专利名称：一种狂犬病疫苗去除残余dna的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体说，本发明为疫苗生产过程中一种去除残余DNA的方法。
背景技术：
目前狂犬病疫苗的提纯一般采用单一的分子筛凝胶层析或者是阴离子和分子筛相结合的 方法，这两种方法都存在着一定的缺陷
采用单一的分子筛凝胶层析方法，由于狂犬病毒分子量大于其它的杂蛋白分子量，洗脱 的过程中，在蛋白浓度较低时，狂犬病毒和杂蛋白可以被分开，但是在实际生产的过程中蛋 白的含量往往很高，样品粘稠度大，这就使得采用单一分子筛凝胶层析的方法对病毒蛋白的 分离效果不佳，难以达到国家现有的质量标准，同时存在着DNA超标的问题，制约了生.产规 模。
目前也有采用阴离子和分子筛凝胶层析相结合的方法来去除残余DNA的，用硫酸鱼精蛋 白来结合样品中残余的DNA，再用不同盐浓度的缓冲液进行梯度洗脱，收获病毒穿透峰，但 是发现硫酸鱼精蛋白在结合了 DNA的同时也结合了部分病毒糖蛋白，大大降低了抗原的回收 率，同时不同的盐浓度和pH对抗原的稳定性也有一定的影响。
本发明就解决了在纯化过程中抗原回收率低和DNA残留量高的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种提纯方法，采用非限制性核酸内切酶对DNA进行降解，结合膜 过滤和柱层析技术对狂犬病疫苗进行提纯。从而得到质量更好，纯度更高的狂犬病疫苗， 本发明的目的是这样实现的
1)在病毒原液、浓縮液或者纯化液中加入l-2000U/ml的非限制性核酸内切酶，(具体加 入量可以根据产品残余DNA的量来调整加入的比例， 一般一个单位的非限制性核酸内切酶在 标准条件下30分钟内可以降解37ug的DNA),同时加入终浓度为1-10mmol/L的Mg"化合物做 为酶的激活剂，将病毒原液、浓縮液或纯化液置于0-42'C (该酶的最适温度为37'C)中进行 DNA的降解来去除残余的DNA。2)将酶解后的制品用超滤和柱层析的方法进行洗虑、纯化，来去除制品中残余的非限制 性核酸内切酶以及降解后的DNA和杂蛋白。
本发明中所应用的非限制性核酸内切酶的特点在于1)可以降解各种类型的DNA和RNA; 2)无蛋白水解酶活性；3)能够在相当宽泛的条件范围内使用；4)具有极高的活性，高达 (>1.0*106Units/mg protein); 5)可以降低细胞裂解液的粘稠度，减少蛋白和核酸的吸附。
本发明的特点在于在浓縮液或纯化液中加入非限制性核酸内切酶，可以有效的降解掉制 品中的DNA，而不对其他成分造成任何影响，与现在大多数采用离子交换等方法来去除DNA 的相比，本方法不会对抗原造成任何损失和也不会改变抗原的稳定性。
本发明的创新之处在于，采用非限制性核酸内切酶来降解DNA，抗原回收率高，工艺容易 放大，DNA去除效果好，同时非限制性核酸内切酶还具有降低样品粘稠度的作用，降低了蛋 白的聚合，减轻了柱层析的压力，减少分离纯化的时间，保证疫苗的安全性。
本发明以狂犬病疫苗为实例，同样本发明也适用于其他种类的疫苗及生物制品来去除残 余的DNA。
具体实施方式
如下
以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。本实施例仅采用常规实验 技术，这些均是本技术领域人员所熟知的。或者按照试剂生产商提供的说明书进行。 实施例一
1. 用pellicon2系统将病毒收获液进行浓缩和部分杂质的去除。病毒收获液选自采用 Celligen Plus生物反应器连续收获的病毒收获液。首先将超滤系统清洗消毒后备用，本实 验采用pellicon2超滤系统，膜面积0. 5m2，截留分质量300KD，选取30L病毒收获液进行30
倍浓縮，浓縮至iu用e-丙内酯进行病毒灭活。 '
2. 将步骤1所得的浓縮液分成两部分进行实验，编号为①号样品、②号样品，将①号样 品采用原始工艺进行单一的超滤纯化，作为实验的对照组，所得浓缩液编号为N-1，纯化液 编号为C-1。
3. 在②号样品中按50U/ml加入非限制性核酸内切酶，同时向样品中加入终浓度为 l咖ol/L的MgCl2，将样品分别置于4X:、 20°C、 37'C中进行DNA的降解，每隔1小时进行取 样检测DNA残留量，考察时间对降解DNA的影响(如表一所示)，再将酶解后的样品用pellicon2 系统以PBS洗虑8个体积，取样检测酶的残留量、抗原含量、蛋白含量及效价，样品编号为 N-2。 —
