狂犬病疫苗的制作方法

专利名称：狂犬病疫苗的制作方法
本申请要求保护在2005年12月14日提出申请的美国临时申请第60/750,413号的利益，该申请以其全文引用的方式结合到本文中。
政府权利声明
根据美国国立过敏和传染病研究所的公共卫生服务资助项目号AI-051560，在美国政府的支持下做出本发明。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
狂犬病毒(RV)是高度嗜神经病毒，其从侵入门户迁移至中枢神经系统(CNS)。该病毒为弹状病毒(Rhabdoviridae)科中的不分段负链RNA病毒且诱导人和动物的致命性神经系统疾病。每年，据报道有超过70,000的人病死，且数以百万的其他人需要暴露后治疗。虽然已在狂犬病预防和控制方面做出了重大进展，但这种疾病仍然是公共卫生的重大威胁且在世界上继续造成许多的人类死亡。在大多数人狂犬病病例发生的亚洲、非洲和拉丁美洲，狗仍然是最重要的宿主(reservoir)。在发达国家，作为宠物常规免疫接种的直接结果，在过去的50年期间，人狂犬病已显著地减小。然而，野生动物狂犬病已发展成重大威胁。在美国，超过90％的动物狂犬病病例(每年>7000)据报道为野生动物，这意味着长期的公共卫生威胁。在过去十年中，大多数人病例与见于蝙蝠，特别是银毛蝠中的RV相关联。而且，所发生的大多数病例并无暴露史，说明银毛蝠RV(SHBRV)是高致病和神经侵染性的。
所有弹状病毒具有两个主要的结构组分螺旋核糖蛋白核心(RNP)和周围包膜。狂犬病基因组编码五种蛋白质核蛋白质(N)、磷蛋白质(P)、基质蛋白质(M)、糖蛋白(G)以及聚合酶(大蛋白)(L)。这些基因在野生型狂犬病基因组中的次序为3′-N-P-M-G-L-5′。N、L和P蛋白质与核心RNP复合物相关联。RNP复合物是由N包裹的RNA基因组连同聚合酶L和P蛋白质组成。此复合物用作病毒转录和复制的模板。RV的病毒包膜组分由跨膜糖蛋白(G)与基质(M)蛋白质组成。糖蛋白形成大约400个三聚刺突(trimeric spike)，这些三聚刺突紧密地排列于病毒表面上。M蛋白质与包膜和RNP相关联且可为弹状病毒装配体(rhabdovirus assembly)的中心蛋白质。狂犬病基因组中的基因的次序和相对大小在

