基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗的制作方法
【技术领域】
[00011本发明属基因工程领域，涉及疫苗为热失活全重组汉逊酵母细胞表达HBsAg和 HBcAg治疗乙肝疫苗。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。据世 界卫生组织(World Health 0ganization，WH0)报道，全球60亿人口中，约20亿人曾感染过 HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和 原发性肝细胞癌(肝癌）。全球肝癌患者中，75 %以上是由HBV所致。我国属HBV感染地方性流 行区。我国卫生部于1992年将乙型肝炎疫苗纳入计划免疫管理。2001年12月国务院正式批 准将乙型肝炎疫苗纳入儿童计划免疫，要求各省市自治区从2002年起，除收取少量手续费 外，给所有新生儿免费接种乙型肝炎疫苗。按照2005年3月制订的计划免疫条例，自2005年6 月1日起，所有新生儿乙型肝炎疫苗免疫完全免费。经过近15年的努力，我国一般人群，尤其 是15岁以下儿童，乙型肝炎病毒感染率明显下降。据2006年全国乙型肝炎血清流行病学调 查表明，全人群乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带率己由1992年9.75%降至7.18%，5岁以下 儿童的乙型肝炎表面抗原携带率已由原来9.67%降至0.96%。据此推算，我国现有的慢性 HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。每年因 HBV导致的肝硬化和肝 癌死亡30余万例，新发乙型肝炎病例50万-100万例。因此，本病是我国当前和今后相当长时 期内危害人民健康、阻碍社会发展、影响社会稳定的重要因素，是一个严重的公共卫生问 题，也是我国在建立以人为本的和谐社会过程中，需要优先解决的一个重大健康问题。我国 人群HBV感染的流行率高，给国家带来了沉重的经济负担。据调查.我国每年因慢性乙肝(包 括肝硬化、肝癌）的直接和间接医疗费用约6800亿元。乙肝疫苗免疫预防与治疗是降低疾病 负担最有效的方法。
[0003] 基因重组技术是现代生物技术的核心技术；也是规模化生产乙肝疫苗主要组 份--病毒样颗粒乙肝表面抗原(HBsAg VLP)的唯一技术。本专利权人从1995年开始从事 汉逊酵母重组乙肝疫苗研发工作。1998-2002年在大连高新生物制药有限公司，主持开发的 汉逊酵母重组HBsAg adw2乙肝疫苗，HBsAg VLP抗原纯品（原液)产率为40mg/升；于2002年 起经国家审批上市。2003-2006年本人为北京天坛生物制品股份有限公司协议开发的重组 汉逊酵母HBsAg-adr2乙型肝炎疫苗。其HBsAg VLP抗原纯品（原液)产率为85mg/升以上；已 于2015年申报国家新药审评，以该疫苗为基础申请的中国专利公开号为CN104232661A。
[0004] 根据现有技术查明的乙型肝炎发病机制如下:人感染HBV后，一般可分为免疫耐受 期、免疫清除期和非活动或低(非)复制期。免疫耐受期的特点是HBV复制活跃，血清HBsAg和 HBeAg阳性，HBV DNA滴度较高（>105拷贝/ml)，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平正常，肝 组织学无明显异常。免疫清除期表现为血清HBV DNA滴度>105拷贝/ml，但一般低于免疫耐 受期，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)持续或间歇升高，肝组织学有坏死炎症等表现。非活动 或低（非）复制期表现为HBeAg阴性，抗-HBe阳性，HBV DNA检测不到(PCR)法或低于检测下 限，水平正常，肝组织学无明显炎症。但在青少年和成人期感染HBV，一般无免疫耐受期，一 开始即为免疫清除期，表现为急性乙型肝炎，其中仅5%_10%发展成慢性。但其确切的发病 机制仍不了解。
[0005] 抗乙型肝炎病毒治疗是目前对乙肝病毒感染者及乙肝患者的主要治疗手段。目前 抗乙型肝炎病毒药物主要有以干扰素类为主的免疫调节剂和针对HBV DNA多聚酶的核苷酸 类似物两大类，虽有一定疗效，但尚不满意，多数患者不能被治愈。干扰素虽可使少数患者 HBsAg消失或血清学转化，但费用较高，需要注射，且有一定副作用;核苷酸类似物则作用于 HBV DNA聚合酶，只能抑制病毒复制，不能彻底清除HBV和cccDNA，且长期应用易导致病毒耐 药变异。
[0006] 因此，为了彻底清除HBV和cccDNA，亟待开发新的更有效的HBV治疗乙肝疫苗。人体 肝脏为一免疫耐受器官;肝脏移植免疫排斥反应低充分表明这一点。乙型肝炎病毒(HBV)感 染人的部位为肝脏；因此对HBV的免疫耐受为其主要特征。逆转HBV免疫耐受是开发慢性乙 型肝炎患者(CHB)免疫治疗疫苗的立足点。HBV免疫耐受不仅体现在肝脏局部anti-HBV免疫 应答不能有效清除病毒，导致持续感染;也体现在HBV持续存在，进而诱导全身性免疫系统 对HBV无应答，如HBV耐受期病人对HBsAg疫苗无应答。这也是当前治疗性疫苗在CHB病人中 难以成功的主要原因。肝脏诱导的免疫耐受及其逆转机制研究将为研制治疗乙肝疫苗提供 了理论依据。