4. 将上面二次洗虑后的浓缩液进行纯化，选用的层析系统为GE公司的AKTAprimePlus，层析柱为XK16/100，柱体积160ml，填料为s印harose 4ff (也可以为s印harose 6ff)，每 次上样16ml，用PBS缓冲液进行洗脱，收集吸收峰，样品编号为C-2，取样进行蛋白浓度 (lowery)、抗原含量(ELISA)、效价检测(NIH)、酶的残留(ELISA)、 DNA残留的检测。结 果如表二所示。
表一37'C酶解时间与DM残留量的变化
时间Oh2h4h6h
DNA残留量(pg)〉20000《100《10-
表二样品①②进行提纯后的对比结果
样品名称蛋白含量抗原含量效价DNA残留量酶残留
N-131. 5mg/ml67IU/ml25IU/ml>20ng一
N-227. 6rag/ml78IU/ml31IU/ml<50pg未检出
c-i180. 2ug/ml35IU/ml15IU/ml〉10ng—
C-2(1小时)170. 3ug/ml43IU/ml19IU/ml〈lOOpg未检出
C-2(2小时)165. 8ug/ml39IU/ml18IU/ml〈50pg未检出
C-2 (4小时)167.4ug/ml40IU/ml18IU/ml〈10pg未检出
从结果可以看出酶不仅对DNA的去除效果十分显著，还起到了降低样品粘稠度的作用， 从而使得在层析过程中更容易使抗原蛋白分离出来，提高了杂蛋白的去除率，抗原回收率得 到了显著的提高，超滤和层析的结合对酶的去除也十分理想。使得疫苗的纯度更高，更加安 全。
另外，可根据产品的特殊需要，也可将酶解反应在低温环境下进行，但在低温环境下需 要适当的延长酶解的作用时间，或相应增加酶的加入比例。下表为狂苗浓縮液在4'C和20'C 时的酶解效果比较。
4°C
时间Oh10h20h30h40h
DNA残留量(pg)〉20000《500《100《10一
20°C时间Oh5h10h20h40h
DNA残留量(pg)〉20000《500《100《10—
5实施例二
1. 准备IOL狂犬病病毒原液，将其成Y:l、 Y-2两组进行实验，其中Y-l仍采用原始工艺 进行单一的超滤纯化。
2. 向Y-2样品中按5U/ml加入非限制性核酸内切酶，同时向样品中加入终浓度为2mmol/L 的Mg3(P04)2 (为酶提供激活剂Mg"，将样品置于20。C中进行DNA的降解。
3. 4小时后再将酶解后的样品用pellicon2系统进行浓縮并以PBS洗虑8个体积。
4. 将洗虑后的样品采用柱层析的方法进行洗脱，去除样品中的杂蛋白、残余的酶和降解
后的DNA。按照实施例一的检测方法取样进行对比。
样品名称蛋白含量抗原含量效价DNA残留量酶残留
Y-l190. 3ug/ml36 IU/ml12 IU/ml〉20ng—
Y-2182. 5ug/ml40 IU/ml13 IU/ml<50pg未检出
实施例三
1. 用pellicon2系统将病毒收获液进行浓縮和部分杂质的去除。病毒收获液选自采用 Celligen Plus生物反应器连续收获的病毒收获液。首先将超滤系统清洗消毒后备用，本实 验采用pellicon2超滤系统，膜面积0. 5m2，截留分质量300KD，选取30L病毒收获液进行30
倍浓縮，浓縮至iL,用e-丙内酯进行病毒灭活。
2. 将步骤1得到的样品用柱层析的方法进行纯化，并将其分成两部分进行实验。样品标 号为C-1、 C-2。
3.向C-2样品中按1500U/ml加入非限制性核酸内切酶，同时向样品中加入终浓度为 1. 5mmol/L的(CH3COO)2Mg'4H20(为酶提供激活剂Mg2+)，将样品置于4。C^进行DNA的降解。 30小时后取样进行检测对比(方法同实施例一)。
样品名称蛋白含量抗原含量效价DNA残留量
C-1197.6ug/ml39 IU/ml16 IU/ml〉20ng
C-2188.8ug/ml41 IU/ml17 IU/ml<10pg
上面虽然以狂犬病疫苗为具体实例对本发明做了详细描述，但应认为，本发明并不局限 于狂犬病疫苗。
本实验中的蛋白含量、抗原含量、效价检测项目均按照现行《中华人民共和国药典》2005 年版三部以及2010年版的部分修改后的方法进行检査。
6DNA检测方法按照中检所现行的方法依法检测。