图1中显示出。这些蛋白质和RNA基因组的排列决定狂犬病毒的结构。
RV通过与诸如乙酰胆碱受体、神经细胞黏附分子(NCAM)或神经生长因子受体(NTR75)这样的神经受体结合而侵入神经系统。然后，RV通过逆向运输，可能通过与细胞质动力蛋白结合，而被运输到中枢神经系统(CNS)。尽管在过去的100年中进行了大量的考察，但街(野生型，wt)RV感染导致人神经系统疾病和死亡的致病机制尚不太清楚。这是因为在狂犬病患者的CNS中存在的神经元病变或损害很少，在此基础上不足以建立相关机制(Murphy，1977，Arch.Virol.，54279-297)。炎症反应是轻度的且相对较少的神经元遭到破坏(Miyamoto等人，1967，J.Exp.Med.，125447-456，Murphy 1977，Arch.Virol.，54279-297)。另一方面，实验室减毒的RV在实验动物中诱导广泛的炎症和神经元变性(Miyamoto等人，1967，J，Exp.Med.，125447-456，Yan等人，2001，J Neurovirol 7518-527)，然而，尚不清楚减毒RV和致病RV如何诱导不同的宿主反应。
人用狂犬病疫苗用灭活RV制成且从巴斯德时代(time of Pasteur)开始经历了持续的改进，特别是人二倍体细胞培养疫苗(HDCV)的研制(Wiktor等人，1964.J.Immunol.93353-366)。由于不存在神经元组织，与之前的脑组织疫苗相比，组织培养疫苗不仅更安全，而且更有效。现在，已批准若干种组织培养疫苗，其具有与HDCV相当的疗效和安全性，例如，纯化鸡胚细胞疫苗(PCEC)((Barth等人，1984.J.Biol.Stand.1229-64；Sehgal等人，1993，J Commun Dis.2736-43)和纯化Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)(Suntharasamai等人，1986.Lancet.2129-31)。与在感染前用于防护的预防疫苗不同，RV疫苗在感染(即，在被患有狂犬病的动物或疑似患有狂犬病的动物咬伤)后治疗性地给予个体。一种用于个体的典型的暴露后治疗由给予灭活组织培养疫苗的多次注射组成。此外，还建议个体接受马(ERIG)或优选地人(HRIG)抗-RV免疫球蛋白(Anonymous 2000，MMWR 4919-30)。ERIG可造成血清病而HRIG在全世界都供应不足。虽然组织培养疫苗是安全且有效的，但它们也不是没有问题。因为这些疫苗从灭活RV制备，因此必须在延长的时间周期(90天)多剂量给药(至少5次)以刺激最佳免疫反应。未能完成疫苗系列可能会导致狂犬病的发病。大约6％的已给予加强注射的接种者出现过敏反应。而且，组织培养疫苗的高成本使得其难于在最需要这种疫苗的发展中国家有效地利用。包括疫苗和抗RV免疫球蛋白的暴露后治疗的成本估计每个病例超过3,000美元。大部分人病例发生于受害者支付不起这种治疗的发展中国家。因此，在发展中国家最频繁地使用的疫苗来源于动物源，通常由乳鼠(Fuenzelida疫苗)或绵羊脑产生，其可能会因神经元组织的污染而造成神经反应。
不常发生的情况是，被认为有着明显狂犬病暴露风险的人，诸如动物护理控制官员、兽医以及实验室人员常规地要针对狂犬病免疫，这被称作暴露前预防。宠物(狗和猫)的常规免疫接种在3个月大的时候进行且取决于所用疫苗而每年或每三年再次被接种疫苗。已批准的宠物的狂犬病疫苗也是由灭活病毒制成。近来，表达RV糖蛋白(G)的重组金丝雀痘病毒被批准用于猫。虽然这些疫苗提供足够的保护，但它们却诱导局部反应。此外，需要多次免疫来在动物的整个生命期间维持充分免疫。而且，对小于3个月大的幼犬的免疫接种未能诱导保护性免疫，但到6周大的时候，母源抗体降低到不可检测的水平。从母源抗体减弱时到主动免疫时存在一段时间，在此期间，幼龄动物可能得不到保护。
野生动物狂犬病存在于许多国家且继续造成重大公共卫生威胁。在欧洲和北美洲在过去的三十年期间控制野生动物狂犬病的努力集中在口服免疫。先前，减毒RV，Street Alabama Dufferin(SAD)B19，在欧洲使用，其导致狐狸的免疫且阻止RV扩散到未处理区域(Wandeler等人，1998.Rev.Infect.Dis.10S649-S653；Schneider等人，Rev.Infect.Dis.10S654-S659)。然而，SAD可造成啮齿动物和家养动物的疾病。之后，研制了表达RV G的重组疫苗病毒(VRG)(Kieny等人，1984.Nature.312163-166)且在实验室设置下和在该领域中发现其是浣熊和狐狸的有效口服免疫原。VRG的应用导致在欧洲的部分地区狐狸狂犬病的大规模消除。VRG在美国的类似应用导致阻断了丛林狼狂犬病在德克萨斯州的传播和浣熊狂犬病在其它州的传播。虽然VRG在接种疫苗的动物中是安全的且有效地刺激主动免疫，但涉及到疫苗诱导孕妇疾病的事件证实低估了使用这种重组疫苗的风险。当这个孕妇从她的狗的口中移除载有VRG的诱饵时被狗咬到。在10天内她出现了严重的局部炎症反应且然后出现了全身化红皮病，其在剥离后最终消退(Rupprecht等人，2001.N Engl J Med，345582-6)。这个事件对VRG作为狂犬病疫苗的未来使用产生了质疑。
基于上文所概括的简要综述，清楚地看出当前RV疫苗不仅在成本方面存在问题而且在安全性方面也存在问题。需要更有效、更安全和更多人买的起的疫苗。研制并测试了许多新疫苗，包括DNA和其它重组疫苗。发现表达RV G的DNA载体刺激体液和细胞介导免疫(Xiang等人，1994.Virology.199132-140)。而且，利用这些DNA载体的免疫防止小鼠和猴受到攻击性感染。然而，与常规疫苗相比，由DNA疫苗造成的免疫反应的诱导通常需要更长时间且免疫反应的量值(magnitude)更低(Lodmell等人，1998.Nat Med.4949-952；Osorio等人，1999.Vaccine.171109-1116)。还研制表达RV G的重组人腺病毒(Prevec等人，1990.J.Infect.Dis.16127-30；Xiang等人，1996.Virology.219220-227)。重组腺病毒疫苗诱导病毒中和抗体(VNA)且防止接种疫苗的动物(小鼠、狗、臭鼬和狐狸)受到攻击性感染。然而，担心预存的抗腺病毒免疫可能会阻止疫苗吸收，从而削弱主动免疫反应。
长期以来已知活减毒病毒疫苗更有效地诱导长期持续的细胞介导的和体液免疫，且通过使用活的修饰的病毒疫苗控制或根除了许多疾病。假设活的修饰的RV疫苗可通过利用减少的疫苗剂量提供更长的免疫持续时间而具有优于当前批准的灭活疫苗的优点。因此，免疫接种的成本可以在很大程度上降低。然而，这种修饰的活RV疫苗必须完全无毒力，特别是对于人。为此目的，最初用于野生动物免疫接种的RV的SAD株通过使用中和单克隆抗体(Mab)进行连续选择，导致精氨酸333突变为谷氨酸而进一步减毒。这些突变体中的一个突变体，SAG2，通过脑内(IC)感染途径显示出对成年啮齿动物、狐狸、猫和狗是无毒力的(Le Blois等人，1990.Vet.Microbiol.23159-166；Schumacher等人，1993.Onderstepoort J.Bet.Res.60459-462)。狗和猫的口服免疫接种已造成针对致死剂量攻击的保护。利用SAG2在使狐狸和狗免疫的现场试验展示了其安全性和免疫原性。然而，SAG2的免疫原性较低且当通过IC接种时SAG2可诱导乳鼠的疾病，提高幼龄或免疫低下的个体仍会对病毒敏感且发病的可能性。因此，这种RV需要增强的免疫原性来被研制为活的无毒疫苗。
随着反向遗传学技术的最新进展，对负链RNA病毒的病毒基因组的操纵变得可能。这种技术的应用已造成许多病毒的减毒且这些减毒病毒中的某些病毒可以被研制为活减毒疫苗。举例而言，VSV基因的重新排列和重新定位造成减弱的致病性和增强的免疫原性(Wertz等人，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.953501-3506；Flanagan等人，2000.J.Virol.747895-7902)。在RV中，在P和G上的基因突变(Mebatsion等人，2001.J Virol.7511496-502)、P的缺失(Shoji等人，2004.Virology.318295-305)和细胞色素C的添加(Faber等人，2002.J Virol.763374-81)或RV G的额外拷贝(Pulmanausahakul等人，2001.J Virol.7510800-7)已在RV基因组上进行以研制减毒RV疫苗。这些疫苗中的大部分疫苗有效地诱导保护性免疫反应。已颁发了这些修饰活减毒狂犬病毒疫苗中的某些疫苗的专利，包括Mebatsion(颁发于2005年5月3日的美国专利第6,887,479号)和Dietzschold等人(颁发于2006年7月11日的美国专利第7,074,413号)。然而，这些RV中的某些RV仍可能像SAG2一样诱导乳鼠的疾病。在我们的实验室(Wu等人，2001，J.Virol.764153-5161)，我们显示出与亲代病毒相比，在磷酸化位点N基因的突变减少复制速率90％和以10,000倍减少病毒产生。
干扰素，诸如IFN-α、β和γ，是先天性免疫系统中关键的抗病毒组分。病毒产物，特别是双链RNA，激活NF-κB、干扰素调节因子(IRF)和AP-1，造成干扰素(IFN)，特别是IFN-β的产生。IFN，通过与IFN受体结合而激活信号转导与转录激活(STAT)蛋白家族，造成抗病毒状态的诱导。IFN激活RNA-依赖性蛋白激酶(PKR)，而RNA-依赖性蛋白激酶(PKR)磷酸化真核生物翻译起始因子(eIF-2(α)，导致mRNA翻译的抑制。IFN激活2’5’-寡腺苷酸合成酶(OAS)，而2’5’-寡腺苷酸合成酶(OAS)激活RNase L，造成RNA降解。IFN上调蛋白质GTPase Mx蛋白质的表达，发挥抗病毒功能。IFN还诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和I类和II类MHC分子的表达。激活的STAT还可诱导趋化因子的表达，其可具有直接的抗病毒活性和/或将炎症细胞募集到感染位点以杀死病毒感染细胞。
趋化因子是在结构上与蛋白质相关的家族，其介导白细胞激活和/或趋化活性。多数趋化因子具有8-10kDa的分子量且在蛋白水平彼此之间显示出大约20-50％的序列同源性。趋化因子蛋白质还共享共同的基因序列和三级结构，且所有趋化因子具有参与分子内二硫键形成的多个保守的半胱氨酸残基。趋化因子可基于半胱氨酸特征基序被分成四个主要亚家族C、CC、CXC和CX3C家族。其中C1和C2半胱氨酸残基被单个氨基酸分开的趋化因子被称作CXC趋化因子且包括IL-8、IP-10、I-TAC和SDF-1。CXC趋化因子充当中性粒细胞的化学引诱物且已显示为T淋巴细胞趋化和B淋巴细胞趋化的重要介体。其中C1和C2半胱氨酸残基相邻的趋化因子被称作CC趋化因子，且包括RANTES、MCP-1、TARC和噬酸性粒细胞趋化因子。许多CC趋化因子对单核细胞和巨嗜细胞发挥其作用，但CC趋化因子已显示出对于树突状细胞趋化是重要的且某些CC趋化因子表现为优先作用于Th2-型T细胞。趋化因子通过结合到G蛋白质耦联受体而介导其作用。在结合时，趋化因子受体通过钙和cAMP的细胞内浓度变化而启动细胞信号传导。许多细胞趋化因子受体可以类似亲和力结合多于一个趋化因子。举例而言，趋化受体因子CCR1和CCR5可结合RANTES、MIP-1α和MIP-1β，而趋化因子受体CXCR1和CXCR2可结合IL-8。CNS的病毒感染可通过CNS的驻留细胞(resident cell)以及通过炎症细胞而导致若干趋化因子和趋化因子受体的时间表达(temporal expression)。胶质细胞的病毒感染在感染了麻疹病毒(Xiao等人，1998.J Neurocytol 27(8)575-580)、小鼠肝炎病毒(Lane等人，1998.J Immunol 1998；160970-978)以及人冠状病毒(Edwards等人，2000.J Neuroimmunol.108(1-2)73-81)后导致诸如CCL2、CCL3、CCL4和CCL5的许多趋化因子的稳固表达(robust expression)。大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞感染副黏病毒导致CCL5和CXCL10的mRNA转录物的快速表达(rapid expression)(Vanguri等人，1994.J Immunol152(3)1411-1418；Fisher等人，1995.Brain Behav Immun.(4)331-344)。据报道CXCL10还由感染了RV的巨噬细胞激活(Nakamichi等人，2004.J.Virol.789376-88)。趋化因子和/或趋化因子受体表达的诱导据报道通过吸引T淋巴细胞和巨噬细胞而有益于宿主，T淋巴细胞和巨噬细胞通过消除侵入病毒而参与宿主防御(Alcami.2003.Nat Rev Immunol.336-50；Chensue，2001.Clin Microbiol Rev.14821-35)。
已考察了细胞因子或趋化因子基因掺入到候选疫苗内。举例而言，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)已被用作疫苗免疫佐剂，这是因为其刺激朗格汉斯(Langerhans)和树突状细胞(DC)的能力(Witmer-Pack等人，1987.J Exp Med 1661484-1498；Romani等人，1989.J Exp Med 1691169-1178；Ahmed等人，2005，Mol Immunol.42251-8)。IFN和其它趋化因子基因已被克隆入病毒中，这种病毒导致毒力减弱和免疫反应增强(Legrand等人，2005.Proc Natl Acad Sci US A.1022940-5；Ahlers等人，2003.Curr Mol Med.3:285-301)。而且，发现表达IFN或趋化因子的质粒具有直接抗病毒活性以及改进其它DNA或载体疫苗的免疫原性(Barouch等人，2003.J Virol.778729-35；Bartlett等人，2003.543-52；Biragyn等人，2002.Blood.1001153-9)。
狂犬病在世界范围内仍是主要公共卫生威胁。控制狂犬病且防止人得狂犬病需要多层控制策略，诸如宠物和野生动物载体的常规免疫，有风险的人的暴露前免疫以及被患有狂犬病的动物咬伤后人的暴露后治疗。虽然从细胞培养所制备的灭活狂犬病毒(RV)疫苗是安全且有效的，但它们也有缺点。这些疫苗较为昂贵且因此在发展中国家需要该疫苗的大多数人买不起这种疫苗。而且，需要用灭活疫苗进行重复免疫产生保护性免疫反应。此外，这些灭活疫苗总是包括可能会造成副作用的佐剂。因此，需要更安全、更廉价且更为有效的RV疫苗。
发明概要 本发明提供一种用于治疗和预防狂犬病的疫苗的活减毒狂犬病毒。本发明的减毒狂犬病毒在哺乳动物受试者中产生炎症反应且激活先天免疫和/或抗病毒反应。其可诱导中枢神经系统(CNS)中的免疫反应且帮助从CNS中清除病毒。减毒狂犬病毒可诱导参与先天免疫和/或抗病毒反应中的宿主基因的表达，特别是与α/β干扰素(IFN-α/β)信号传导通路和炎症趋化因子有关的宿主基因的表达。干扰素调节基因中的许多基因，诸如信号转导激活转导子和干扰素调节因子，以及效应子基因，例如2′-5′-寡腺苷酸合成酶和黏病毒蛋白质，可在哺乳动物受试者中由该疫苗高度诱导。
在优选实施方案中，减毒狂犬病毒是重组病毒，其被进行基因修饰以表达一或多种免疫因子，诸如细胞因子、趋化因子和/或干扰素，以便增强减毒病毒的免疫原性。在整个申请中在多个部分，包括背景技术和实施例，在本文中描述了示范性免疫因子，且应了解这些示范性免疫因子中的任一个免疫因子可由本发明的减毒狂犬病毒来表达。如上文所述，趋化因子可(例如)包括C、CC、CXC和CX3C型趋化因子中的任一个趋化因子。可被引入至减毒狂犬病毒内的优选转基因的实例包括，但不限于，多核苷酸，其可操作地编码诸如IFN-α2、IFN-α4、IFN-α5、IFN-β和IFN-γ的干扰素和诸如MIP-1α、MIP-1β、MCP、RANTES和IP-10的趋化因子。在某些实施方案中，减毒狂犬病毒还表达Toll样受体(TLR)和/或TLR衔接头分子，诸如TRIF或Myd88。通过在RV构建体中克隆和表达免疫因子而制备无毒疫苗。通过组合一或多种免疫因子的减毒和表达，可以产生无毒力的RV疫苗，其刺激先天免疫反应并提高获得性免疫反应，诸如产生中和抗体。我们已证明减毒RV在脊髓中诱导宿主先天免疫反应(例如，趋化因子和IFN)，其阻断病毒扩散到脑内(例如，实施例II、IV)。因此，表达IFN或趋化因子的重组RV不应仅能够防止RV扩散而且还增强获得性免疫反应，这在将RV免疫接种用于暴露后治疗中是非常需要的。
本发明的疫苗可在暴露于狂犬病毒前预防性地给药，或者，其可在暴露于病毒后作为治疗给药。如果在暴露于狂犬病毒后给药，那么优选地在暴露后在出现症状前尽可能快地给药。该疫苗还可在出现症状后给药。
因此，本发明提供一种减毒狂犬病毒，其包括可操作地编码至少一种哺乳动物免疫因子的多核苷酸。任选地，多核苷酸可操作地编码多种哺乳动物免疫因子。优选免疫因子包括干扰素(诸如IFN-α、IFN-β或IFN-γ)、细胞因子、趋化因子(诸如MIP-1α、MIP-1β、MCP、RANTES或IP-10)、Toll样受体(TLR)或TLR衔接头分子。
本发明还提供一种包括减毒狂犬病毒和药学上可接受的载体的药用组合物，以及一种向哺乳动物受试者接种疫苗的方法，该方法涉及向哺乳动物受试者给予本发明的药用组合物。该药用组合物适用作哺乳动物受试者进行免疫接种防止狂犬病的活疫苗。受试者优选地为人，但也可以是家养动物或野生动物。该药用组合物在暴露于致病狂犬病毒前或暴露后给药。优选地，在向哺乳动物宿主给药后，药用组合物诱导宿主中的免疫反应，该免疫反应阻断或抑制致病狂犬病毒在宿主的中枢神经系统内的扩散。包括于药用组合物中的减毒狂犬病毒的量优选地有效地诱导受试者中的中和抗体和/或防止受试者受到致病狂犬病毒的实验攻击或自然攻击。
除非另外规定，“一”、“一个”、“该”以及“至少一个”可以互换地使用且可表示一个或多于一个。
附图简述 图1显示出狂犬病毒基因组。
图2显示出与B2C相比，SHBRV的致病性更强且诱导更少的炎症。B2C和SHBRV的致病指数通过以下方法确定从log ICLD50/ml或log IMLD50/ml减去BHK细胞中的Log病毒滴度/ml(A)。在感染了B2C或SHBRV的石蜡切片中观察皮质(IC)或丘脑(IM)中的病理变化(B)。使用抗CD3抗体制做海马切片用于免疫组织化学检测以量化CD-3阳性细胞(C)。对照；假感染的对照小鼠脑，B2C，B2C感染的小鼠脑，SHBSHBRV-感染的小鼠脑(*P<0.05SHB对比(vs.)对照，**P<0.01 B2C对比(vs.)SHB且p<0.001 B2C对比(vs.)对照)。
图3显示出宿主基因的表达模式。通过基因本体论来执行宿主基因表达的层序聚类分析(Hierarchical cluster analysis)。这些结果被过滤以仅保留那些参与免疫和抗病毒、凋亡、神经元特异性和转录因子的基因。空白条上调，加阴影的条下调。
图4显示出在RV感染后在小鼠脑或初级神经元细胞培养物中的STAT蛋白质的表达。通过蛋白质印迹(Western blotting)在通过IC或IM途径感染的小鼠的脑组织以及初级神经元中检测STAT(1、2和3)蛋白质。作为加载对照(loading control)，在蛋白质印迹中使用抗β-微管蛋白(抗T)抗体在相同的样品制剂中检测β-微管蛋白。通过密度测定法将对照的结果作为100％来测定蛋白带强度。
图5显示出在RV感染后在初级神经元中的STAT蛋白质的核转位。初级神经元被以0.1ffu/细胞来感染这些病毒中的每种病毒且然后在感染后第5天被固定。通过使用FITC缀合的抗RV N单克隆抗体来检测病毒抗原(N)。通过使用兔抗STAT多克隆Abs和与Alexa488缀合的抗兔第二抗体来检测STAT1、STAT2和STAT3的表达。使用碘化丙锭(PI)来进行复染。在Leica TCS NT共聚焦显微镜下检查细胞(A)。对于STAT蛋白质中的每一个，量化核转位的细胞的百分比(B)。对于感染了B2C的细胞中的STAT1(p<0.001)和STAT2(p<0.001)，和对于感染了SHBRV的细胞中的STAT2(p<0.01)，观察到显著更多的核转位细胞。
图6显示出在RV感染后在小鼠脑或在初级神经元培养物中RV蛋白质的表达。在小鼠脑切片(A)中通过免疫组织化学检测或在通过IC或IM途径感染的小鼠的脑组织以及初级神经元(B)中通过蛋白质印迹来检测RV蛋白质(N和G)。作为加载对照，在蛋白质印迹中使用抗-β-微管蛋白(抗T)抗体在相同的样品制剂中检测微管蛋白。在测量带密度后确定G与N之间的比例。
图7显示出对IFN处理的RV敏感性。在细胞被感染1ffu的B2C或SHBRV之前24小时用IFN-α来处理NA细胞。在48小时培育后，收获上清液用于在NA细胞中进行病毒滴定。
图8显示出减毒RV诱导了比有毒RV更多的炎症。制做皮质切片用于免疫组织化学检测，以使用抗CD3抗体量化CD-3阳性细胞(*P<0.05 SHB对比(vs.)对照，**P<0.01 L/16/B2C对比(vs.)SHB和P<0.001 L16/B2C对比(vs.)对照)。
图9显示出在感染了不同RV的小鼠中凋亡、病理变化以及病毒抗原的检测。小鼠被感染了10ICLD50的每种病毒且收获脑用于组织病理学检测(HISTO)和使用TUNEL测定检测凋亡(TUNEL，箭头表明TUNEL-阳性细胞)。如在本文中所述，使用抗G和抗N抗体来检测病毒抗原(RV-N和RV-G)。(放大40倍)。
