~300g赋形剂、5~12g酶活保护剂和0.3~5g表面活性剂制备得 到10000支冻干制剂，其稳定性高，便于储存、运输和使用。
[0085]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的重组人透明质酸酶冻干制剂 及其制备方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例 才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料 的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围 之内。
【主权项】
1. 一种重组人透明质酸酶冻干制剂，其特征在于，所述重组人透明质酸酶冻干制剂以 10000支计算，包含如下组分： 重组人透明质酸酶 1400000~500000000IU 缓冲剂 5~10g 冷冻保护剤 60-180g 赋形剂 180~300g 酶活保护剂 5~12g 表面活性剂 0.3~3g。2. 根据权利要求1所述的重组人透明质酸酶冻干制剂，其特征在于，所述重组人透明质 酸酶通过CH0表达的细胞上清液纯化得到； 优选地，所述重组人透明质酸酶纯度>95%，比活大于100000IU/mg。3. 根据权利要求1或2所述的重组人透明质酸酶冻干制剂，其特征在于，所述缓冲剂为 磷酸盐缓冲液。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的重组人透明质酸酶冻干制剂，其特征在于，所述冷 冻保护剂为蔗糖、海藻糖、麦芽糖或乳糖中的任意一种或至少两种的组合，优选为蔗糖和/ 或海藻糖。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的重组人透明质酸酶冻干制剂，其特征在于，所述赋 形剂为甘露醇和/或甘氨酸，优选为甘露醇。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的重组人透明质酸酶冻干制剂，其特征在于，所述酶 活保护剂为氯化钠、氯化钙或乙二胺四乙酸二钠中的任意一种或至少两种的组合，优选为 氯化钙和乙二胺四乙酸二钠的组合； 优选地，以10000支计算，所述重组人透明质酸酶冻干制剂中氯化钙的含量为1.2-2.4g，乙二胺四乙酸二钠含量为4.8-6.0g。 优选地，所述表面活性剂为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或TritonX-100中的任意一 种或至少两种的组合，优选为聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的重组人透明质酸酶冻干制剂，其特征在于，所述冻 干制剂用注射用水溶解后，用于皮下或者静脉注射。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的重组人透明质酸酶冻干制剂的制备方法，其特征 在于，所述方法包括以下步骤： A、 重组人透明质酸酶、缓冲剂、冷冻保护剂、赋形剂、酶活保护剂和表面活性剂加入至 水中混合均匀，制备得到重组人透明质酸酶液体制剂； B、 将步骤A得到的重组人透明质酸酶液体制剂进行分装，分装后的制剂冷冻干燥得到 重组人透明质酸酶冻干制剂。9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥过程为： (1)在-2°C~-8°C环境下预冻0 ? 5~lh; (2) 在-35°C~-40°C环境下预冻2~4h; (3) 在_15°C~-30°C，10~20mbar环境下干燥 15~25h; (4) 在_5°C~10°C，10~20mbar环境下干燥0 ? 5~3h; (5) 在15°C~30°C，10~20mbar环境下干燥5~15h〇10.根据权利要求1-8中任一项所述的重组人透明质酸酶冻干制剂在制备促进手术及 创伤后局部水肿或血肿消散、促进局麻药的浸润、减轻注射部位的疼痛或者加速皮下注射 或肌肉注射药液的吸收的药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种重组人透明质酸酶冻干制剂及其制备方法和应用，所述重组人透明质酸酶冻干制剂以10000支计算，包含如下组分：1400000～500000000IU重组人透明质酸酶、5～10g缓冲剂、60～180g冷冻保护剂、180～300g赋形剂、5～12g酶活保护剂和0.3～5g表面活性剂，本发明冻干剂能最大程度的维持透明质酸酶在常温条件下的稳定性，冻干剂便于储存、运输和使用，冻干剂中不含有人血白蛋白，降低病原体感染的风险，本发明冻干剂成分均为无毒安全成分，安全性高。
【IPC分类】A61P7/10, A61K9/19, A61K47/42, A61P29/00, A61K38/47
【公开号】CN105727267
【申请号】CN201610081945
【发明人】王征, 房鑫, 楼俊文, 谭靖伟, 徐云霞, 唐瑶, 叶亚文, 陆盼
【申请人】苏州康聚生物科技有限公司
【公开日】2016年7月6日
【申请日】2016年2月5日