[0007] 2005年Bowen提出：肝内的免疫环境与诱导耐受性相关，但仍保持了维持对病原体 有效反应的能力。这种二分法的机制尚不清楚。最近的数据表明，初始CD8+T(CTL)细胞活化 在肝脏内发生，同时肝脏预先有炎症（即天然免疫活化）；则存活的CTLs增多，CTLs更有效， 导致肝脏免疫应答，清除感染的HBV;而在预先肝脏无炎症（即天然免疫未活化，如婴幼儿 时），则CTL功能受损和CTL半寿命短，导致肝脏对HBV免疫耐受。然而，初始HBV抗原相遇免疫 诱导高效的主要激活HBV CTLs存在于肝脏外的淋巴结内，然后再进入肝脏，则也使存活的 CTLs增多，CTLs更有效，也导致肝脏免疫应答，清除感染的HBV。这一关于两个部位的免疫机 制为研制皮下、肌肉注射治疗乙肝疫苗，导致肝脏免疫应答、清除感染的HBV提供了理论依 据。
[0008] 2014年美国 Thomas Η · King报道："A Who 1 e Recomb inant Yeas t-Based Therapeutic Vaccine that is comprised of heat-inactivated,whole recombinant Saccharomyces cerevisiae yeast cells expressing disease-related antigens"；为 一种由热失活、全重组酿酒酵母细胞-表达与疾病相关抗原为基础的治疗性疫苗。该研究开 创了以胞内重组表达蛋白为抗原，以酿酒酵母细胞为佐剂的治疗性疫苗平台。在此平台下 已有编号为GS4774为乙型肝炎治疗性疫苗，其他表达的HBV抗原为一种作为融合蛋白的X-s-core抗原。这一酵母载体可以提供多种抗原进入MHC I类和II类抗原提呈途径，刺激强有 力的CD4+和CD8+细胞反应，并能打破免疫学小鼠模型中抗原的耐受性。该酵母载体也不容 易在体内被中和，因此适合于重复用药，使之获得长期的免疫压力，理想地清除慢性细胞内 感染，如HCV和HBV。
[0009] 2010年Huang报道：啤酒酵母细胞壁纯化而得的β-葡聚糖颗粒(GPS)，其中具有1， 3-D-glucan聚合物>85%，2%甲壳素，1%脂类和蛋白质，与其余的大部分是灰和水分。进行 的体外T细胞增殖实验中，将卵清蛋白（OVA)复合至空心GPS壳内（GP-OVA)组成的疫苗，并采 用游离OVA为对照抗原。GPS-0VA在从0.03到0.5μ克/毫升的浓度范围内，刺激0T-I或0T-II Τ细胞增殖;相反，游离OVA未能刺激0Τ-Ι或ΟΤ-ΙΙ Τ细胞性增殖。为了实现GP-0VA相似的刺 激效应，要求游离OVA浓度提高百倍至数百倍。这些结果表明：（1)病毒样颗粒GPS是Dectin-1受体的高效激动剂；（2)病毒样颗粒GP-OVA传递的抗原与游离OVA抗原相比，能被DCs (树突 细胞)更高效地处理和提呈。
[0010] 2003-2005年期间美国科学家报道了：乙肝病毒感染黑猩猩系列研究结果。控制疾 病的机制是肝细胞核HBV池的共价闭合环状DNA(cccDNA)。由于产生IFN- γ的HBV特异性⑶8 +Τ，即CTL细胞，大量涌入肝内，靶向感染HBV的肝细胞;对cccDNA的清除、肝细胞感染HBV逆 转都与肝脏⑶8+T细胞产生的IFN- γ涌入等相关。集合这些结果表明，cccDNA的清除是一个 由细胞免疫反应介导的两步的过程:第一步非细胞损伤地减少90%以上cccDNA分子池，从 而消除HBV松弛的环状脱氧核糖核酸的前体。第二步提高了这个过程中损毁受感染的肝细 胞，并触发免疫逆转。
[0011] 2014年中国科技大学博士曾筑天报道:通过水动力法建立了 HBV持续携带小鼠来 模拟HBV慢性感染者的免疫耐受状态，发现IL-12预处理与IL-12同HBsAg VLP疫苗共注射的 联合治疗方式，称为基于IL-12的疫苗疗法，可以有效逆转HBV系统性免疫耐受，进而导致 HBV清除。发现HBV小鼠经历过基于IL-12的疫苗疗法之后，淋巴结内滤泡样辅助T细胞(Tfh) 以及生发中心B细胞(GC B)都发生显著扩增，与之相对应地，脾细胞中HBsAg特异性IgG生成 细胞也显著增加，大部分小鼠在治疗后期血清中出现保护性抗体anti-HBs;此外，T细胞体 外对HBsAg刺激的增殖能力在IL-12联合疫苗治疗之后也得到显著恢复。这些结果充分证实 HBV耐受小鼠在IL-12联合治疗过程中，对外周HBsAg疫苗的应答得以恢复，从而提示HBV诱 导的系统性免疫耐受已被逆转。基于现有技术文献可以得出提供一种具有更好疗效的乙肝 治疗疫苗成为现有技术中亟待解决的问题。
【发明内容】
[0012] 为解决前述技术问题，提供一种具有更好疗效的乙肝治疗疫苗，本发明采用的技 术方案为：
[0013] 提供一种基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗， 其特征在于:所述乙肝治疗疫苗以重组汉逊酵母细胞内表达的HBsAg及HBcAg为抗原;含有 19个HBsAg特异性CTL表位和19个HBcAg特异性CTL表位;所述乙肝治疗疫苗以热灭全重组汉 逊酵母细为佐剂。
[0014] 所述乙肝治疗疫苗，其特征是所述重组汉逊酵母表达的HBsAg为adw