图10显示出凋亡诱导与致病性之间的逆相关。使用SigmaPlot相对于在感染了不同RV的小鼠中所观察到的凋亡细胞的数目来绘制致病指数。垂直条表示标准偏差。
图11显示出在初级神经元中由RV造成的凋亡诱导。初级神经元被感染了这些病毒中的每种病毒且使用TUNEL测定来检测凋亡。在p<0.05的水平使用单因素ANOVA(one way ANOVA)来测定和分析凋亡神经元的数目。
图12显示出感染了不同剂量的不同RV的小鼠的存活率。小鼠(每组10个)被感染了不同剂量的SHBRV或B2C且持续20天每天记录狂犬病的发病。感染后12天后没有动物死亡。
图13显示出脊髓中凋亡诱导。感染后第7天取自通过IM途径感染了B2C(A)或SHBRV(B)的小鼠的脊髓组织被固定以使用TUNEL测定来检测凋亡(放大40倍)。放入取自假感染的小鼠的脊髓作为对照(C)。在感染后第7天对感染了B2C的小鼠的脊髓中所检测的病毒抗原和凋亡执行双标记(D)。用箭头显示出病毒抗原和TUNEL阳性神经元(放大100倍)。取自用甲酚紫染色的B2C感染的小鼠的脊髓的腹角显示出核染色质的凝缩(condensation)与噬神经现象(neurophagia)(箭头)(E，放大100倍)。
图14显示出表达小鼠MIP-1α的重组狂犬病毒的构建(HEP-MIP1α)。应注意的是MIP-1α克隆于亲代狂犬病毒(rHEP)的G基因与L基因之间。
图15显示出亲代病毒(rHEP)与重组病毒(HEP-MIP1 α、HEP-RANTES、HEP-IP10和HEP-IFN β))的生长曲线。
图16显示出在模拟感染细胞或以不同剂量感染了亲代病毒(rHEP)或表达MIP-1α的重组病毒(HEP-MIP1 α)的细胞中的MIP-1α的检测。MIP-1α仅在感染了重组病毒的细胞中检测到。
图17显示出被设计成表达IFN或趋化因子的重组RV。
图18显示出被设计成带有N突变(V)、N与G突变(VI)和G重新定位(VII)的重组RV。
发明详述 本发明提供一种用作治疗和/或预防狂犬病的活疫苗的药用组合物，以及制做和使用活疫苗的方法。本发明的狂犬病疫苗包括活减毒狂犬病毒(RV)。令人惊奇地，本发明的减毒狂犬病毒激活，而致病狂犬病毒逃避，宿主中的先天免疫和抗病毒反应。
在特别优选的实施方案中，减毒RV经基因改造以含有表达哺乳动物免疫因子的一或多个转基因。免疫因子是刺激或增强宿主免疫反应的分子。由减毒RV所表达的免疫因子可类似于或等同于在宿主生物中自然地产生的免疫因子。免疫因子的实例包括细胞因子、趋化因子、干扰素(IFN)、Toll样受体(TLR)和TLR衔接头分子(例如，TRIF、Myd88)。
表达一或多种免疫因子的减毒RV和重组减毒RV适用作具有增强疗效的活的且无毒力的RV疫苗。具有增强免疫原性的本发明的无毒力的RV疫苗可用于预防或治疗。预期这些构建体不仅增强获得性免疫反应，而且也诱导先天免疫反应，其可阻断有毒RV从脊髓扩散至脑，这在暴露后治疗中很重要。这种诱导的先天免疫反应因此可减弱狂犬病毒的毒力且可增强宿主的获得性免疫(产生中和抗体)，从而增强免疫原性。由于由表达一或多种免疫因子的减毒病毒所诱导的宿主的免疫反应，本发明的疫苗提供比其它减毒狂犬病毒疫苗更好的保护。
本发明还涉及减毒狂犬病毒，以及制做和使用减毒狂犬病毒的方法。优选的减毒狂犬病毒是那些含有一或多个转基因的病毒，这些转基因表达哺乳动物免疫因子，诸如细胞因子、趋化因子和/或干扰素。
术语“减毒狂犬病毒”是指经过基因修饰以减弱其在诸如哺乳动物那样的温血动物中的致病性的狂犬病毒。一般而言，与野生型RV相比，减毒RV展示出减弱的在中枢神经系统(CNS)中扩散的能力。虽然RV减毒的特征为减弱的神经侵染性，但一般不减弱病毒转录和复制。
用于产生减毒RV的狂犬病毒的基因修饰通常使用标准重组技术达成，这些标准重组技术包括反向遗传学技术、定点突变、基因改组等，如在下文的实施例中所例示。
狂犬病毒的致病性与其侵入到中枢神经系统并且造成神经系统疾病和死亡的能力相关。可以许多方式中的任一种方式来观察、确定或测量狂犬病毒的致病性的减弱，诸如通过检测重量减轻、诸如皮毛折皱(ruffed fur)和麻痹的发病率的减少，以及死亡率的减小。一般而言，通过向哺乳动物宿主(例如，成年小鼠或乳鼠群体)给予减毒狂犬病毒并且观察在哺乳动物宿主群体中所造成的发病率或死亡率来评价致病性。一般可通过肌内、颅内、或脑内向小鼠接种来比较突变狂犬病毒的致病性和亲代病毒的致病性。优选的减毒病毒并不诱导成年动物的疾病且优选地在脑内接种后并不诱导新生动物的任何疾病。
减毒狂犬病毒可(例如)在组成型病毒蛋白质中的一个或多个蛋白质(特别是G蛋白质、N蛋白质和/或P蛋白质)上发生突变。在G蛋白质的位置333(R333/K333)的精氨酸(R)或赖氨酸(K)残基已显示出与RV致病性相关联(D333或E333的致病性非常低)(Dietzschold等人，1983，Proc Natl Acad Sci U S A.8070-4；Coulon等人，J Gen Virol.1983，64693-6)。在WO00/32755和Morimoto等人(2001，Vaccine193543-51)中描述了稳定的减毒RV突变体，其用其它氨基酸取代在G蛋白质的位置333的Arg。在糖蛋白中具有除了R333或L333之外氨基酸的狂犬病毒对有免疫活性的成年小鼠是不致病的。然而，当它们接种到幼年小鼠内时仍可能是致病的，展示出对免疫低下的动物和人存在残留的致病性和潜在风险。
在P蛋白质的LC8结合域中的突变也展示出减弱致病性，特别是在其与P蛋白质的R333处的突变一起发生的时候。狂犬病毒的P蛋白质与宿主的LC8受体蛋白质之间的相互作用似乎参与RV从周围神经系统到中枢神经系统的逆向运输和因此RV的发病机制。Mebatsion(J.Virol.，2001，7511496-11502)发现当向具有带不同于R333的氨基酸的P蛋白质的狂犬病毒中的G蛋白质的LC8结合位点引入缺失时，在外周接种(peripheral inoculation)后观察到对1天至2日龄的乳鼠的致病性的显著降低。发现在Mebastion中所描述的SAD-D29衍生的缺失突变体在肌肉内接种后差不多以30倍被减毒，但当直接向脑内接种时仍展示出与亲代病毒相同的致病性，说明消除P-LC8相互作用减小更大程度上减毒的SAD-D29林的外周扩散的效率。
实施例II显示出在G基因和N基因中突变的构建，突变导致神经侵染性以及病毒复制的减弱。而且，我们发现减毒RV在体内和体外表达比wt RV至少三倍多的G，而N蛋白质的表达类似。预期并不受理论限制，认为wt RV通过减少G表达的水平而逃避宿主的先天免疫；因此，表达高水平G的减毒RV特别地适用于本发明的狂犬病疫苗。
优选的减毒病毒在两个或两个以上狂犬病蛋白质中含有突变(即，缺失、插入、取代或重新排列)。其它优选的减毒病毒描述于Schneider(颁发于1988年6月21日的美国专利第4,752,474号)、Mebatsion(颁发于2005年5月3日的美国专利第6,887,479号)和Dietzschold等人(颁发于2006年7月11日的美国专利第7,074,413号)中。
在某些减毒狂犬病毒中，使狂犬病毒不致病的抗原决定簇可与负责引起有效抗狂犬病免疫反应的决定簇组合。参看Dietzschold等人(颁发于2006年7月11日的美国专利第7,074,413号)。此外或替代地，减毒狂犬病毒可具有下面这样的基因组与编码狂犬病毒蛋白质的基因在野生型病毒中的次序相比较，在该基因组中编码狂犬病毒蛋白质的基因以不同的次序存在。减毒狂犬病毒亦可展示出狂犬病基因组中的缺失或插入和/或可表达一或多个转基因，如本文所例示。
本发明的减毒狂犬病毒当用作狂犬病毒疫苗的组分时，并不限于本文所述的任何特定减毒RV，而是可包括任何减毒狂犬病毒。可用于本发明的疫苗的减毒RV的实例包括基于SAD(例如，L16、B19、Berne、D29)、SAG(1和2)、Flury LEP(低鸡胚传代疫苗(low eggpassage))、Flury HEP(高鸡胚传代疫苗(high egg passage))、CVS(例如，AV01，11，27)、ERA、RC-HL以及AG的减毒病毒以及其它的减毒病毒(参看，例如，Clark等人，1972.狂犬病毒，第177-182页.In M.Majerand S.A.Plotkin(ed.)，人病毒株.S.Karger，Basel)。SAD-L16(L16)、SAD-D29(D29)和其突变体描述于Mebatsion，Journal of Virology，2001，7511496-11502中；SAD-B19描述于Conzelmann等人，Virol，1990 175485-99)中；且SAG-2描述于Schumacher等人，OnderstepoortJ Vet Res.1993 Dec；60(4)459-62)中。CVS-B2C是通过在BHK细胞中传代从CVS-24病毒分离的实验室驯化(adapted)的减毒病毒(Morimoto等人，2000，J Neurovirol.6373-81)。株L16-G(实质上为SAG-2；二者皆在G上具有R333E突变)、L16N、L16Q、L-16Q-G、HEP和其它株描述于下文的实施例中。特别优选的减毒狂犬病毒为那些在展示较小或不展示致病性的同时仍能够在细胞培养中像亲林那样有效地繁殖的病毒。
在尤其适用于活疫苗制剂的优选实施方案中，减毒狂犬病毒被进行基因修饰来表达一或多种细胞因子、趋化因子和/或干扰素以便增强减毒病毒的免疫原性。可引入至减毒狂犬病毒内的转基因的实例包括但不限于多核苷酸，其可操作地编码干扰素，诸如IFN-α(例如，IFN-α2和IFN-α5)、IFN-β和IFN-γ；趋化因子，诸如MIP-1α、1α、MIP-1β、MCP、RANTES和IP-10；细胞因子，诸如白细胞介素-12(IL-12)、粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)以及肿瘤坏死因子(TNF)；Toll样受体(TLR1-9)和衔接头分子(TRIF、Myd88等)。在一个实施方案中，减毒的RV表达一或多种干扰素，但并不表达细胞因子或趋化因子。在另一实施方案中，减毒的RV表达细胞因子和/或趋化因子，但并不表达干扰素。在又一实施方案中，减毒的RV表达至少一种干扰素和至少一种细胞因子或趋化因子。IFN和/或特定趋化因子预期在RV免疫接种中诱导先天免疫反应且增强获得性免疫反应。还预期IFN和/或趋化因子表达将具有抗病毒功能且向CNS内募集适当免疫细胞以清除RV感染的细胞。如果RV进入被接种了本发明的活减毒狂犬病疫苗的受试者的周围神经系统(PNS)，那么预期病毒将在其进入CNS之前被杀死。这些预期是基于以下观察减毒的RV激活包括上调IFN和趋化因子表达的先天免疫反应。相比之下，发现野生型(wt)RV逃避先天免疫反应。例如，参看实施例II。
在某些实施方案中，减毒的狂犬病毒被进一步进行基因修饰以表达Toll样受体(TLR)或TLR衔接头分子，诸如TRIF或MyD88。诱导IFN-β的含TIR域的衔接头(TRIF)，还被称作含有TIR的衔接头分子(EICAM)-1，是参与某些TLR的不依赖MyD88的信号传导通路的衔接头。髓样分化因子88(MyD88)是参与NF-κB的IL-1受体(IL-1R)和TLR诱导激活的细胞质衔接头蛋白质。TRIF的表达增强宿主中的细胞免疫反应，诸如T细胞反应，而MyD88增强宿主的抗原特异性体液反应，诸如抗体产生。衔接头分子的表达在重组RV构建体中是特别有利的，其另外以减少的抗原为特征。诱导先天免疫但特征为减少的病毒复制的构建体可导致更低的抗原质量，特别是那些表达IFN的构建体，因为IFN具有直接的抗病毒活性。另一方面，对于表达趋化因子的那些构建体，预期抗原质量不会减少，因为趋化因子需要时间诱导炎症反应。病毒感染细胞的吞噬将有帮助而不是损害抗原呈递，从而增加获得性免疫反应。
本发明的疫苗在哺乳动物受试者中产生炎症反应。其还诱导参与先天免疫和抗病毒反应的宿主基因的表达，特别是那些与α/β干扰素(IFN-α/β)信号传导通路和炎症趋化因子有关的宿主基因的表达。干扰素调节基因中的许多基因，诸如信号转导激活转导子和干扰素调节因子，以及效应子基因，例如2′-5′-寡腺苷酸合成酶和黏病毒蛋白质，在哺乳动物受试者中由疫苗高度诱导。
即使不包括表达哺乳动物免疫因子的转基因，减毒的RV激活被感染的受试者的先天免疫反应，包括IFN-α/β和趋化因子的表达(实施例II)。因此，先天免疫反应的诱导似乎通过防止RV从脊髓扩散到脑而在RV减毒中起到重要作用。已知IFN-α/β和趋化因子还增强获得性免疫反应。因此，表达一或多种IFN-α/β和/或趋化因子的本发明的减毒狂犬病毒预期还进一步使RV减毒以及诱导先天免疫反应且增强获得性免疫反应。因此，预期本发明的狂犬病毒疫苗不仅在受试者中诱导强先天性免疫反应而且还可增强获得性免疫反应，诸如产生中和抗体。中和抗体与狂犬病毒起反应且破坏或者抑制其感染性和毒力。中和抗体的存在可(例如)使用免疫组织化学技术直接检测或通过混合血清与病毒的悬浮液，且然后将该混合物注射到对相关病毒敏感的动物或细胞培养物内来证明。疫苗优选地含有有效地诱导受试者中的中和抗体的一定量的减毒的狂犬病毒。在疫苗中减毒狂犬病毒的量优选地有效地防止受试者免于狂犬病毒的实验攻击或自然攻击。该疫苗可诱导中枢神经系统(CNS)中的免疫反应且帮助从CNS中清除病毒。
本发明的狂犬病疫苗易于配制成兽医、野生动物管理者或人使用的药用组合物。该药用组合物任选地包括药学上可接受的作为载体的且与减毒的狂犬病毒相容的赋形剂或稀释剂。术语“药学上可接受的载体”是指在与组合物的其它成份相容的意义上“可接受”且并不对其接受者或活减毒病毒有害的载体。合适的赋形剂包括例如，水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等和其组合。此外，若需要，疫苗可包含微量的助剂，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、盐和/或佐剂，其增强免疫-刺激组合物的有效性。对于口服，疫苗可与蛋白质或者植物来源或动物来源的油混合且当给予野生动物时可呈现为诱饵的形式。制做和使用该药用组合物的方法亦可包括于本发明中。
本发明的疫苗可给予任何哺乳动物，包括人、家养动物(例如，猫和狗)以及野生动物(例如，流浪狗、狐狸、浣熊和臭鼬)。
本发明的狂犬病疫苗的免疫接种等的剂量、时间表可由本领域技术人员容易地确定。举例而言，Mebastion(美国专利第6,887,479号)描述了活减毒狂犬病疫苗向温血动物的给药。本发明的疫苗可以任何适宜方法向哺乳动物给药，优选地肠外(例如，经由肌内、皮内、皮下活颅内注射)或者经由口服或鼻腔给药。给药的适用剂量将取决于进行接种疫苗的哺乳动物种类、其年龄和重量、减毒病毒的免疫原性和给药方式而不同。一般而言，对于每只哺乳动物，合适的剂量将在102至108TCID50之间变化。TCID50是50％组织培养感染剂量。
本发明的疫苗可在暴露于狂犬病毒前在预防上给药，或者其可在暴露于病毒后作为治疗给药。疫苗向感染的受试者的治疗给药有效地延迟或防止狂犬病毒进入到受试者的中枢神经系统或脑内，和/或杀死受试者中的狂犬病毒或含狂犬病毒的细胞，或者用其它方式使狂犬病毒或含有狂犬病毒的细胞无效。如果在暴露于狂犬病毒后给药，优选地在暴露后在出现症状前尽可能快地给药。疫苗亦可在出现症状后给药。疫苗可用于已暴露于狂犬病毒但是尚未给予抗狂犬病毒免疫球蛋白的人。疫苗向未感染的受试者的预防给药有效地减少与狂犬病毒的随后感染相关联的发病率和死亡率中之一种情况或两种情况。
本发明通过以下实施例进行说明。应了解特定实施例、材料、量和程序应根据如下文所陈述的本发明的范畴和精神来广泛地理解。
实施例 实施例1 突变的狂犬病毒 在磷酸化位点的N的突变减小RV转录和复制速率，从而导致进一步减毒 RV N在病毒转录和调节的调节方面起到重要作用，且RV N在位置389在丝氨酸上磷酸化。我们的研究证明，在磷酸化位点的N突变抑制微型基因组转录和复制速率(Yang等人，1999，J.Virol.731661-1664)。为了判断同样的突变是否能够减小全感染性病毒中的病毒复制的速率，使全感染性克隆L16上的N的S389A、S389D和S389E突变(Wu等人，J.Virol.2002，764153-4161)。发现从S突变为A和S突变为D导致病毒转录和复制的减少。与RV探针的Northern印迹(Northern blot)杂交揭示出病毒转录(mRNA)和复制(基因组RNA)的速率减少了几乎90％，特别是在S突变为A时。生长曲线研究表明S突变为A的突变病毒(L16A)的产生小于亲代病毒的产生的几乎10,000倍。这些研究表明在磷酸化位点N突变可减小在全感染性病毒中病毒转录和复制的速率。Fu，2004年3月16日颁发的美国专利第6,706,523号。
为了判断重组RV是否比亲代病毒进一步减毒，我们通过IC以剂量103、104或105ffu向成年小鼠接种L16A或L16。感染了亲代病毒L16的小鼠都在第10天死于狂犬病。以剂量103和104ffu感染了L16A的小鼠中无一生病。然而，以105ffu感染了L16A的小鼠中的50％得了狂犬病。这些研究表明在磷酸化位点N的突变进一步使RV减毒。为了判断重组RV是否稳定，L16A在BSR细胞中传代20代，每5代从感染细胞制备总RNA进行RT-PCR和测序，在BSR细胞中在20代期间并未检测到逆转。还从死于L16A感染的小鼠的脑制备总RNA。RT-PCR和序列分析表明取自患病动物的重组病毒在突变位点逆转为亲代病毒。这个研究表明带S389A的突变病毒几乎是无毒力的。然而，其在体内在压力下逆转。这是因为当S(TCT)突变为A(GCT)时仅一个核苷酸改变。
构建双突变病毒 为了减小逆转的可能性，使在389的S突变为甘氨酸(G，GGT)、天冬氨酸(N，ATT)和谷氨酰胺(Q，TTG)。最初我们使用CAT测定来测试这些突变对RV微型基因组中病毒复制的作用。发现与从S分别突变为A、D或E相比，从S突变为G、N或Q更强地导致病毒复制的减少。而且，从S突变为G、N和Q导致至少两种核苷酸的变化，从而使得病毒不太可能逆转。为了判断在全感染性病毒中从S突变为G、N和Q是否导致更强的RV减毒，将在389的S分别突变为G、N、Q。这些全感染性克隆分别被命名为pL16G、pL16N和pL16Q。
构建在N和G上突变的RV的全感染性克隆 先前的研究显示出在R333的G突变通过减小其神经侵染性而导致减毒(Flamand等人“Avirulent mutants of RV and their use as livevaccine(RV无毒力突变体和其作为活疫苗的用途)”Trends.Microbiol.1993；1317-320；Lafay等人“Vaccination against rabiesconstruction and characterization of SAG-2，a double avirulent derivativeof SAD Bern(针对狂犬病的免疫接种SAG-2的构建和表征，SADBern的双无毒力衍生物).”Vaccine1994；12317-320)。我们假设在N(S389)和G(R333)的突变将不仅减小神经侵染性，而且还减小病毒复制的速率。为了构建具有双突变的RV，使用pL16、pL16G、pL16N和pL16Q作为模板。为了将R333突变结合到感染性克隆的每一个内，我们亚克隆了含有G的R333的XhoI片段且使用引物(5’ATGCTCACTACAAGTAAACTTGGAATCAG3’与5’GGAGGATCTCATTCCAAGTTTCACTTGTAG3’；分别为SEQ IDNO1和SEQ ID NO2)将R(AGA)突变为谷氨酸(E，GAA)。这种R到E的突变显示出使RV无毒力(Seif等人“Rabies virulenceeffect onvirulence and sequence characterization of RV mutations affectingantigenic site III of the glycoprotein(狂犬病毒力；对毒力的作用和影响糖蛋白的抗原位点III的RV突变的序列特征)”J.Virol.1985；53926-934.)。而且，两个核苷酸改变，从而减小病毒逆转的可能性。突变的XhoI片段然后被克隆返回到各自质粒，形成感染性克隆pL16-G、pL16G-G、pL16N-G和pL16Q-G。
通过重新定位G基因来构建重组RV 由于我们已显示出在磷酸化位点的N突变减小了复制速率，因此这些突变的RV可能具有减弱的免疫原性，虽然它们是无毒力的。为了增加这些无毒力病毒的免疫原性，我们提出将G从第4位置重新定位到第1位置。RV G是刺激提供保护的VNA产生的唯一表面G，如同负链和不分段RNA病毒中的许多病毒，RV转录在基因接合(genejunction)的每一处减毒。因此，G从第4位置重新定位到第1位置将增加G表达。