酶残留检测方法采用非限制性核酸内切酶ELISA检测试剂盒进行定量检测，该试剂盒可 以检测到0.2ng/ml的微量非限制性核酸内切酶。也就是说，它的检测精度相当于在其它蛋白 浓度高于0.5mg/ml时，检测水平可以达到lppm。试剂盒同大肠杆菌、毕赤氏酵母、小牛血 清、牛血清白蛋白和胎牛血清的交叉副反应的几率小于1%。该试剂盒采用对非限制性核酸内 切酶特异性的多克隆抗体(RaB)，并被附于聚苯乙烯微孔板。加入样品后，非限制性核酸内 切酶被"捕获"在微孔板上，再加入辣根过氧化物酶(RaB-POD)标记抗体。在每孔加完色原 底物TMB后，用0.2MH2S(X终止反应。结果可以在450nm下ELISA检测仪读取。 准备工作
Buffer 1洗脱液PBS，O. 5M NaCl， 0. l%Tween20， pH7. 2 成分 0. 345g sodium phosphate monobasic, 1. 065g sodium phosphate dibasic, 29.22g sodium chloride lml Tween 20
溶解于大约800ml双蒸水。调pH至7. 2.定容至1000ml 。 储存条件2-8°C 保存时间8周
Reagent B使用Reagent B (RaB-P0D)前，必须用Buffer 1以1: 100稀释。 St(Dp Reagent (终止液) 0. 2M H2S04
Standard Solutions (标准液)reagent A溶于Buffer 1，标准液被该混合液分步精确稀 释。我们建议至少稀释两步，标准液终浓度应在O. l-25ng/ml。 样品预处理样品至少应用Buffer l以h 2稀释。稀释液对检测影响可以忽 略。
检测过程(所有操作在室温20-25。C下进行)
第一步"捕获"酶
100ul的样品(参考样品预处理)，标样和对照加入至微孔板，盖上 盖子，静置2小时。注意对照试验必不可少，取100ul的溶解样 品溶液，其他操作相同，这样可以确定溶解样品的溶液是否对结果 有影响；另外，没有酶的阴性对照也不可或缺。
第二步洗脱
倒置微孔板，倒掉液体。微孔板倒置在多层吸水纸上，并小心敲击以便去除孔内残留的液体。Buffer l加满各孔，l分钟后清空，至 少反复三次。 第三步加辣根过氧化物酶标记抗体(RaB-P0D)
每孔都加入100ul Reagent B，盖上盖子，静置1小时。
第四步洗脱
按照第二步的方法进行洗脱。
第五步酶显色反应
每孔都加入60ul Reagent C，盖上盖子，避光静置15分钟。 第六步终止反应
每孔都加入140ul终止液，每孔酶显色反应时间必须一致。
权利要求
1、一种狂犬病疫苗去除残余DNA的方法，其特征是具体步骤如下1)在病毒原液、浓缩液或者纯化液中加入非限制性核酸内切酶对DNA进行降解来去除制品中残余的DNA；2)利用超滤和柱层析的方法将非限制性核酸内切酶和降解后的DNA去除。
2、 按照权利要求1所述的提纯方法，其特征是具体步骤如下1) 在病毒原液、浓縮液或者纯化液中加入l-2000U/ml的非限制性核酸内切酶，同时加 入终浓度为1-10mmol/L的Mg2+化合物做为酶的激活剂，将病毒原液、浓縮液或纯化液置于 0-42。C中进行DNA的降解来去除残余的DNA;2) 将酶解后的制品用超滤和柱层析的方法进行洗虑、纯化，来去除制品中残余的非限 制性核酸内切酶以及降解后的DNA和杂蛋白。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及疫苗生产的提纯的方法 本发明解决了狂犬病疫苗以往在生产过程中单一采用柱层析方法DNA去除难、蛋白容易聚合沉淀的问题。采用750KD中空纤维超滤柱或者300KD超滤膜将病毒收获液进行浓缩和部分杂质的去除，再用非限制性核酸内切酶对DNA进行降解，然后再通过超滤或者柱层析的方法将核酸酶去除。该方法具有容易放大、产品纯度高、DNA去除效果显著、大大提高了疫苗的安全性。
文档编号A61K39/205GK101623497SQ20091006737
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月5日 优先权日2009年8月5日
发明者华 刘, 卢志平, 巍 张, 张景芝, 徐秀芝, 杨文杰, 明 陈 申请人:长春卫尔赛生物药业有限公司