为了将RV G从第4位置重新定位到第1位置，用XhoI消化质粒pL16-G。由于在VSV上G从第4位置重新定位到第1位置仍在造成小鼠和猪的疾病，因此我们在感染性克隆L16-G(无毒力，基本上为SAG2)上重新定位G。大片段(10.5kb)经自连接以形成质粒pL16ΔXhoI，其含有N、P、M和部分G和L基因。小片段(4.5kb，RV基因组的854-8273)在XhoI位点克隆到pGEM-3Z载体内且被命名为pGEM-XhoI。质粒pL16ΔXho被用作PCR的模板以使用PfuTurboHotstart DNA聚合酶(Stratagene)和引物(5’AACATCCCTCAAAAGACTCAAGG3’和5’ACATTTTTGCTTTGCAATTGACAATGTC3’；分别为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)来删除N、P和M基因。PfuTurbo Hotstart DNA聚合酶形成可自连接的扩增片段中的平端。连接的质粒在突变接合处测序且在G基因的前导序列和启动序列中无假性变化(spurious change)。所得质粒被设计为pSAD-GL。为了在G与L之间插入N-P-M基因，在紧接着G+ψ的基因间序列之后，在G基因与L基因之间创建独特的Hpal位点。这种突变被引入到质粒pGEM-XhoI上的基因内，因为这种质粒含有在G与L之间的基因间序列。使用引物(5’CAGAAGAACAACTGTTAACACTTCTC3’和5’GAGAAGTGTTAACAGTTGTTGTTCTTCTG3’；分别为SEQ IDNO5和SEQ ID NO6)执行定点突变来插入HpaI位点。突变质粒被命名为pGEM-GHL且用于使用引物(5’AACACCCCTACAATGGATGCCG3’和5’AATAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG3’；分别为SEQ ID NO7和SEQ ID NO8)来插入从pL16ΔXhoI扩增的N-P-M序列。在确认方向后，质粒被命名为pGEM-GNMPL。最后，取自pGEM-GNMPL的XhoI片段被克隆到pSAD-GL内以创建G基因被重新定位到第1位置的全长RV克隆。这种质粒被命名为pG1N2。选择这些重组RV(L16-G、L16N、L16Q和L16Q-G))中的某些重组RV。L16-G实质上为SAG2。两种病毒均来源于SAD-B19且具有在G上的R333E突变。唯一的不同在于L16-G是由感染性克隆制成而SAG2用中和抗体选择。
确定细胞酪蛋白激酶II((CK-II)为磷酸化RV N的激酶 由于我们已经证明在磷酸化位点N突变导致RV复制和RV减毒的减少，因此我们确定磷酸化RV N的激酶。仅在哺乳动物和昆虫细胞中表达的N被磷酸化，说明其为磷酸化RV N的细胞激酶。由于在RV N的389(SDDE)的磷酸化位点类似CK-II基序(SXXD/E)，因此CK-II可能磷酸化RV N。为了检验这种假设，我们在大肠杆菌中表达N且通过金属亲和层析来将其纯化。通过BHK细胞提取物和通过纯化的CK-II来磷酸化重组N。此外，在体外重组N的磷酸化可被CK-II抑制剂、肝素阻断。而且，在病毒感染的细胞中的N磷酸化可被CK-II特异性抑制剂，5，6-二氯-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑抑制。然而，PKC并不在体外磷酸化重组N；且星孢菌素、PKC和其它激酶抑制剂也不阻止在病毒感染细胞中N磷酸化。因此，我们的数据证明细胞CK-II磷酸化RV N(Wu等人，Biochem.Biophysic.Res.Comm.，2003，304333-338)。
在RNA包裹后发生N磷酸化 为了理解N磷酸化减少病毒转录和复制的机制，我们考察了RVN在病毒感染性循环的哪一阶段被磷酸化。由于N磷酸化参与N-P与N-RNA相互作用，因此当N单独地表达时、N与P共同表达时或当N与P以及微型基因组RNA共同表达时确定N磷酸化的模式。我们发现RV N仅当在其结合到RNA时磷酸化。当N与P共同表达且不存在基因组RNA时，在N-P复合物中的N并不被磷酸化。因此我们的结果表明N磷酸化在RNA包裹过程本身中并不起作用。而是N的带负电荷的磷酸丝氨酸和带负电荷的基因组RNA可减弱RNP复合物中N与RNA之间的相互作用，从而便于下一轮病毒RNA转录与复制的启动(Liu等人，2004，J.Gen.Virol.853725-3734)。
实施例II 在CNS中，减毒狂犬病毒激活，而致病狂犬病毒逃避，宿主先天免疫反应。
狂犬病毒(RV)诱导人和动物的脑脊髓炎。然而，狂犬病的致病机制尚未完全明了。为了考察宿主对RV感染的反应，我们使用小鼠基因组阵列来研究并且比较感染了野生型(wt)病毒SHBRV或实验室驯化的病毒B2C的小鼠的脑中的病理变化，尤其是炎症反应和基因表达谱。使用寡核苷酸微阵列(Affymetrix小鼠表达组(MouseExpression Set)MOE430A)和实时PCR来确定感染了致病SHBRV或减毒B2C的小鼠的CNS中差异表达的候选基因。
在感染了减毒RV的动物中观察到广泛的炎症反应，但在感染了wt RV的小鼠中发现了很少或未发现炎症反应。而且，减毒RV诱导参与先天免疫和抗病毒反应的基因的表达，特别是与IFN-α/β信号传导通路和炎症趋化因子有关的基因的表达。对于IFN-α/β信号传导通路，干扰素调节基因中的许多基因，诸如信号转导激活转导子(STAT)、干扰素调节因子(IRF)以及效应子基因，例如2’-5’寡腺苷酸合成酶(OAS)和黏病毒蛋白质(Mx)，在感染了减毒RV的小鼠中被高度诱导。然而，这些基因中的许多基因在感染了wt SHBRV的小鼠中并未上调。通过微阵列分析所获得的数据利用实时PCR来确认。这些数据一起说明了减毒RV激活，而致病RV逃避，宿主先天免疫和抗病毒反应。发现减毒RV为宿主先天性免疫系统，特别是IFN-α/β信号传导通路和炎症反应的强效激活子，而致病SHBRV是先天免疫反应的较差的诱导剂。因此，先天免疫反应的逃避可能是wt SHBRV造成其致病性和神经侵染性的机制中的一种机制。Wang等人，2005，J.Virol.7912554-12565。
材料和方法 动物、病毒和抗体年龄为4-6周的雌性ICR小鼠(Harlan)置于，College of Veterinary Medicine，University of Georgia，动物设施中温控和光控的小区(quarter)中。它们能够随意获取食物和水。选择两种RV株进行这个研究。一种是SHBRV，一种从人患者分离的wt RV(Morimoto等人，1996，Proc Natl Acad Sci USA，935653-8)，且另一种是CVS-B2C，一种通过在BHK细胞中传代从CVS-24病毒分离的实验室驯化的减毒病毒(Morimoto等人，2000，J Neurovirol.6373-81)。如(Tuffereau等人，1998.EMBO J.177250-9)所述制备病毒悬液。
简言之，一日龄的乳鼠通过脑内(IC)途径被感染10μl的病毒样品。当垂死时，小鼠被设施安乐死且移除脑。通过在达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)中使脑均质化来制备10％(w/v)的悬浮液。匀浆被离心以移除碎片且收集上清液并且在-80℃储存。抗RV核蛋白质(N)单克隆抗体802-2从CharlesRupprecht博士(Center for Disease Control and Prevention(疾病控制预防中心))处获得。如(Faber等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci，U S A，10116328-32)所述在兔中制备抗RV糖蛋白(G)多克隆抗体，并且已显示出具有与取自wt SHBRV和实验室驯化的CVS-N2C(Yan等人，2001，J Neurovirol 7518-527)类似的亲和力。从Chemicon InternationalInc.获得抗STAT1、STAT2和STAT3的抗体。从Abcam，England购买到抗-CD3多克隆抗体。
小鼠初级神经元培养物(Mouse primary neuronal culture)使用如(Adamec等人，2001，Brain Res.Protocol 7193-202；Kiecolt-Glaser等人，2003，Proc Natl Acad Sci U S A 1009090-5)所述的标准化程序来制备小鼠初级神经元培养物。对妊娠16天的Swiss-Webster小鼠实施安乐死且移除胚胎。自这些胚胎收集新皮质并且用胰蛋白酶进行消化。然后将分离的神经元细胞接种到用聚-D-赖氨酸(50μg/ml)处理的培养孔内。初级神经元生长于在37℃下5％ CO2-95％空气的加湿气氛下的MEM培养基中。在接种后3至5天后添加1μM最终浓度的阿糖胞苷(胞嘧啶呋喃并-阿糖胞苷)以防止非神经元细胞增殖。
动物感染和组织收集通过IC途径使小鼠感染10 ICLD50的任一病毒(B2C或SHBRV)。或者，通过在后腿(两侧)肌内(IM)途径来使小鼠感染10 IMLD50。每天两次持续20天观察被感染的动物的狂犬病的发病。包括假感染的小鼠作为对照。在严重麻痹时，处死小鼠且移出脑在干冰上速冻，之后在-80℃下储存。用氯胺酮/甲苯噻嗪以0.2ml的剂量麻醉动物且然后通过心内注射来灌注PBS，随后灌注10％的中性缓冲福尔马林，以进行组织病理学检测和免疫组织化学检测，如(Yan等人，2001，J.Neurovirol 7518-527)所述。移出脑组织并且进行石蜡包埋用于冠状切片(4μm)。
总RNA提取小鼠脑(每个为400-500mg)在3mlTRIZOL(Invitrogen-Life Technologies)中均质化。提取总RNA且使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)遵照制造商的规范进行纯化。
微阵列杂交和分析按照Affymetrix真核生物样品和阵列处理方案来制备用于微阵列杂交的cRNA，且然后与Affymetrix小鼠表达微阵列杂交(小鼠表达组MOE430A)。8μg的总RNA以及T7-(dT)24引物和Superscript II逆转录酶(Invitrogen-Life Technology)用于第一链cDNA合成。使用大肠杆菌DNA连接酶、DNA聚合酶I、RNase H和T4 DNA聚合酶(Invitrogen-Life Technologies)来合成第二链cDNA，且然后使用基因芯片样品清洗模块(GeneChip Sample Cleanup Module)(Affymetrix)进行纯化。通过使用Enzo RNA Superscript标记试剂盒(Affymetrix)来制备生物素标记的cRNA，且然后通过基因芯片样品清洗模块来进行纯化。将cRNA断裂且掺入细菌控制基因(bioB、bioC、bioD和cre)，之后与Affymetrix小鼠MOE430A过夜杂交。通过使用基因芯片射流平台(GeneChip Fluidics Station)来洗涤杂交微阵列，且然后使用抗体扩增洗涤和染色方案用R-藻红蛋白-链霉亲和素进行染色。使用基因阵列扫描仪来扫描杂交的基因芯片，使用基因芯片操作软件(GeneChip Operating Software，GCOS)来收集数据，且使用统计表达算法(Statistical Expression Algorithm)来获得信号值。信号被调整(scale)到500的目标强度以归一化。差异表达(至少2倍)的基因由Wong Lab，Department of Biostatistics，Harvard School of Public Health(http://biosunl.harvard.edu/complab/dchip/install.htm)所研发的dchip用于层次分析(hierarchical analysis)。通过使用自GO Consortium(http://www.geneontology.org/GO.consortiumlist.shtml)的基因本体论(gene ontology)对基因通路进行分析。
实时SYBR Green PCR为了确认从微阵列所产生的数据，在Stratagene Mx3000P仪器中使用基因特异性引物在RNA样品上执行实时PCR。以25μl的体积利用100ng的样品RNA在一个步骤中执行PCR反应。每个反应一式两份执行。逆转录酶和DNA聚合酶来自Brilliant SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit(Stratagene)。在50℃持续30分钟执行cDNA合成。在定量分析期间，使用三点标准曲线来计算每对引物的扩增效率。GAPDH用作内源性参考基因。
组织病理学检测、免疫组织化学检测以及蛋白质印迹 通过用苏木精和伊红(H&E)对石蜡包埋切片进行染色来执行组织病理学检测。为了进行免疫组织化学检测，在70℃加热石蜡包埋脑片10分钟，然后浸渍于CitriSolv(Fisher Scientific)中持续3×5分钟且干燥直至呈垩白色。在37℃下在10mM TrisHCL(pH 7.4-8.0)中利用蛋白酶k(20μg/ml)温育载片15分钟且利用PBS冲洗三次。所用第一抗体为直接针对RV N的单克隆抗体802-2(Hamir等人，1995，Vet.Rec.136295-296)、兔多克隆抗RV G抗体(Fu等人，1993，Vaccine11925-928)或抗CD-3多克隆抗体。所用第二抗体是生物素化的羊抗小鼠或羊抗兔IgG。然后使用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)来定位生物素化抗体。最后，二氨基联苯胺(DAB)用作显色底物。对于蛋白质印迹(Western blotting)，脑提取物以及细胞提取物在10％聚丙烯酰胺SDS凝胶上进行电泳。在SDS-PAGE上分离后，蛋白质被电印迹于PDVF膜。然后将印迹(Blot)在室温下在含有5％的脱脂乳和0.05％ Tween-20的PBS中封闭1小时。然后，利用各自抗体在4℃下温育印迹过夜或在室温下温育2小时。在利用含有0.05％ Tween-20(PBST)的PBS洗涤三次后，利用HRP缀合的第二抗体温育印迹1小时，之后在PBST中进行充分洗涤。通过增强的化学发光(ECL，Amersham Biosciences)来检测蛋白质。使用Adobe Photoshop 6.0软件通过图像密度测定来测量和扫描对应于免疫反应蛋白质的带信号。
免疫荧光和共聚焦显微镜。在盖片上生长的初级神经元被感染这些病毒中的每种病毒且然后在感染后第5天用4％的多聚甲醛固定。通过使用FITC缀合的抗RV N单克隆抗体(Centocor，PA)来检测病毒抗原。通过使用兔抗STAT多克隆Abs(Chemicon)来检测STAT1、STAT2和STAT3的表达。与Alexa 488缀合的抗兔第二抗体(分子探针)在室温下使用1小时。使用碘化丙锭(PI)进行复染(15分钟，室温)。在洗涤后，利用水性抗褪色封片剂固定盖片且在LelcaTCS NT共聚焦显微镜下进行检查。通过计数六个区域来评价STAT蛋白质核转位的细胞的百分比并且计算转位细胞的平均数。
结果 SHBRV的致病性比B2C更强，但诱导比B2C更少的炎症变化 为了比较这两种病毒SHBRV和B2C的致病性，通过从logICLD50/ml或log IMLD50/ml减去BHK细胞中log病毒滴度/ml来确定IC和IM致病指数(Li等人，2005，J.Virol，79；10063-10068；Morimoto等人，2000，J.Neurovirol.6373-81；Morimoto等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，953152-3156)且结果在图2A中示出。B2C需要比SHBRV多几乎1000倍病毒颗粒来杀死通过IC或IM途径感染的小鼠，说明在小鼠模型中SHBRV的致病性比B2C更强。
虽然已在先前报道了在狂犬病患者中观察到很少的炎症和神经元损失(Murphy.1977，Arch.Virol.，54279-297)，但实验室驯化的病毒诱导广泛的炎症和坏死(Miyamoto等人，1967，J.Exp.Med.，125447-456；Yan等人，2001，J.Neurovirol 7518-527)。为了检查感染了每种病毒的小鼠中的病理变化，小鼠被经心灌注并且移除脑进行组织病理学检测和免疫组织化学检测。发现减毒B2C诱导广泛的病理变化，特别是炎症，包括血管周围白细胞聚集、神经胶质增生和巨噬细胞和淋巴细胞侵润。常常在感染了B2C的脑组织中观察到坏死和凋亡。另一方面，在通过IC或IM途径感染SHBRV的小鼠中观察到仅很少的组织变化(图2)。为了量化炎症反应，如之前(Li等人，2005，J.Virol.7910063-10068)所述，在通过IC途径感染的小鼠中的皮质中使用抗CD3抗体测量CD3-阳性细胞。从每个动物选择三个连续切片进行测量且获得CD3-阳性细胞的平均数并且通过单因素ANOVA来分析统计学意义。如图2C所示，在B2C感染的小鼠中检测到比SHBRV感染的小鼠中显著(p<0.01)更多的CD3-阳性细胞，表明于SBBRV感染的小鼠相比，更多炎症细胞侵润B2C感染的小鼠。
与B2C相比，致病SHBRV诱导宿主基因表达中更少的变化 为了考察减毒RV感染与wt RV感染的不同的宿主反应，通过IC使小鼠感染10 ICLD50的致病SHBRV或实验室驯化的B2C。或者，小鼠IM感染10 IMLD50的每种病毒。假感染的小鼠用作对照。当出现严重麻痹时处死小鼠且使用速冻的脑用于总RNA提取和cRNA合成。然后，使用cRNA与小鼠整个基因组微阵列，小鼠表达组430A(mouse expression set 430A)，进行杂交。通过GCOS与dChip芯片的组合来分析该数据。收集22,626个小鼠基因的规一化数据。超过两倍的变化被认为是上调或下调。当与对照相比时，在IC感染B2C的动物中有792个基因上调和301个基因下调，而在IC感染SHBRV的动物中有525个基因上调和107个基因下调。比较而言，在IM感染B2C的动物中有890个基因上调和694个基因下调，而在IM感染SHBRV的动物中有259个基因上调和198个基因下调。总之，在IM或IC感染的B2C小鼠中，与B2C相比，致病SHBRV诱导了宿主基因表达中更少的变化。虽然，存在表达因一种病毒感染而改变但不因另一种病毒感染而改变的许多基因，但有也存在表达被一种病毒上调且被另一种病毒下调的很少的基因。表I比较通过每种途径感染了每种病毒的动物中的上调和/下调的基因的数目。
减毒B2C，而不是wt SHBRV，激活先天免疫反应的基因表达 通过基因本体论所进行的微阵列数据分析揭示出致病RV和减毒RV在这些基因簇中的许多基因簇中差异地诱导宿主基因表达(图3)。对于免疫和抗病毒基因以及参与凋亡的基因，在感染了任一种病毒的小鼠中上调的基因多于下调的基因。此外，在感染了B2C的小鼠中存在比感染了SHBRV小鼠中更多的上调的基因。对于参与神经元功能的基因，上调的基因多于下调的基因，特别是在感染了B2C的小鼠中。对于转录因子，上调的基因的数目和下调的基因的数目对于通过每种途径感染B2C类似。在本论文中，仅详细地分析了参与先天免疫和抗病毒反应的基因，特别是那些上调的基因。将在本文的其它地方更详细地描述其它宿主基因的调节(modification)。
对参与先天免疫和抗病毒反应的基因谱的分析揭示出减毒B2C(通过IC或IM接种)诱导先天免疫反应，特别是干扰素(IFN)-α/β诱导和IFN-α/β信号传导通路中重要的基因的表达。编码炎症细胞因子和趋化因子的基因也由于感染了B2C而上调。另一方面，wt SHBRV是先天免疫反应的较差的诱导剂(图3)。在SHBRV感染的动物中，对于免疫和抗病毒反应重要的基因中的许多基因并不被上调。对于那些因两种病毒感染上调的基因，在感染了B2C的动物中该增加通常高于感染了SHBRV的动物中2至30倍(表2和表3)。
在通过IC或IM途径感染了B2C的小鼠中，在IFN-α/β通路中所涉及的大多数基因上调。这些基因包括IFN-α/β基因，在IFN-α/β介导信号传导和转录激活中所涉及的基因以及编码抗病毒活性有关的蛋白质的基因(参看表2)。上调的IFN基因包括IFN-α2、IFN-α4和IFN-α5以及IFN-β。干扰素信号传导基因(Cbp/p300-相互作用反式激活子、Stat1、Stat2、Stat3和Jak-2)和干扰素调节因子(IRF-1，2和7)被上调。抗病毒活性有关的IFN-α/β诱导的蛋白质，包括双链RNA-依赖性蛋白激酶(PKR)、2’，5’-寡腺苷酸合成酶(OAS)、RNA-特异性腺苷脱氨酶(ADAR)、黏病毒抗性(Mx)以及I类主要组织相容性(MHC)也在B2C感染的动物中上调。2’5’-OAS的上调基因包括OAS-1B、1G、2和3以及OAS-样1和2。在IFN信号传导通路中，IFN激活和诱导型基因中的许多基因被高度上调(IFN激活基因202B、203、204和205，具有三十四肽重复单位(tetratricopeptide repeats)1、2、3的IFN诱导跨膜蛋白质)。最大上调基因是抗病毒Mx1，其在通过IC途径感染B2C的动物中上调388倍。
另一方面，在IFN-α/β通路中重要的基因中的许多基因在SHBRV感染的小鼠中并不上调。通过IC除了IFN-α4(6倍)外，通过IM除了IFN-β(2倍)外，IFN基因并不上调。对于IFN信号传导和效应子基因，Cbp/p300相互作用反式激活子、Stat3、Jak-2、IRF-2、2’5’-OAS-2、2’5’-OAS-3、ADAR、MHC-1、PKR、IFN激活基因203以及带有三十四肽重复单位3的IFN诱导跨膜蛋白质在通过IC或通过IM途径感染SHBRV的小鼠中并不上调。在IFN-α/β通路中的基因中的某些基因在感染了SHBRV的小鼠中上调但是增加低于感染了B2C的小鼠中的增加的2至30倍(表2)。
炎症通路中的组分，包括toll样受体(TLR)、趋化因子、细胞因子以及补体成份在B2C感染的动物中也上调(表3)。TLR1、TLR2和TLR3的表达上调。在C-C和C-X-C家族中的促炎症趋化因子，包括Rantes(CCL5)、MCP-1(CCL2)、MCP-3(CCL7)和MCP-5(CCL12)、MIP-1

(CCL

MIP-1

(CCL4)、MIP-2

(CXCL-1)和MIP-2

(CXCL-2)和IP-10(CXCL-10)，皆以超过100倍的增加上调。细胞因子和细胞因子受体中的许多上调，例如，促炎症细胞因子IL-6。补体成份，诸如clq、clr、cls、c2、c3和c4上调。在感染了SHBRV的小鼠中，在通过IC或IM途径感染的小鼠中，TLR1和TLR2并不上调。对于趋化因子，在SHBRV感染的小鼠中，仅MCP-5上调到与B2C感染的动物中类似的水平。在通过IC或IM途径感染SHBRV的小鼠中，MIP-1、MIP-1和CXC趋化因子BLC并不上调。感染了SHBRV的小鼠中其它趋化因子的上调低于感染了B2C的小鼠中的上调的2至20倍(表3)。同样，许多细胞因子、细胞因子受体以及补体的表达在感染了SHBRV的小鼠中并不上调。
通过实时PCR确认微阵列数据 为了验证微阵列数据，对选自包括IFN(IFNα-2和IFNα-5)、IFN调节基因(Stat1、Stat2、Stat3、IRF2和IRF7)、IFN-效应子基因(OAS-1G和Mx1)以及趋化因子基因(MCP-1、IP-10和Rantes)的类别中的每一类的选定基因执行实时PCR。使用GAPDH作为参考基因。用于扩增这些基因的引物在表4中列出。将从实时PCR获得的结果与通过微阵列杂交所获得的数据相比较并且总结于表5中。在微阵列数据和实时PCR结果中，感染了SHBRV或B2C的小鼠与对照相比的倍数增加对于某些基因而言类似。对于诸如Stat1、Stat2、OAS-1G、Mx1、IP-10和Rantes的其它基因，实时PCR更敏感的且检测到比微阵列杂交的更大的增加。然而，B2C与SHBRV之间的倍数增加的比例在微阵列与实时PCR中类似。
Stat基因增加的表达导致STAT蛋白质增加的合成 为了确定增加的Stat基因表达是否导致增加的蛋白质合成，使用抗STAT抗体通过蛋白质印迹来测量IC或IM感染的小鼠中STAT1、STAT2和STAT3的水平(蛋白产量)且通过密度测定来测量带强度。如图4所示，在通过IC或IM途径感染B2C的小鼠中，STAT1和STAT2的表达增加超过7倍，而在感染了SHBRV的小鼠中，STAT1和STAT2仅增加了2至4倍。另一方面，STAT3表达在感染了这些病毒中的每种病毒的动物中类似地上调且其水平与对照相比增加了大约2倍。增加的STAT蛋白质水平与增加Stat的转录物的水平成正比，如通过微阵列和实时PCR所检测(表2和表5)。β-微管蛋白表达的水平在感染的动物或未感染的动物中几乎相同。为了进一步确定STAT的表达模式，初级神经元被感染0.1 MOI的每种病毒且在第5天收获细胞进行蛋白质印迹。STAT1和STAT2的水平在感染了B2C的细胞中增加了4到7倍，但在感染了SHBRV的细胞中仅增加了大约2倍。同样，STAT3的水平在感染了B2C或SHBRV的细胞中增加了大约2倍。这些数据表明Stat基因增加的表达导致增加的STAT蛋白质合成。
STAT1和STAT2，但非STAT3，通过RV感染而激活 STAT，特别是STAT1与STAT2，在IFN-α/β信号传导通路中起到重要作用。IFN-α/β结合到IFN-α/β受体，其通过磷酸化而激活STAT(Stark等人，1998，Annu Rev Biochem.67277-64)。磷酸化STAT形成特异性多聚复合物，其然后转位至核且启动转录(Darnell等人，1994，Science，2641415-21)。为了判断STAT是否通过RV感染而激活，感染了B2C或SHBRV的神经元用4％的多聚甲醛固定且利用抗STAT抗体与共聚焦显微镜进行免疫细胞化学检测。核转位的细胞的百分比在感染后1天、3天和5天进行量化。在感染了任一病毒的细胞中在感染后1天或3天，对于STAT蛋白质中的任一种，仅存在很少的转位细胞。如图5所示，在感染后第5天，在感染了B2C的细胞中，对于STAT1和STAT2，观察到显著更多的核转位的细胞。在感染了B2C的细胞中，对于STAT3，仅检测到很少的核转位的细胞。此外，在感染了B2C的细胞中，对于STAT1和STAT2蛋白质，观察到比感染了SHBRV的细胞中显著更多的核转位的细胞。这些数据一起说明STAT1和STAT2，但非STAT3，在RV感染中参与IFN激活和效应子通路。
由致病SHBRV所致的先天免疫反应的逃避与RV G表达的限制相关在之前，据报道，致病RV对G表达的限制造成其致病性(Morimoto等人，1999，J.Virol.73510-8；Yan等人，2001，J.Neurovirol.7518-527)。为了判断G表达的限制是否也发生于致病SHBRV感染中且可能与由致病SHBRV所致的先天免疫反应的逃避相关，通过使用免疫组织化学检测来评价脑片上的RV G和N的表达。如图6A所示，N表达水平在IC感染每种病毒的小鼠中类似，而G表达水平在SHBRV感染的小鼠中是不可检测的。相比之下，G表达水平在B2C感染的小鼠中较高。为了确认这个发现，从通过IC或IM途径感染SHBRV或B2C的小鼠制做脑提取物。而且，从感染每种病毒的初级神经元制备细胞提取物。所有这些提取物进行蛋白质印迹以检测G和N表达水平。如图6B所示，G表达水平在感染了SHBRV的动物和细胞中始终低于感染了B2C的动物和细胞中三倍而N表达水平在感染了任一病毒的动物和细胞中类似。这些数据说明在体内以及在体外在致病RV感染中G表达始终受到抑制且因此G表达的抑制可能是致病SHBRV逃避先天免疫反应激活的机制中的一种机制。
讨论 宿主先天免疫反应是抵抗感染的第一道防线。在病原体-宿主协同进化期间，许多病毒已发展了逃避宿主先天免疫反应，特别是IFN通路(Samuel，2001，Clin.Microbiol Rev.14778-809)。先前，各种集团报道了RV感染可激活先天免疫反应。举例而言，RV感染在体内和在体外触发炎症细胞因子(Baloul等人，2004.J.Neurovlrol.10372-82；Baloul等人，2003，Biochimie 85777-88)和趋化因子(Galelli等人，2000，J.Neurovirol.6359-72；Nakamichi等人，2004，J.Virol.789376-88)的表达。在所有这些研究中，仅使用实验室驯化的RV。在本论文中，我们比较实验室驯化且减毒的RV与wt致病RV且首次发现致病RV逃避，而减毒RV激活，宿主先天免疫反应。如通过微阵列计数和实时PCR所检测，参与IFN-α/β通路和炎症趋化因子和细胞因子中的许多因子的激活的几乎所有基因在通过IC或IM途径感染的减毒RV B2C的动物中上调。然而，这些基因中的许多基因在感染了致病SHBRV的动物中并不上调。对于在SHBRV感染的动物中上调的参与IFN-α/β通路的那些基因，增加的量值低于B2C感染的小鼠的增加量值的至少2至30倍。而且，减毒RV诱导广泛的CNS炎症，而致病RV并不诱导这种炎症。
减毒B2C激活先天免疫反应，特别是IFN-α/β信号传导通路。近来，Nakamichi等人(J.Virol.789376-88)，还报道了在用实验室驯化的减毒RV刺激后在RAW巨噬细胞中IFN-α/β上调。相关论文(companion paper)(Préhaud等人，2005.J.Virol.79；12893-12904)以及最近公开的论文(Conzelmann，2005，J.Virol.79；5241-5248)中，RV感染诱导IFN-β的表达。在本研究中，不仅IFN-β，而且IFN-α2、4和5，也发现由于减毒RV的感染而上调。而且，参与IFN介导信号传导和细胞基因表达的转录激活的那些基因也被上调，这些基因包括干扰素信号传导基因(Stat-1、2、3和Jak-2)和干扰素调节因子(IRF-1、2和7)。如由Samuel(Clin.Microbiol Rev.14778-809，2001)所总结，在抗病毒活性中牵连的IFN-α/β诱导的蛋白质包括PKR、2’，5’-OAS、ADAR、Mx和I类MHC。编码这些蛋白质的基因在B2C感染的动物中均上调。这些分子参与mRNA翻译抑制、RNA降解、RNA编辑以及CTL反应。在IFN信号传导通路中，IFN激活和诱导型基因中的许多基因被高度上调(IFN激活基因202B、203、204和205，具有三十四肽重复单位的1、2和3的IFN-诱导跨膜蛋白质)。因此，减毒的RV激活IFN-α/β通路。IFN-α/β在抵抗RV感染中的作用在先前被考察过。INF-α/β或IFN诱导聚I:C的直接给药导致小鼠、仓鼠、兔或猴中针对RV感染的各种程度的保护(Harmon等人，1974，Antimicrob Agents Chemother.6507-11；Hilfenhaus等人，1975，Infect.Immun.111156-8)，(Harmon等人，1974，Antimicrob Agents Chemother.6507-11；Hilfenhaus等人，1975，Infect.Immun.111156-8)，报道了当感染了减毒CVS-F3时，在IFN-α/β受体敲除(IFNAR-/-)的小鼠中检测到比免疫完整的小鼠更高的病毒滴度。IFNAR-/-小鼠(21天)还需要比正常对应物(8天)更长的时间来从CNS中清除病毒。此外，具有完全免疫活性小鼠出现了比IFNAR-/-小鼠更高的病毒中和抗体水平。所有这些数据表明IFN-α/β通过先天免疫反应和获得性免疫反应在RV抵抗方面起到作用。
除了IFN-α/β通路外，减毒的RV还刺激编码炎症分子的许多基因，诸如趋化因子、细胞因子、TLR和补体的表达。炎症细胞因子IL-6(Kiecolt-Glaser等人，2003，Proc.Natl.Acad，Scl，USA.1009090-5)在B2C感染的动物中在被高度上调。炎症趋化因子(C-C与C-X-C家族)中的许多因子也被高度上调，特别是MCP-1、3和5，MIP-1α、Rantes、IP-10和MIG。趋化因子CCL-5在先前在感染了RV的小鼠的CNS中的迁移T细胞中检测到(Galelli等人，2000.J Neurovirol.6359-72)。近来，Nakamichi等人(Nakamichi等人，2004，J.Virol.789376-88)报道了在RV感染的巨噬细胞中CXCL-10被高度上调且其它趋化因子不被上调。那个研究和我们在这里所报道的研究之间的差距可能是由于所涉及到不同类型的细胞。在Nakamichi等人(Nakamichi等人，2004，J.Virol.789376-88)的研究中，仅使用巨噬细胞，而在本研究中，在脑中检测到趋化因子的表达，其中除了神经元之外，还存在其它细胞类型，诸如星形胶质细胞、小胶质细胞和浸润CD3-阳性T细胞。还报道了趋化因子(MCP-1)表达还可受到单核细胞-星形胶质细胞相互作用的影响(Andjelkovic等人，2000.J Leukoc Biol.68545-52)。因此，可能神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞以及浸润CD3-阳性T细胞之间的相互作用造成如本研究中所观察到的这么多趋化因子的上调。TLR的激活还诱导炎症(Boehme等人，2004.JVirol.787867-73)。在B2C感染的小鼠中，TLR1、TLR2和TLR3均发现被上调。趋化因子、细胞因子以及TLR增加的表达对应于在感染了B2C的小鼠中所观察到的严重的炎症反应和CD3阳性细胞侵润的显著增加。此外，补体C1，特别是Clr，在B2C感染的小鼠中被高度上调。虽然经典的或替代的互补级联可能不参与CNS中对RV的抵抗(Hooper等人，1998，J.Virol.723711-9)，但C1的增加的表达可能是在RV诱导的CNS炎症期间激活的小胶质细胞的结果(Dietzschold等人，1995，J.Neurol.Sci.13011-16)。炎症反应和T细胞的浸润据报道在阻断CNS中RV扩散方面(Baloul等人，2003，Biochimie 85777-88；Camelo等人，2001.J.Virol.753427-34)以及从CNS中清除RV(Hooper等人，1998，J.Virol.723711-9)方面起到主要作用。
因此，显然减毒RV激活包括IFN-α/β通路和炎症反应的先天免疫反应。这些基因的上调通过微阵列和实时PCR在IC和IM感染的小鼠中检测到。此外，其它实验室驯化且减毒RV对小鼠的感染还导致参与先天免疫反应中的基因上调。而且，我们的数据也得到了相关论文的支持，相关论文展示参与IFN信号和炎症中的这些基因中的许多基因也在感染了实验室驯化的RV后在人有丝分裂后N2T细胞(human post-mitotic N2T cell)中上调(Préhaud等人，2005.J.Virol.7912893-12904)。另一方面，致病SHBRV诱导很少或不诱导炎症以及IFN-α/β和炎症通路中很少的基因表达上调或不存在基因表达的上调。由减毒RV所致的先天免疫反应的激活可能在宿主抵抗RV感染方面起到保护性作用，这可能解释为什么致病RV中很少的病毒颗粒能够杀死感染动物，而减毒RV需要大约1000倍更多的病毒颗粒来杀死在小鼠模型中的感染的动物。在SHBRV感染的小鼠中观察到的先天免疫反应的逃避可能造成病毒的高度神经侵染性特征(Faber等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，10116328-32；Morimoto等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，935653-8)。IFN-α/β通过与IFN-α/β受体结合来发挥其抗病毒活性，其通过磷酸化来激活STAT(Stark等人，1998，Annu Rev Biochem.67277-64)。磷酸化的STAT形成特异性多聚复合物，其转位至核且启动转录(Darnell等人，1994.Science.2641415-21)。通过微阵列杂交和实时PCR检测到在RV感染的小鼠中Stat1、Stat2和Stat3基因均上调(参看表2和表5)。而且，Stat表达的上调导致蛋白质合成按比例增加。STAT1和STAT2的水平在感染了B2C的动物或细胞中比感染了SHBRV的动物或细胞中更高。另一方面，STAT3表达在感染了任一病毒的动物或细胞中类似地增加。最重要的是，在感染了RV，特别是B2C后，发现显著更多的STAT1和STAT2转位细胞。在RV感染中仅观察到少数的STAT3-转位细胞。这些数据可表明RV感染，特别是减毒病毒的感染，不仅导致STAT1和STAT2的增加的转录和合成，而且还可能通过磷酸化而导致STAT1和STAT2的激活，造成核转位。这些数据还说明STAT1和STAT2，而不是STAT3，在RV感染中参与IFN-α/β激活和效应子通路。这与其它研究的结果相同STAT1和STAT2促进抑制病毒复制的效应子蛋白质的合成(Aaronson等人，2002.Science.2961653-5；Darnell等人，1994.2641415-21)。已报道了Stat在RV感染的小鼠(Préhaud等人，2005.J.Virol.7912893-12904)和神经元细胞(Prosniak等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，982758-63)中增加的表达。
为了对抗宿主的抗病毒活性，病毒发展了消弱先天免疫诱导，特别是IFN-α/β通路的方式(Samuel，2001，Clin.Microbiol Rev.14778-809)。痘病毒编码可溶IFNR同源物，其防止IFN通过它们的天然受体起作用来引起抗病毒反应(Smith等人，1997，Immunol Rev.159137-54)。腺病毒VAI RNA通过防止PKR激活来拮抗IFN的抗病毒状态(Matthews等人，1991，J.Virol.655657-62)。脊髓灰质炎病毒感染导致PKR的降解(Black等人，1993，J.Virol.67791-800)。在最近的综述(Conzelmann.2005.J.Virol.795241-5248)中，Conzelmann总结了不分段负链RNA病毒干扰IFN-α/β的转录激活的机制。举例而言，自副黏病毒(猴病毒5、仙台病毒和腮腺炎病毒)的V或C蛋白质经由泛素化通路来介导STAT1的降解(Didcock等人，1999.J Virol.739928-33；Ohno等人，2004，J.Gen.Virol.852991-2999；Palosaari等人，2003，J.Virol.777635-7644；Shaffer等人，2003，Virology，315389-397)。埃博拉病毒的VP35蛋白质抑制IFN-β启动子的诱导和ISRE源基因表达的dsRNA/病毒-介导激活(Basler等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9712289-94)。流感病毒的NS1蛋白质是INF-α/β拮抗剂(Garcia-Sastre等人，1998，Virology，252324-330)。RV的P蛋白质近来据报道干扰IRF-3的磷酸化，因此发挥其对于IFN-α/β的拮抗功能(Brzózka等人，2005，J.Virol.，in press)。在我们的研究中，发现先天免疫反应的激活，特别是IFN-α/β的上调，与RV G表达的水平相关。不仅在CNS中，而且也在初级神经元中，减毒的RV大量地表达G而致病RV表达三倍更少的G，尽管两种病毒表达类似量的N。G表达的限制还导致病毒产量在感染了wt SHBRV的小鼠的脑中低于感染了B2C的小鼠脑中3个数量级，类似于Faber等人的发现(Faber等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10116328-32)。因此，提出致病RV逃避先天免疫反应的一种方式是通过G表达的限制，据报道RV抑制G表达从而致病(Faber等人，2002，J.Virol.763374-81；Faber等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，10116328-32；Morimoto等人，2001，Vaccine，193543-51)。因此G表达的限制可能有助于致病RV逃避先天免疫反应。虽然双链RNA据报道为在减毒RV感染细胞中诱导IFN-α/β的主要因素(Préhaud等人，2005.J.Virol.7912893-12904)，但也可能RV G可激活TLR，特别是TLR-3，从而在RV感染细胞中刺激INF-α/β通路的表达。据报道病毒表面糖蛋白可激活TLR(Boehme等人，2004.J Virol.78；7867-73)。TLR-3可在人有丝分裂后神经元中感测到RV感染以产生IFN-β(Préhaud等人，2005.J.Virol.7912893-12904)，且在我们的研究中，TLR-3也在感染了RV的小鼠中也上调。
除了参与先天免疫和抗病毒反应的基因外，许多其它宿主基因，诸如参与凋亡的那些基因，也在B2C感染的小鼠中上调，但在SHBRV感染的小鼠中并不上调。参与凋亡的基因在B2C中的上调多于SHBRV可解释B2C诱导凋亡(Morimoto等人，1998，Proc.Natl..Acad.Sci.USA，953152-3156)而SHBRV并不诱导凋亡的观察。另一方面，RV感染导致神经元特异基因中的许多基因的下调。实际上下调的神经元基因多于上调的神经元基因，特别是在B2C感染的小鼠中。这并不令人惊奇，因为我们在先前已报道了在感染了CVS-24的大鼠中通过原位杂交造成诸如前脑啡肽原基因的神经元特异性基因的下调(Fu等人，1993，J.Virol.676674-6681)。
而且，Prosniak等人(Proc Natl Acad Sci USA.982758-63，2001)已报道了通过使用消减杂交，在RV感染的小鼠中大部分宿主基因下调。在本研究中还发现在RV感染的小鼠中上调的转录因子和下调的转录因子一样多。在先前，报道了诸如egr-1和c-jun的转录因子在RV感染的大鼠中上调(Fu等人，1993，J.Virol.676674-6681)。在RV发病机制中神经元特异性基因和转录因子的表达模式的修改的重要性尚未完全明了且仍需要进一步的考察。
表1.在IC或IM感染了B2C或SHBRV的小鼠中宿主基因表达谱

▲上调，

下调，

既不上调也不下调 表2.在通过IC或IM感染了B2C或SHBRV的小鼠脑中参与IFN-α/β信号传导通路中的基因的表达谱(相对于对照小鼠的倍数变化) *IFN-具有三十四肽重复单位1、2和3的诱导跨膜蛋白质。
N无变化 表3.在通过IC或IM途径感染了B2C或SHBRV的小鼠脑中炎症基因的表达谱(相对于对照小鼠的倍数变化) N无变化. TGF，转化生长因子；TNF，肿瘤坏死因子；TNFR，TNF受体. 表4.用于实时PCR的引物(SEQ ID NO.9-34) 表5.实时PCR结果与微阵列数据在感染了SHBRV或B2C的小鼠中相对于对照的倍数增加之间的比较
NC与对照相比无变化 NA不适用的； *没有对照信号 实施例III.SHBRV、B2C和L16狂犬病毒的比较 宿主基因表达谱 在实施例II中，我们使用两种病毒SHBRV和B2C在小鼠模型中用谱表示(profile)宿主基因表达。在这里我们描述与L16的另一比较。L16通过反向遗传学技术从疫苗株SAD-B19克隆(Schnell等人自克隆cDNA的感染性RV.EMBO J.1994；13；4195-4203；Wu等人“Both viral transcription and replication are reduced when the rabies virusnucleoprotein is not phosphorylated(当狂犬病毒核蛋白质不被磷酸化时病毒转录和复制减少)”J.Virol.2002；764153-61)。最初比较这些病毒的毒力。在BHK细胞中确定病毒滴度并且被测量为病灶形成单位(focus forming unit，ffu)且在小鼠中确定50％的脑内致死剂量(ICLD50)和50％的肌内致死剂量(IMLD50)。通过从log ICLD50/ml或logIMLD50/ml减去在BHK细胞中的log病毒滴度/ml来计算IC和IM致病指数且结果在表6中显示出。减毒B2C和L16需要比SHBRV多1000至10,000倍的病毒颗粒来杀死通过IC或IM感染的小鼠，说明在小鼠模型中SHBRV的毒力比减毒B2C和L16更强。
表6.通过IC感染途径或IM感染途径的三种RV的致病指数 病毒 IC致病指数 IM致病指数 B2C 1.1 x 104 6.2x107 L16 6.6 x 104 ND SHBRV0.153.3 x 104 表7.在通过IC或IM感染了减毒(B2C和L16)或有毒(SHBRV)的小鼠脑中参与IFN-β信号传导通路的基因的表达谱(相对于对照小鼠的倍数变化)。
基因分类/鉴定B2C L16 SHBRV B2SHBRV (IC) (IC) (IC)(IM) (IM) 干扰素基因 IFN-α2 2 N N 3 N IFN-α4 8 5 6 9 N IFN-α5 9 3 N 8 N IFN-β3 N N 3 2 干扰素信号传导基因 Cbp/p300-反式激活子 2 2 2 2 N Stat 1 323018 14 9 Stat 2 13114 10 4 Stat 3 4 6 5 5 N IRF-16 8 3 9 2 IRF-23 2 N 5 N IRF-711116 30 7 Jak 22 2 N 2 N PKR 3 2 N 6 4 干扰素效应子基因 2′-5′OAS-1B151010 13 6 2′-5′OAS-1G13135 13 5 2′-5′OAS-2 4 5 N 6 3 2′-5′OAS-3 2 2 N 5 N 2′-5′OAS-样1 7 5 3 11 3 2′-5′OAS-样2 423418 45 26 ADAR，RNA-特异性 3 4 2 -2 N MHC-I抗原3 3 N 4 N Mx 1 388 294 91 11918 Mx 2 563215 14724 干扰素激活基因 IFN激活基因202B 315 338 147 47849 IFN激活基因203 5 4 2 23 N IFN激活基因204 493412 47816 IFN激活基因205 456411 14712 IFN-诱导的蛋白质1* 373721 24 N IFN-诱导的蛋白质2* 256 275 128 20874 IFN-诱导的蛋白质3* 454518 60 30 *具有三十四肽重复单位1、2和3的IFN-诱导跨膜蛋白质。N:无变化 为了用谱表示宿主基因表达，小鼠被通过IC途径感染10 ICLD50的SHBRV、B2C和L16，如在实施例II中所述。小鼠还被通过IM途径感染了10 IMLD50的SHBRV和B2C，如实施例II所述，当显示出麻痹时处死小鼠且通过速冻收获脑。使用假感染的小鼠作为对照。从该脑提取总RNA并且用于cRNA合成。然后将cRNA用于与小鼠表达组430A(mouse expression set 430A)基因组阵列表达(Affymetrix)杂交。通过基因芯片操作软件(Affymetrix)和dChip方法(HarvardUniversity)的组合来分析数据。收集22,626个小鼠基因的规范化的数据。超过两倍的变化被认为是上调或下调。通过基因本体论的微阵列数据的分析揭示出有毒RV和减毒RV差异地诱导宿主基因表达，特别是先天免疫和抗病毒基因的表达。减毒的B2C和L16诱导IFN-β通路和炎症趋化因子中的基因的表达。另一方面，wt SHBRV是先天免疫反应的较差的诱导剂(表7)(Wang等人，2005，J.Virol.7912554-12565；实施例II)。在通过IC或IM途径感染了B2C和L16的小鼠中，参与IFN-β通路的大部分基因上调。这些基因包括IFN-β基因，参与IFN-介导信号传导和转录激活中的基因以及编码在抗病毒活性中所牵连的蛋白质的基因。上调的IFN基因包括IFN-α2、α4和α5以及β。干扰素信号传导基因(Cbp/p300，Stat1、2、3和Jak-2)和干扰素调节因子(IRF-1、2和7)上调。在抗病毒活性中所牵连的IFN-β诱导蛋白质，包括双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)、RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)、2’，5’-寡腺苷酸合成酶(OAS)、黏病毒抗性(Mx)以及I类MHC，也在B2C和L16感染的动物中上调。2’5’-OAS的上调基因包括1B、1G、2以及OAS样1和2。在IFN信号传导通路中，许多IFN激活或诱导型基因(IFN激活基因202B、203、204和205，具有三十四肽重复单位1、2和3的IFN诱导跨膜蛋白质)被高度上调。大部分上调的基因是抗病毒Mx1，其在通过IC途径感染了B2C的小鼠中增加388倍。参与IFN-α/β信号传导的基因的激活的量值在感染了B2C和L16的基因中类似。
另一方面，在IFN-α/β通路中重要的基因中的许多基因在SHBRV感染的小鼠中并不上调。除了通过IC的IFN-α4(6倍)之外和通过IM的IFN-β(2倍)之外，IFN基因并不上调。对于IFN信号传导和效应子基因，Cbp/p300反式激活子，Stat3、Jak-2，RF-2，2’5’-OAS-2、-3，ADAR、MHC-1、PKR、IFN激活基因203和具有三十四肽重复单位3的IFN诱导的跨膜蛋白质在通过IC或IM途径感染了SHBRV的小鼠中并不上调。在IFN通路中的基因中的某些基因在感染了SHBRV的小鼠中上调但增加低于感染了B2C或L16的小鼠中的2至30倍(表7)。
表8.在通过IC或IM途径感染了减毒B2C和L16或有毒SHBRV的小鼠脑中的炎症趋化因子基因的表达谱(相对于对照小鼠的倍数变化)

包括toll样受体(TLR)与趋化因子的炎症通路中的组分在B2C或L16感染的动物中也被上调(表8)。TLR1、TLR2和TLR3的表达被上调。包括Rantes(CCL5)、MCP-1(CCL2)、MCP-3(CCL7)、MCP-5(CCL12)、MIP-1

(CCL3.)、MIP-1β(CCL4)、MIP-2

(CXCL-1)、MIP-2β(CXCL-2.)和IP-10(CXCL-10)的C-C和C-X-C家族中的促炎症趋化因子皆以超过100倍的增加被上调。TLR和趋化因子基因的激活的量值在感染了B2C或L16的小鼠中类似。在感染了SHBRV的小鼠中，TLR1和TLR2并不被上调。对于趋化因子，在SHBRV感染的小鼠中仅MCP-5以与B2C或L16感染的动物中类似的水平上调。MIP-1

、1

和CXCL 11在通过IC或IM感染的小鼠中并不被上调。在感染了SHBRV的小鼠中其它趋化因子的上调低于感染了B2C或L16的小鼠中的上调的2至20倍(表8)。
基因表达谱数据表明减毒的RV(B2C和L16)是包括IFN-β诱导和信号传导通路和炎症通路的先天免疫反应的强效激活子。相比之下，SHBRV逃避先天免疫反应，从而造成其毒力，其可解释为何有毒RV(SHBRV)的很少的病毒颗粒能够杀死感染动物而减毒RV(B2C和L16)需要1000至10000更多的病毒颗粒来杀死感染动物(表6)。因此，先天免疫反应的诱导是RV病毒的重要机制。
IFN-α抑制RV复制 上调IFN-α/β诱导和信号传导通路可具有直接的抗病毒作用。为了判断IFN是否抑制RV复制，用IFN-α以50、100、200、400和800单位的浓度对NA细胞进行处理。二十四小时后，细胞被以0.1ffu/细胞感染B2C或SHBRV。在另外培育48小时后，收获上清液用于病毒滴定。如图7所示，用50单位的IFN处理导致SHBRV的病毒产生的2个数量级的减少且SHBRV复制几乎被用100单位的IFN处理而完全抑制。用800单位的IFN进行处理导致B2C的2个数量级的减少。这些数据表明有毒RV比减毒RV对IFN更敏感，这可解释为何有毒RV进化规避宿主先天免疫反应的方式。
与有毒RV相比，减毒RV诱导更多的炎症反应 炎症趋化因子可募集中性粒细胞、单核细胞以及淋巴细胞。为了检查减毒RV的感染是否在小鼠脑中导致比有毒RV更多的炎症，小鼠被感染了B2C、L16或SHBRV，且当显示出麻痹时被经心灌注。移除脑用于组织学检测和免疫组织化学检测。发现减毒的B2C和L16诱导广泛的病理变化，特别是包括血管周围白细胞聚集、神经胶质增生和巨噬细胞和淋巴细胞侵润的炎症。在另一方面，在感染了SHBRV的小鼠中仅观察到很少的病理变化。为了量化炎症反应，在皮质中使用抗CD3抗体测量CD3-阳性T细胞。从每个小鼠选择三个连续切片用于计数且获得CD3阳性细胞的平均数并且通过单因素ANOVA进行统计分析。如图8所示，在B2C和L16感染的小鼠中检测到比SHBRV感染的小鼠中显著更多(p<0.01)的CD3-阳性T细胞，表明与有毒RV感染的小鼠脑相比更多的炎症细胞侵润减毒RV感染的小鼠脑(Wang等人，2005，J.Virol.7912554-12565；75；Sarmento等人，2005，J.Neurovirol.11571-581；实施例IV)。
实施例IV 糖蛋白-介导的凋亡诱导限制小鼠CNS中减毒狂犬病毒的扩散 由狂犬病毒(RV)所致的凋亡诱导据报道与糖蛋白(G)的表达相关联，但与致病性逆相关。为了进一步描绘G表达与凋亡诱导之间的关联性，仅取代G基因的重组RV用于通过脑内途径来感染小鼠。与表达野生型(wt)或致病RV的G的重组RV相比，表达自减毒病毒的G的重组病毒表达更高水平的G且在小鼠中诱导更多的凋亡，展示出是G基因决定G表达水平并因此凋亡诱导。同样，表达自野生型(wt)或致病RV的G的重组病毒在小鼠中的致病性比表达自减毒RV的G的那些病毒更强，确认了RV致病性与凋亡诱导之间的逆相关。为了研究凋亡诱导减弱病毒致病性的机制，通过肌内途径来使小鼠感染wt RV或减毒RV。发现低剂量的减毒RV诱导脊髓中的凋亡且未能扩散到脑内或产生神经系统疾病。另一方面，在感染了相同剂量的wt RV的小鼠的脊髓中并未观察到凋亡且病毒扩散到脑的各个部分内并且诱导致命的神经疾病。这些结果说明糖蛋白介导的凋亡诱导限制减毒狂犬病毒在小鼠的CNS中的扩散。
背景 凋亡或程序性细胞死亡是一种过程，凭借该过程多细胞生物的个体细胞响应于很多种刺激而经历系统性自毁，其主要特征为细胞收缩、膜凝缩、膜起泡以及DNA断裂。凋亡在正常胚胎发育和组织内平衡中在生理学上起到重要作用且也是细胞对病毒感染的一般反应。
病毒-诱导凋亡被认为是宿主的病理和保护性反应(Mori等人，2004.Rev Med Virol.14209-216)。在某些情形中，病毒-诱导凋亡可造成发病，例如，由于凋亡造成的许多细胞的破坏，特别是那些无法补偿的细胞，诸如神经元，可导致疾病(Lewis等人，1996.J Virol 701828-1835)。实际上，诱导神经元凋亡的能力与α病毒和黄病毒的神经毒力相关(Lewis等人，1996.J Virol 701828-1835；Despres等然，1998.J Virol 72823-829)。然而，更一般而言，凋亡表示重要宿主防御机制(Barber等人，2001.8113-126；Kerr等人，1991.Cold SpringHarbor，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)。细胞进化以在病毒感染时自杀从而从组织、器官或整个生物消灭不希望的细胞内病原体(Mori等人，2004.Rev Med Virol.14209-216)。此外，由凋亡而不是坏死所造成的死亡可显著地影响通过抗原-呈递细胞的病毒抗原俘获效率和到T细胞的呈递，从而也增强获得性免疫反应(Barber等人，2001.8113-126)。
提出了凋亡在RV感染中的有益影响和有害影响。在脑内(IC)感染小鼠获得性CVS病毒的实验动物中，在CNS中观察到广泛的凋亡(Jackson等人，1997.J Virol 715603-5607；Theerasurakarn等人，1998.J Neurovirol 4407-414)。从这些观察导致以下假设；凋亡在实验RV感染中起到重要致病作用。然而，Morimoto等人，1999.J Virol 73510-518发现RV在初级神经元培养物中诱导凋亡的能力与其在动物中的致病性逆相关。此外，在感染了实验室驯化的CVS-24的小鼠中观察到广泛的凋亡，但在感染了街RV株、SHBRV-18的小鼠中并未观察到这种广泛凋亡(Yan等人，2001.J Neurovirol 7；518-527)。近来，Thoulouze等人(2003)Ann N Y Acad Sci.1010598-603)，观察到凋亡诱导与RV株侵入到脑内的能力之间的逆相关，说明凋亡抑制可为噬神经病毒用来促进其通过神经系统发展的策略。因此，凋亡诱导是RV感染中的宿主防御机制。这种假设还进一步被以下发现支持表达细胞色素c的重组RV诱导比亲代病毒更多的凋亡且减弱其致病性(Pulmanausahakul等人，2001.J Virol.7510800-7)。
还报道凋亡诱导与G表达水平相关(Morimoto等人，1999.ProcNatl Acad Sci USA.935653-8)；Yan等人，2001.J Neurovirol 7518-527；Faber等人，2002.J Neurovirol 7518-527)。在本研究中，仅G基因不同的不同重组RV用于感染小鼠且G表达水平与脑中凋亡诱导相关。发现与表达wt或致病RV G的那些病毒相比，表达自减毒病毒的G的重组病毒表达更高的G水平且诱导更多的凋亡，展示出G基因决定G表达水平和因此凋亡诱导。而且，减毒RV诱导脊髓中的凋亡且未能扩散到脑内，而在感染了wt RV的小鼠的脊髓中检测到很少或并未检测到凋亡且病毒扩散到脑的各个区域内，说明G介导凋亡诱导限制减毒狂犬病毒在小鼠的CNS中的扩散。
材料和方法 病毒、细胞和抗体 在这个研究中使用七种不同的RV株，包括四种亲代病毒(SN-10、B2C、N2C和SHBRV)和三种重组病毒(RB2C、RN2C和RSHBRV)。所有这些病毒从Dr.Bernhard Dietzschold，ThomasJefferson University获得。如(Morimoto等人，1996.Proc Natl Acad SciUSA.935653-8；Schnell等人，1994.EMBO J.134195-203；Yan等人，2002.J Neurovirol.8345-52)所述制备病毒悬液。简言之，一日龄的乳鼠通过IC途径被感染10μl的病毒样品。当垂死时，处死小鼠且移除脑。通过在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中均质化脑来制备20％(w/v)的悬浮液。匀浆被离心以移除碎片且收集上清液并且在-80℃储存。幼仓鼠肾(BHK)细胞在DMEM中培养。抗RV N单克隆抗体802-2(Hamir等人，1995)从Dr.Charles Rupprecht，Center forDisease Control and Prevention获得。抗RV G多克隆抗体在兔中如(Fu等人，1993.Antisense Research and Development，687-93)所述制备。
小鼠初级神经元培养物 使用如所述(Adamec等人，2001.Brain Res.Protocol7193-202；

等人，2005.J.Virol.7910063-10068；Wang等人，2005.J.Virol.7912554-12565；Example II)的标准化程序来制备小鼠初级神经元培养物。妊娠16天的Swiss-Webster小鼠被实施安乐死且移除胚胎。从这些胚胎收集新皮质且用胰蛋白酶进行消化，将分离的神经元细胞放置到用聚-D-赖氨酸(50μg/ml)处理的培养孔内。在37℃下在5％CO2-95％的加湿气氛中在补充有2％B-27、500mM谷氨酰胺、25mM谷氨酸、10％胎牛血清和1％马血清的神经基质培养基中生长初级神经元。在接种1天和5天后添加最终浓度为1μM的阿糖胞苷(胞嘧啶呋喃并-阿糖胞苷)以防止非神经元细胞增殖。
动物感染和组织收集 4-6周大的ICR小鼠(Harlan)被放置于College of VeterinaryMedicine，University of Georgia，动物设施中的温控和光控的小区中。它们能够随意地获取食物和水。小鼠通过IC途径被感染10 ICLD50的每种病毒。或者，小鼠在后腿(两侧)通过IM途径被感染不同剂量的RV。每天两次持续20天观察狂犬病的发展。包括假感染的小鼠作为对照。在严重麻痹是或在病毒感染后的不同时间点，用氯胺酮/甲苯噻嗪以0.2ml的剂量将小鼠麻醉且然后通过心内注射PBS来进行灌注，之后灌注10％的中性缓冲福尔马林，如(Yan等人，2001.JNeurovirol 7518-527；Yan等人，2002.J Neurovirol.8345-52)所述。从通过IC感染的小鼠仅移除脑，而从IM感染的小鼠收集脊髓和脑。所收集的组织在4℃被放置于相同的固定剂(10％中性缓冲福尔马林)中一周。组织被石蜡包埋且获得冠状切片(4μm)并将其置放于载玻片上。
确定病毒滴度，LD50，和致病指数 如(Fu等人，1996.Antisense Res Dev，687-93)所述在BHK细胞中确定病毒滴度。简言之，病毒制剂在96孔板中被连续(10倍)稀释且向每个孔内添加细胞悬浮液。在37℃下培育24小时后，在80％的丙酮中固定感染的细胞且用FITC-缀合的抗RV抗体(FujiRab，Malvin，PA)来检测病毒抗原。在荧光显微镜下计数感染病灶且计算为每毫升的病灶形成单位(ffu)(ffu/ml)。所有滴定一式两份执行且使用平均感染病灶来确定病毒滴度。个别病毒的LD50通过如(Morimoto等人，2001.Vaccine.193543-51)所述通过IC或IM途径感染4至6周大的ICR小鼠来确定。实质上，病毒在DMEM中被连续稀释(10倍)且10μl的每种稀释液用于感染每个小鼠。对于每种病毒稀释液，使用10个小鼠。每天两次持续20天观察感染动物的狂犬病的发病(麻痹和死亡)。如Reed等人，1938.The American Journal of Hygine27(3)493-497所述计算IC或IM LD50。通过以下公式来确定RV致病指数logICLD50/ml除以log病毒滴度/ml，如(Morimoto等人，1998.Proc NatAcad Sci USA.953152-3156；Morimoto等人，2001.疫苗.193543-51)所述。
组织病理学检测和免疫组织化学检测 通过用H&E或甲酚紫来染色石蜡包埋组织切片以执行组织病理学检测。根据空泡化、炎症和坏死的程度评定病变的严重程度。病变被归类为++++(最严重)、+++(严重)、++(中度)、+(轻度)或-(无)。
对于免疫组织化学检测，石蜡包埋脑和脊髓组织切片在70℃加热10分钟，然后被浸渍于Hemo-De中持续3×5分钟且被干燥直至呈垩白色。在37℃用蛋白酶K来温育载片(20ug/ml在10mM tris，HCL中pH 7.4-8.0)持续15分钟且利用PBS冲洗3×5分钟。如先前(Yan等人，2001.J Neurovirol 7518-527)所述使用原位细胞死亡检测试剂盒，AP(Roche Scientific)来执行TdT-介导脱氧尿苷三磷酸-生物素缺口末端标记(TUNEL)以检测凋亡。简言之，将TUNEL反应混合物添加到覆有盖片的载片上且在37℃培育60分钟。向每个载片添加转换子-Ap(Converter-AP)(大约100μl)且在37℃再次被温育30分钟。用PBS冲洗载片3×5分钟且添加底物(NBT和BCIP)或Vulcan Fast Red(Biocare)。在显色后，用甲基绿或苏木精对载片进行复染且用封固剂进行固定。计数TUNEL阳性细胞且通过单因素ANOVA和t检验(Student’s t-Test)来进行统计分析。
对于病毒抗原检测，用抗RV N单克隆抗体(802-2)(Hamir等人，1995.Vet Rec 136295-296)或用抗RV G多克隆抗体，如之前(Yan等人，2001.J Neurovirol 7518-527)所述，温育组织载片。所用第二抗体为自VectaStain试剂盒(Vectorlab)的生物素化羊抗小鼠或羊抗兔IgG。然后添加亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)来定位生物素化抗体。最后将二氨基联苯胺(DAB)用作底物来进行显色。首先用抗RV抗体之后通过TUNEL测定检测脊髓切片来进行双标记。
结果 重组RV的致病性主要由G决定 在这个研究中，使用四种亲代病毒(SN-10、B2C、N2C和SHBRV)和三种重组病毒(RB2C、RN2C和RSHBRV)来确定RV G与致病性之间的关联性。在四种亲代病毒中，SHBRV是从人患者分离出来的wtRV(Rupprecht等人，1997.J Neurovirol.Suppl 1S52-3；Morimoto等人，1996.Proc Natl Acad Sci USA.935653-8)，且在过去的15年中与美国的大多数人狂犬病病理相关联。其它的三种病毒为实验室驯化的病毒。N2C和B2C分别通过在神经母细胞瘤和BHK细胞系中传代从CVS-24分离出(Morimoto等人，1998.Proc Nat Acad Sci USA.953152-3156)。SN-10是通过反向遗传学技术从疫苗株SAD-B19所产生的克隆(Schnell等人，1994.EMBO J.134195-203)。通过反向遗传学，使用SN-10病毒基因组骨架，用自B2C、N2C或SHBRV的G基因取代G基因来获得三种重组病毒(RB2C、RN2C和RSHBRV)(Morimoto等人，2001.Vaccine.193543-51)。
为了确定致病性，分别在BHK细胞和小鼠(通过IC感染途径)测量不同病毒悬液的病毒滴度和ICLD50。特定病毒的致病指数是logICLD50/ml除以BHK细胞中的log病毒滴度/ml(Morimoto等人，1998，2001)。这些病毒中的每种病毒的病毒滴度ICLD50和致病指数总结于表9中。在所测试的七种病毒中，SHBRV和N2C是最强的致病病毒，按照以下次序RSHBRV、RN2C、B2C、SN-10和RB2C。总之，发现重组病毒的致病性比亲代病毒更弱。然而表达诸如SHBRV和N2C的致病病毒的G的重组病毒的致病性比诸如B2C和SN-10.的减毒株更强。这些结果表明G是病毒致病性的主要决定簇。
在用减毒病毒IC接种的小鼠中观察到比用致病病毒IC接种的小鼠中更多的凋亡细胞 为了检查病理病变，小鼠被感染10ICLD50的每种病毒且在小鼠出现麻痹时收获脑。自被感染了每种病毒的4个小鼠的脑片用苏木精和伊红(H&E)染色。还包括自假感染的小鼠的脑片。总之，病理变化包括凋亡、坏死、炎症、空泡化以及神经胶质增生(图9)。评定每种病毒的组织病变的严重程度且总结于表9中。在感染了B2C和RB2C的小鼠中观察到最严重的组织病理变化，而SN-10、N2C、RN2C和RSHBRV感染的小鼠具有中度组织病理变化。感染了SHBRV的小鼠具有最轻的组织病理变化。为了量化凋亡，通过使用TUNEL滴定来检查感染了每种病毒的4只小鼠的脑片的凋亡。还包括自假感染小鼠的脑片。在自每个小鼠的大脑皮质、海马、丘脑、下丘脑、脑干和小脑中计数TUNEL阳性细胞且获得从每种病毒的四只动物的平均数且通过单因素ANOVA和t检验进行统计分析。如表9中所总结，在假感染动物中观察到较少的凋亡细胞。在感染了这些病毒中的每种病毒的几乎所有动物中观察到凋亡细胞。然而，统计分析揭示出通过任一检验，感染了SHBRV的小鼠中的凋亡细胞的数据并不显著地不同于假感染动物中的数目。通过单因素ANOVA，发现在感染了B2C、RB2C、SN-10和RSHBRV的小鼠中观察到显著地多于感染了N2C或RN2C的小鼠中的凋亡细胞(p<0.05)。然而，t检验揭示出在感染了B2C、RB2C、SN-10、RSHBRV、N2C和RN2C的小鼠中观察到显著多于假感染的小鼠中的凋亡细胞(p<0.05)。而且，B2C和RB2C在统计上不同于(p<0.05)所有其它组。总之，重组病毒诱导与G所源于的亲代病毒类似的凋亡量。减毒病毒(B2C、RB2C和SN-10)诱导比致病病毒(SHBRV、N2C、RN2C和RSHBRV)更多的凋亡。因此凋亡诱导与致病性逆相关(图10)。这些数据说明凋亡是宿主防御反应的一部分，其一般通过限制病毒扩散到脑内而在狂犬病毒感染中起到保护作用。
在感染了减毒病毒的小鼠中检测到比感染了致病病毒的小鼠中更高的G表达水平 上述研究表明RV G是凋亡诱导的主要决定簇。为了判断凋亡诱导是否与G表达水平相关，如在先前(Morimoto等人，1999.J Virol73510-518；Yan等人，2001.J Neurovirol 7518-527；Faber等人，2002.J Neurovirol 7518-527)所报道，通过免疫组织化学分析来检查病毒抗原(G与核蛋白质[N])。评定G与N表达水平且结果总结于表9中。RV G在B2C-和RB2C感染的小鼠中大量地表达；在SN-10-、N2C-和RN2C-感染动物中检查到G的中度表达水平，而G表达在感染了SHBRV和RSHBRV的小鼠中最小。在重组病毒中的G表达水平类似于G所源于的亲代病毒中的表达水平。另一方面，N表达水平在感染了这些病毒中的每种病毒的动物中类似。在海马中的几乎所有神经元，特别是在CA3区域中，检测到N抗原，但抗原染色的强度在感染了SHBRV的小鼠中比感染了其它实验室驯化病毒的小鼠中更弱(图9)。自SHBRV或B2C感染的小鼠的脑提取物也经受PAGE和蛋白质印迹分析，发现在SHBRV感染的小鼠中的G表达水平始终低于B2C感染的小鼠三倍，而N表达水平在感染了任一病毒小鼠中类似(Wang等人，2005.J.Virol.7912554-12565；Example II)。这些结果表明G表达水平与特定RV株相关联且可与凋亡诱导相关。
在感染了减毒病毒的初级神经元中观察到比感染了致病病毒的初级神经元中更多的凋亡细胞 为了判断小鼠脑中的凋亡诱导是否与体外研究相关，如(Adamec等人，2001.Brain Res.Protocol 7193-202；Li等人，2005.J.Virol.7910063-10068)所述制备初级神经元培养物。在接种后第7天，培养的神经元以每细胞0.1ffu的感染复数(moi)感染七种病毒中的每种病毒且利用4％的多聚甲醛固定细胞且在感染后(p.i.)第5天用FITC-结合的RV抗体或用TUNEL测定进行染色，如(Morimoto等人，1999.J Virol.73510-518)所述。在感染后第5天，神经元显示出这些病毒中的每种病毒的几乎100％的感染。为了测定凋亡，对于每种病毒一式三份执行TUNEL测定。在6个40x视野(field)中确定凋亡神经元的百分比且呈现于图11中。通过单因素ANOVA对数据进行统计分析。仅感染了CVS-B2C、RB2C、SN-10或RSHBRV的神经元具有比未感染的神经元显著更多的(p<0.05)凋亡，而感染了SHBRV、CVS-N2C、RN2C的TUNEL-阳性神经元的数目并不显著地多于未感染的神经元。t检验揭示了在RN2C-感染的培养基中比假感染的培养基中显著更多的凋亡神经元且在B2C感染的神经元中检测到比感染了任何其它病毒的神经元显著更多的凋亡细胞(p<0.05)(数据未示出)。总之，在初级神经元中的凋亡诱导与这些病毒所感染的小鼠中的凋亡诱导相关。
减毒RV和wt RV在肌内(IM)感染后诱导不同的临床表现 为了考察凋亡诱导减弱RV致病性的机制，通过IM使小鼠感染RV且在脊髓和脑中监控病毒扩散。选择两种病毒SHBRV和B2C。最初通过向两个后腿内接种来确定每种病毒的IMLD50。图12显示出当小鼠分别以103ffu感染SHBRV或以103、104、105、106ffu感染CVS-B2C时小鼠的存活曲线。以103ffu，SHBRV杀死90％的被感染的小鼠。然而，仅10％的被感染了B2C的小鼠死于此剂量的狂犬病。死亡率随着B2C的剂量增加而增加。以106ffu的剂量，80％的被感染了B2C的小鼠死于狂犬病。这些数据表明B2C是减毒病毒且需要比SHBRV多3个数量级的病毒来通过IM杀死同样百分比的动物。
在感染这两种病毒的小鼠中临床表现是不同的。在感染了B2C(106ffu)的小鼠中，在感染后第4天观察到第一种病征为，皮毛折皱。在感染后第5天，小鼠出现局部麻痹且在感染后第6天一个或两个后肢出现迟缓性麻痹。随着病情发展观察到驼背，之后为前肢的麻痹。然后，随着肌肉质量的损失(消瘦)小鼠变得衰竭且最后在感染后第7天开始死亡(图12)。另一方面，在感染了SHBRV的小鼠中，并未观察到皮毛折皱。在感染后第6天开始观察到麻痹。在SHBRV感染的小鼠中的麻痹不同于在B2C感染的小鼠中所观察到的情形。B2C感染的小鼠出现迟缓性麻痹而在SHBRV感染的小鼠中观察到痉挛麻痹。没有自愿的关节运动，但非自愿痉挛是常见的，且腿的刺激通常诱发回缩反射。随着病情发展，小鼠对噪音出现超敏反应且将有力地跳跃或自旋直至崩溃。在这种情形下，某些小鼠快速地恢复而其它小鼠将很快死亡。感染了SHBRV的小鼠在感染后第8天开始死亡(图12)。
减毒RV在脊髓中诱导凋亡而wt RV并不诱导凋亡 为了监控病毒扩散和凋亡诱导，小鼠通过IM感染了103ffu的SHBRV，或103、104、105和106ffu的B2C。在感染后第3天、第5天、第7天和第9天，在经心灌注后收集脑和脊髓。组织(每组4只小鼠)被石蜡包埋且被切片用于检测CD3阳性T细胞、凋亡和病毒抗原表达。在感染后第1天和第3天未检测到炎症细胞。在感染后第5天在用103ffu的B2C感染的小鼠的脊髓中仅观察到很少的CD3阳性T细胞。当用104ffu的B2C感染小鼠时，在脊髓中观察到更多的CD3-阳性T细胞，特别是在感染后第5天和第7天。当小鼠被感染105ffu的B2C时，在脊髓中观察到更多的CD3阳性T细胞，特别是在感染后第7天。被感染了106ffu B2C的小鼠在考察周期期间显示出最多的CD3-阳性T细胞。另一方面，在感染了103ffu SHBRV的小鼠的脊髓中发现很少的CD3阳性T细胞。在假感染的小鼠中并未检测到CD3阳性细胞(表12)。
表12.在通过IM途径感染了B2C或SHBRV的小鼠中观察到的CD3阳性细胞的数目 病毒/剂量 CD3阳性细胞的数目(平均值+SD)脊髓 感染后的天数 5 7 9 B2C 1030.6+0.5 1.0+0.7 0 B2C 1043.0+2.2 3.5+1.3 1.3+0.5 B2C 1051.3+0.5 12+8.03.0+2.1 B2C 1068.0+4.8 4.5+2.9 16+8.3 SHB 1030.8+0.8 1.5+1.7 1.8+2.2 对照 0 由于在感染后第3天既没有观察到凋亡也没有观察到病毒抗原，因此对于这个时间点并未提供任何数据。在脊髓和脑中的凋亡和抗原的检测分别总结于表10和表11中。当小鼠被感染103的B2C时，在25％的小鼠中的脊髓中在感染后第5天检测到RV抗原。然而，仅在很少的神经元和它们在脊髓中的神经元突起(process)中检测到RV抗原且在脑中并未检测到RV抗原。
而且，在感染了103ffu的B2C的小鼠的脊髓中仅观察到很少的TUNEL阳性细胞。当小鼠被感染104ffu的B2C时，在感染后第5天在50％的小鼠的脊髓中检测到RV抗原且当与感染了103ffu的B2C的小鼠相比时被感染的神经元的数目增加。此外，在脊髓中观察到更多的凋亡细胞，特别是在感染后第5天。在感染后第7天和第9天，凋亡细胞的数目减少。在感染了105ffu的B2C的小鼠中，75％的动物在脊髓中，50％的小鼠在脑中观察到RV抗原。在脊髓中，大约50％的神经元被感染。在脑中，在髓质的许多神经元中检测到RV抗原，但在大脑皮质中仅很少的神经元中和在小脑中很少的浦肯野细胞中检测到RV抗原。在脊髓以及在脑中观察到中等数目的凋亡细胞，特别是在感染后第7天。当小鼠被感染了106的B2C时，在所有感染动物的脊髓中和在大多数动物(75％)的脑中检测到RV抗原。在感染后第7天在大多数神经元(80％)和在它们在脊髓灰质中的神经元突起中检测到广泛的RV抗原染色。在脑中，也在髓质中的大多数神经元中、小脑中的20％的浦肯野细胞中和大脑皮质和丘脑/下丘脑的大约10％的神经元中观察到RV抗原。而且，在感染后第5天在中等数目的神经元中检测到凋亡且在感染后第7天和第9天检测到广泛的凋亡(表10，图13A)。
另一方面，当小鼠被感染了103的SHBRV时，在所有动物的脊髓中和在大部分动物(75％)的脑中检测到RV抗原。在脊髓中，RV抗原在神经毡中比在核周体中更显著。在脑中，在感染后第7天和第9天在大部分脑区域中大约50％的神经元中，包括髓质、小脑、海马和大脑皮质，检测到RV抗原。尽管在所有动物的脊髓中都检测到病毒抗原，但在感染了103ffu的SHBRV的小鼠的脊髓或脑中检测到很少的凋亡(表10，图13B)。在假感染的小鼠中未检测到凋亡(图13C)。
为了确认被感染的神经元经历凋亡，在脊髓中执行双标记以检测病毒抗原和凋亡细胞。如在图13D中所示，在感染了B2C的小鼠中检测到双标记神经元。而且，在感染了B2C的小鼠的脊髓中观察到核染色质凝缩与噬神经现象(图13E)，但在假感染的小鼠或感染了SHBRV的小鼠中并未观察到(数据未显示出)。
讨论 凋亡诱导与RV G表达相关联，特别是与G表达水平相关联(Morimoto等人，1999.J Virol 73510-518；Yan等人，2001.JNeurovirol 7518-527；Faber等人，2002.J Neurovirol 7518-527)。使用一组(panel)重组RV，展示出凋亡诱导主要由G决定。G基因还决定G表达水平。重组RV与G所源于的亲代病毒表达类似的G水平且诱导类似的凋亡水平。举例而言，亲代N2C和重组RN2C表达低水平的G且仅检测到很少的凋亡细胞。另一方面，亲代B2C和重组RB2C表达高水平的G且诱导广泛的凋亡。G表达水平并不是由于病毒复制的速率，因为N表达水平在感染这些病毒的每种病毒的动物中类似且在几乎所有的神经元中特别是在海马区域中检测到N抗原。然而，重组RSHBRV诱导比亲代SHBRV显著更多的凋亡，但G表达水平在感染了任一种病毒的小鼠中同样较低。虽然仅自CVS的RV G显示出诱导细胞培养基中的凋亡(Préhaud等人，2003.J Virol.7710537-47)且表达G的两个拷贝的重组RV诱导比表达G的单个拷贝的RV更多的凋亡(Faber等人，2002.J Neurovirol 7518-527)，但近来据报道仅RV基质(M)蛋白质也能够诱导神经母细胞瘤细胞中的凋亡(Kassis等人，2004.J Virol.786543-55)。此外，自诸如水泡性口炎病毒的其它弹状病毒(Kopecky等人，2001.J Virol.7512169-81；Kopecky等人，2003.J Virol.775524-8)和感染性造血坏死病毒的M蛋白质据报道也能诱导凋亡。在SN-10骨架中的M可能造成RSHBRV感染的小鼠中凋亡诱导。然而，两种重组RB2C和RN2C分别诱导比亲代B2C和N2C更少的凋亡(虽然并不显著)，而重组RSHBRV诱导比亲代SHBRV显著更多的凋亡。这些结果可表明G和M可独立地诱导凋亡(Préhaud等人，2003.J Virol.7710537-47；Kassis等人，2004.J Virol.786543-55)且G与M之间的相互作用也造成RV感染中的凋亡诱导。
还发现特定RV株诱导凋亡的能力与其致病能力逆相关(Morimoto等人，1999.J Virol 73510-518；Yan等人，2001.JNeurovirol 7518-527；Pulmanausahakul等人，2001.J Virol.7510800-7；Faber等人，2002.J Neurovirol 7518-527)。总之，在本研究中所测试的七个亲代RV和重组RV中，凋亡诱导与致病性逆相关(参看图10)。诸如B2C的减毒病毒诱导广泛的凋亡，而SHBRV在成年小鼠中诱导很少的凋亡。而且，很少的SHBRV病毒颗粒杀死感染动物而B2C需要1000至10000倍更多的病毒颗粒来杀死感染的动物(参看表9和图10)。因此，我们的研究确认之前的假设凋亡诱导是RV感染中的宿主防御机制(Morimoto等人，1999.J Virol 73510-518；Yan等人，2001.J Neurovirol 7518-527)。然而，凋亡诱导保护RV感染动物的机制尚未完全明了。诸如B2C的减毒RV可能通过诱导凋亡来防止病毒在CNS内扩散。为了研究这种可能性，小鼠通过IM途径被感染了不同剂量的B2C且监控在CNS中的凋亡诱导和病毒扩散。发现较低剂量的B2C导致限于脊髓的轻度RV感染且脊髓神经元的感染诱导凋亡。这可能解释为何RV抗原在小鼠中仅很少的神经元中检测到。因此，我们假设G介导凋亡诱导限制减毒狂犬病毒在小鼠的CNS中的扩散。虽然减毒的RV当以较低的剂量给药时并不造成明显的神经征状和死亡，但尚不清楚脊髓中凋亡诱导是否与轻微的步态异常或行为改变相关联。
相比之下，感染了低剂量的SHBRV的小鼠诱导很少凋亡，尽管在大多数被感染的小鼠中检测到病毒抗原。而且，低剂量的SHBRV导致扩散到脑内和临床狂犬病的发病。因此，我们的研究说明凋亡诱导是RV感染中的宿主防御机制，其防止病毒从脊髓扩散到脑。然而，感染了高剂量的减毒RV的小鼠出现神经系统疾病且死于狂犬病。因此，凋亡诱导可一方面具有保护功能，但也可在另一方面在发病机制中起到一定作用，特别是在实验上通过IC途径感染了高剂量的减毒RV的动物中(Jackson等人，1997.J Virol 715603-5607；Theerasurakarn等人，1998.J Neurovirol 4407-414)。
除了凋亡诱导外，其它病理变化，特别是炎症反应，也在感染了减毒RV而不是致病RV的动物中检测到。在我们之前的研究中，在感染了减毒B2C和SN-10小鼠中检测到显著高于感染了致病SHBRV和N2C的小鼠中的CD3阳性细胞(Li等人，2005.J.Virol.7910063-10068；Wang等人，2005.J.Virol.7912554-12565；ExampleII)。T细胞的侵润据报道不仅在阻断RV扩散(Camelo等人(2001).JVirol.753427-34；Baloul等人(2003)Biochimie.85777-88)，而且在从CNS清除RV(Hooper等人(1998).J Virol.723711-9)方面起到主要作用。近来，我们(Wang等人，2005.J.Virol.7912554-12565；Example II)和其他人(Préhaud等人，2005.J.Virol.7912893-12904)也证明了减毒RV诱导强先天免疫反应，诸如IFN-α/β和炎症细胞因子和趋化因子的上调。而且已显示出被神经元吸收的病毒决定神经侵染性(Faber等人(2004).Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.10116328-32)，因为SHBRV在体外需要比减毒SN-10更短的时间来感染50％的细胞。因此，多种因子可参与决定RV神经侵染性和因此造成的致病性。
在本研究中，在通过IC或IM途径感染了高剂量的减毒RV，特别是B2C的小鼠中观察到包括凋亡、炎症反应以及神经胶质增生的严重的病理变化。另一方面，在感染了诸如SHBRV的致病RV的小鼠中仅观察到的轻度病理变化。在感染了致病RV的小鼠中所观察到的轻度病理变化类似死于狂犬病的人患者中所观察的情况(Murphy(1977)Arch Virol 54279-297)。而且，感染了SHBRV的小鼠出现与感染了B2C的小鼠的临床表现不同的临床表现。感染了B2C的小鼠出现了皮毛折皱、重量减轻以及迟缓性麻痹。噬神经细胞、炎症和神经胶质增生的存在，特别是在脊髓中，与在感染了B2C的小鼠中所见的和其它病毒感染，诸如感染了西尼罗病毒的人中所报道的愈来愈严重的迟缓性麻痹的临床观察相关(Kelley等人(2003).Am J ClinPathol.119(5)749-53)。另一方面，感染了SHBRV的小鼠对于环境刺激产生超敏反应且在没有任何明显征兆的情况下突然死掉。此外，感染了SHBRV的小鼠出现痉挛麻痹，这在先前在小鼠的实验野生型狂犬病毒感染中报道过(Jackson(1989)Neuropathol Appl Neurobiol 15459-475)。基于这些发现，我们提出致病RV和减毒RV采用不同的机制来诱导神经系统疾病。在特别是以高剂量感染了减毒RV的小鼠中，凋亡和可能炎症在神经系统疾病发病方面起到主要作用。凋亡和炎症的诱导与在这个研究中以及其它人(Morimoto等人(1999)J Virol73510-518，Yan等人(2001)J Neurovirol 7518-527，Préhaud等人(2003).J Virol.7710537-47，Faber等人(2002)J Neurovirol 7518-527；Faber等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.10116328-32，Wang等人，2005.J.Virol.7912554-12565；Example II)所报道的研究中显示出与G表达水平相关联。致病RV如何诱导神经系统疾病而不造成严重的病理变化仍然待确定。
表9在感染不同RV的小鼠的CNS中病毒滴度，ICLD50，IC致病指数，组织病理评定，凋亡细胞的数目以及病毒抗原的表达

*在取自每个小鼠的皮质、海马、丘脑、下丘脑、脑干以及小脑中计数TUNEL-阳性细胞且获得自四个动物每种病毒的平均值且通过单因素ANOVA进行统计分析。


与对照的结果显著不同(P<0.05)

根据严重程度评定病理病变。+++表明超过50％的神经元受到影响的广泛病理病变。++表明25-50％的神经元受到影响的可以观察到的病理病变。+表明10-25％神经元受到影响的轻度病理变化，而-表明无病理变化。根据免疫染色强度和海马区域中受影响的神经元的数目来评定抗原表达水平。++++表明在几乎所有神经元受到影响的情况下的强免疫染色。+++表明超过50％神经元受到影响的强免疫染色，或几乎所有神经元受到影响的微弱染色。++表明大约25％的神经元受到影响的弱染色。+表明大约10％神经元受到影响的弱染色。-表明未检测病毒抗原。
表10.在通过IM途径感染了B2C或SHBRV的小鼠中观察的凋亡细胞的数目

小鼠(每组四个)被感染不同剂量的RV且在感染后的不同时间点收获脊髓以及脑进行TUNEL测定以检测凋亡。在脊髓中的六个视野或髓质、大脑皮质和小脑的六个视野中计数凋亡细胞。示出凋亡细胞的平均数和标准偏差。

实施例V 表达干扰素(IFN)和趋化因子的重组狂犬病毒 由于我们的研究发现先天免疫反应，特别是IFN和趋化因子的激活进一步减弱RV毒力，因此我们将IFN(α5和β)和趋化因子基因(MIP-1α、RANTES和IP-10)克隆到两个不同的基因组内。
构建表达IFN和趋化因子的重组HEP狂犬病毒 小鼠IFN-β和趋化因子(MIP-1α、RANTES和IP-10)通过RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)从小鼠脑扩增且被克隆到pHEP-3.0内(来源于狂犬病毒株flurry HEP的感染性克隆)。HEP是最大程度减毒的狂犬病毒中的一种且在世界的多个部分被用作狂犬病毒疫苗的疫苗株。IFN或趋化因子基因中的每一个插入于狂犬病毒基因组中G基因与L基因之间。HEP-MIP1α的实施例在图14中示出。
表达IFN和趋化因子的重组狂犬病毒的恢复 在BSR细胞中恢复重组病毒，BSR细胞用重组质粒(pHEP-MIP-1α、pHEP-IFN-β、pHEP-RANTES和pHEP-IP10)中的每个重组质粒以及表达N、P和L的质粒转染。利用抗狂犬病毒N抗体通过免疫荧光抗体测定来确认这些重组狂犬病毒的恢复。通过获得重组病毒基因组RNA和对所插入的基因进行测序进行这些重组狂犬病毒的确认。所有这些重组病毒均被成功地恢复。
比较亲代病毒与重组狂犬病毒之间的生长特征 为了比较亲代狂犬病毒与重组狂犬病毒之间的生长特征，BSR细胞被以相同的剂量感染这些病毒中的每种病毒。在感染后1天、2天、3天、4天和5天，从上清液来确定病毒滴度。发现这些重组狂犬病毒中的每种病毒具有与亲代病毒类似的生长曲线(图15)，表明这些重组狂犬病毒具有与亲代病毒类似的生长特征。换言之，在狂犬病毒基因组中额外基因的表达并不影响细胞培养中对于疫苗的研制非常重要的病毒的生长和产量。
确认重组病毒在感染细胞中产生预期趋化因子 为了确认重组狂犬病毒表达预期产物，用重组病毒HEP-MIP1α感染NA细胞。在培育24小时后，收获培养基上清液并且通过MIP-1αELISA试剂盒来测定MIP-1α的表达。如在图16所示，MIP-1α仅在感染了重组狂犬病毒HEP-MIP1α的细胞中表达，但不在模拟感染细胞或感染了亲代病毒(rHEP)的细胞中表达。这表明重组狂犬病毒能够产生预期产物。对于其它重组狂犬病毒，确认仍需进一步确定。
构建表达IFN和趋化因子的L16-G狂犬病毒 两个IFN(α5和β)和两个趋化因子基因(MIP-1α和IP-10)也被克隆到L16-G基因组内，因为L16-G实质上为SAG2且是最大程度减毒的RV。选择这些基因(α5和β，MIP-1α和IP-10)是因为它们在感染了减毒RV的小鼠中的高表达水平，但在有毒RV感染的小鼠中不具有高表达水平。我们使用在G与L之间具有独特Hpal位点的构建体pGEM-GHL，且在具有适当基因启动和终止的HpaI位点以及在基因间位点克隆IFN或趋化因子基因。在确认后，用XhoI消化所得质粒并将片段被克隆回到pL16-GΔXhoI。至今，我们获得了感染性克隆L16-G/IFNA5、L16-G/IFNB、L16-G/MIP1A和L16-G/IP10。此外，L16-G/MIP1A重组病毒已被选择且确认为具有正确的插入且体外鉴定显示出这种重组病毒在BSR细胞中生长至与亲代病毒L16-G类似的滴度。
实施例VI 用作疫苗的表达干扰素(IFN)和趋化因子的无毒力狂犬病毒的研制 为了增强活无毒力RV疫苗的免疫原性，干扰素(例如，IFN-β)或选择趋化因子基因可被克隆到无毒力RV基因组内，如实施例V中所显示。这些重组病毒可进行生长特征和稳定性方面的体外鉴定。这些构建体也可在体内测试相关IFN-β或趋化因子的表达，先天免疫反应的激活和获得性免疫反应的增强以及针对有毒RV的攻击性感染的保护。
我们选择L16-G作为克隆IFN和趋化因子基因(实施例V)的骨架，因为L16-G实质上为SAG2(I组病毒)且因此通过任何接种途径并不诱导成年动物的任何疾病。病毒能够侵入第一级的神经元(firstorder of neuron)(运动神经元或感觉神经元)，但第二级的神经元的侵入被抑制。病毒复制限于局部注射位点且并不扩散到相邻区域，即使在向海马内直接立体定向注射后。而且，我们将构建表达IFN和趋化因子的重组G1N2病毒作为II组病毒。这些病毒应增强获得性免疫反应，因为G被重新的定位到第1位置。因为R在G突变为E，因此我们预期I组构建体和II组构建体并不具有任何毒力。由于IFN(大约200个残基)和趋化因子(70-90个残基)为小肽，因此可构建融合蛋白质，其中IFN和趋化因子中的每一个与GFP融合(III组病毒，图17)。表达这些融合蛋白质的重组RV可传递IFN或趋化因子且也提供体内病毒检测的适宜方式。
IV组病毒基于L16，其是SAG2来源的亲代病毒(Flamand等人，1993.Trends.Microbiol.1317-320)。L16病毒具有残余毒力且可通过IC攻击而诱导成年小鼠的神经系统疾病。我们构建这组病毒是出于比较目的。此外，我们还早已构建了带N突变(pL16G、pL16N和pL16Q)(V组病毒)，带N和G突变(VI组病毒)以及G被重新定位到第1位置(pG1N2)的重组感染性克隆。据Flanagan等人(Flanagan等人，2000.J.Virol.747895-7902；Flanagan等人，2001.J Virol.756107-14；Flanagan等人，2003.J.Virol.775740-5748)报道G1N2重新定位的VSV仍诱导疾病且因此我们将构建G1N3和G1N4(VII组病毒，图18)。包括这些病毒组将允许进一步减毒。
一旦制备了构建体，将如(Wu等人，J.Virol.2002，764153-4161)所述选择重组RV。将繁殖病毒且将执行PCR和序列分析以确保这些病毒具有正确的序列。与所描述的亲代病毒L16相比，这些病毒中的每个病毒将在体外测试其复制速率(RNA印迹)、病毒产生(生长曲线)以及稳定性(每第5次传代通过RT-PCR和序列分析监控20次体外传代)。而且，BSR细胞将被感染不同浓度的(0.1、1和10ffu/细胞)这些病毒且在不同的时间收获(在感染后24、48以及72小时)。上清液将用于通过商业ELISA测试来测量IFN或趋化因子的产生。为了确保所表达的IFN或趋化因子具有生物活性，将通过其在CEF细胞中抑制表达GFP的新城疫病毒(NDV)感染的能力来测量IFN活性(Park等人，2003.J Virol.771501-11)，(由Dr.Peter Palese，Mount SinaiSchool of Medicine，NY提供)。NDV-GFP对IFN处理非常敏感。将如(Tripp等人，2001.Nat Immunol 2732-8)所述使用改良勃顿小室系统来通过其募集白细胞的能力来检测趋化因子活性。细胞沉淀将通过RT-PCR或Northern印迹杂交用于相关IFN或趋化因子转录物的蛋白质提取和评价。
已构建了大多数感染性克隆且已选择许多病毒。由于在无N突变的情况下构建表达IFN和趋化因子的重组RV，因此预期表达IFN和趋化因子的重组RV将在细胞中和亲代病毒一样良好地生长。预期重组RV将以剂量依赖性的方式表达具有生物活性的预期的IFN或趋化因子。
表达IFN-β或趋化因子的重组RV的毒力和致病性的确定 为了确定毒力和致病性，将通过IC途径向成年乳鼠(10个一组)接种102、103、104或105ffu的每种病毒。持续4周每天观察动物的狂犬病的发病。将每天监控成年小鼠的体重。将如下所述来评定迁移率和死亡率0＝正常小鼠，1＝皮毛折皱，2＝失去敏捷，3＝一只瘫痪后腿，4＝两只瘫痪后腿，5＝全身麻痹(定义为完全失去机动性)，以及6＝死亡。任何患病小鼠或要死于狂犬病的小鼠被实施安乐死且脑进行RNA提取，其将用于突变位点的PCR和测序以判断是否发生逆转。我们的目的在于研制无毒力的狂犬病毒疫苗，其表示即使通过IC感染途径接种到成年小鼠和乳鼠内也不诱导狂犬病。所有这些数据将通过T检验、X2检验或单因素ANOVA进行统计分析。
由于我们的重组病毒表达IFN和趋化因子，因此这些病毒可诱导病理病变，特别是组织病理病变，虽然它们可能不诱导显然的疾病。组织病理病变可最终导致慢性疾病。据报道趋化因子处理可限制MHV复制，但也可诱导脱髓鞘。因此，将研究我们的重组RV所诱导的病理病变。通过IC或通过IM感染了不同剂量的每种病毒的小鼠(每组4个)将在感染后第1周、2周、3周和4周被处死，使我们能够检测所表达的趋化因子的短期作用和长期作用。在灌注后，将移除脑以及脊髓用于组织分析。根据严重程度来评定病理病变。3＝超过50％的神经元受到影响的广泛病理病变。2＝25-50％神经元受到影响的可以观察到的病理病变。1＝10-25％神经元受到影响的轻度病理变化，0＝无病理变化。特定减毒将有利于凋亡、坏死、神经胶质增生和脱髓鞘(也参看D2)。如果观察到这些病变中的任一种病变，将如(Li等人，2005，J.Virol.7910063-10068；Sarmento等人，2005，J.Neurovirol.11571-81)所述对受影响的细胞执行量化且将通过统计分析与假感染的小鼠进行比较。
在这7组病毒中，I组病毒和II组病毒是我们的预期候选疫苗。I组病毒构建于SAG2的骨架上且因此即使是对于乳鼠也是无毒力的。如果这种情况发生，将表明IFN或趋化因子的表达可进一步将RV减毒。II组病毒不应诱导成年小鼠疾病且它们也可能不诱导乳鼠的疾病。虽然G1N2 VSV构建体造成感染动物的死亡，但G1N2 VSV的毒力低于亲代病毒(Flanagan等人，2000.J.Virol.747895-7902)。因此G1N2 RV的毒力可小于L16-G(SAG2)病毒。III组病毒将在体内研究中辅助病毒检测，而IV组病毒仍用于与I组病毒进行比较。IV组病毒仍可通过IC途径诱导成年小鼠的疾病，但是与L16相比仍是减毒的。如果IV组病毒并不诱导任何疾病，那么将表明IFN和趋化因子可显著地减弱RV毒力。对于V-VI组病毒，我们应展示仅在磷酸化位点的N突变是否足以使RV无毒力或是否需要在N与G上的突变来使RV无毒力。VII组病毒不应诱导成年小鼠或乳鼠的疾病，因为所有这些病毒具有在G333上的突变。如果这种情况发生，这将表明G和N在RV基因组上的重新定位可进一步使RV减毒。
表达IFN-β或趋化因子的重组RV的免疫原性的确定 为了确定免疫原性，成年小鼠(10个一组)将通过IM途径(RV免疫接种的常用途径)接种102、103、104和105ffu的每种病毒。长期以来已知针对狂犬病的保护机制是病毒中和抗体(VNA)(Hooper等人，1998.J Virol.723711-9)。为了考察重组RV的免疫原性，我们提出确定感染的病毒需要多长时间在CNS中复制，VNA反应的速度和强度。为了确定重组RV需要多长时间在CNS中复制，被感染的小鼠将在感染后第0天、第1天、第3天、第5天、第7天、第9天和第11天被处死，灌注脑和脊髓将经受免疫组织化学检测以如(Sarmento等人，2005，J.Neurovirol.11571-81；(Yan等人，2002.J Neurovirol.8345-52)所述检测病毒抗原。或者，将获得新鲜冷冻的脑和脊髓且将执行原位杂交来如(Fu等人，1993.J.Virol.676674-6681)所述检测病毒RNA。为了确定由重组RV所诱导的免疫反应的速度和强度，在接种前和接种后1周、2周、3周和4周获得血液样品以如Tims等人，2000.Vaccine.182804-7)所述测量VNA。最后，由针对致死量攻击的保护率来确定免疫原性。因此，接种的小鼠将在最后一次血液收集后一个星期被有毒的CVS-24攻击。统计分析从感染不同病毒所获得的所有数据。
应注意的是RV疫苗通常在RV暴露后与抗RV免疫球蛋白组合地给予受害者。我们预期表达趋化因子或IFN-β的重组RV可诱导先天免疫反应，当小鼠在免疫接种前即刻或免疫接种后被致死RV攻击时先天免疫反应阻断有毒病毒在CNS内扩散。表达趋化因子或IFN-β的重组RV可具有排除对供应不足的抗RV免疫球蛋白的需要的潜在可能。
总结 我们的研究显示出在磷酸化位点的N突变导致病毒复制的减少。体外病毒复制的减少可在体内被转化为RV减毒，说明N突变可导致毒力的减弱。先前的研究证明G突变可减轻神经侵染性(Lafay等人，1994，Vaccine 12317-320)。这些结果展示了通过在N和G上构建突变来研制无毒力的RV疫苗的可行性。我们的研究还表明一个氨基酸的单个核苷酸的突变易于逆转，其引导我们在一个密码子上构建至少两个核苷酸的突变。我们的研究还显示出是CK-II磷酸化感染细胞中的RV N。而且，我们的研究表明N磷酸化在RNA包裹后发生且因此我们假设N磷酸化便于下一轮病毒复制(Liu等人，2004，J Gen Virol.853725-34)。通过磷酸化位点的N突变，我们减少了病毒复制速率且因此使病毒减毒。
重要地，我们发现减毒的RV激活，而有毒的Rv逃避，宿主先天免疫反应。如微阵列技术和实时PCR所检测，参与IFN-β通路激活的几乎所有基因和炎症趋化因子中的许多因子在通过IC或IM途径感染减毒L16和B2C的动物中上调。然而，这些基因中的许多基因在感染有毒SHBRV的动物中不上调。对于在SHBRV感染动物中参与IFN-β通路上调的那些基因，增加的量值低于B2C或L16感染小鼠中至少2至30倍。
IFN的上调可具有直接的抗病毒活性。先前，报道显示出IFN处理在小鼠、仓鼠、兔或猴中针对RV感染具有各种程度的保护(Harmon等人，1974.Antimicrob Agents Chemother.6507-11；Hilfenhaus等人，1975.Infect Immun.111156-8)。Hooper等人(1998，J Virol.723711-9)报道了在IFN-β受体敲除(IFNAR-/-)的小鼠中检测到比免疫完整的小鼠中更高的RV滴度。我们还显示出有毒RV对IFN处理比减毒RV更为敏感。炎症趋化因子的上调可募集中性粒细胞、单核细胞以及淋巴细胞(Alcami，2003，Nat Rev Immunol.336-50；Rossi等人，2000.Annu Rev Immunol.18217-42)。实际上，在感染了减毒RV的小鼠的脑或脊髓中检测到比感染了有毒RV的小鼠的脑或脊髓中更多的CD3阳性T细胞(Example II；Li等人，2005，J.Virol.7910063-10068；Wang等人，2005.J.Virol.7912554-12565)。炎症反应和T细胞侵润据报道在从CNS清除RV方面起到主要作用(Hooper等人，1998.J Virol.723711-9)。而且，我们显示出脊髓中的炎症炎症反应防止RV扩散到脑内。所有这些数据表明先天免疫反应导致RV减毒。因此，我们预期RV基因组中IFN和趋化因子的表达诱导先天免疫反应且同时增强获得性免疫反应。该重组RV(某些重组RV如上文所述构建和选择)可被研制为活的且无毒疫苗。
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序列表
<110>University of Georgia Research Foundation，Inc.
Fu，Zhen
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<400>3权利要求
1.一种减毒狂犬病毒，包含可操作地编码至少一种哺乳动物免疫因子的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的减毒狂犬病毒，其中，所述多核苷酸可操作地编码多种哺乳动物免疫因子。
3.根据权利要求1所述的减毒狂犬病毒，其中，所述免疫因子选自干扰素、细胞因子和趋化因子。
4.根据权利要求3所述的减毒狂犬病毒，其中，所述干扰素包含IFN-α、IFN-β或IFN-γ干扰素。
5.根据权利要求3所述的减毒狂犬病毒，其中，所述趋化因子选自MIP-1α、MIP-1β、MCP、RANTES和IP-10。
6.根据权利要求3所述的减毒狂犬病毒，其中，所述多核苷酸还可操作地编码包含Toll样受体(TLR)或TLR衔接头分子之一或二者的免疫因子。
7.一种药用组合物，包含:
根据权利要求1所述的减毒狂犬病毒；以及
药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药用组合物，其在给予哺乳动物受试者后，在受试者中诱导免疫反应，所述免疫反应阻断或抑制致病狂犬病毒在所述受试者的中枢神经系统内扩散。
9.根据权利要求7所述的药用组合物，其用作对哺乳动物受试者进行针对狂犬病的免疫接种的活疫苗。
10.根据权利要求9所述的药用组合物，其中减毒狂犬病毒的量有效地诱导受试者中的中和抗体。
11.根据权利要求9所述的药用组合物，其中所述减毒狂犬病毒的量有效地保护所述受试者免于致病狂犬病毒的实验攻击或自然攻击。
12.一种向哺乳动物受试者接种疫苗的方法，包括向所述哺乳动物受试者给予根据权利要求7所述的药用组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述药用组合物在暴露于致病狂犬病毒前给药。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述药用组合物在暴露于致病狂犬病毒后给药。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者为人。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者是家养动物或野生动物。
全文摘要
本发明提供一种用作活疫苗的减毒狂犬病毒。该减毒狂犬病毒表达免疫因子，该免疫因子在给予活疫苗时增强免疫反应。
文档编号A61K39/205GK101384278SQ200680052741
公开日2009年3月11日 申请日期2006年12月14日 优先权日2005年12月14日
发明者傅振芳 申请人:乔治亚大学研究基金公司