用汉逊酵母表达系统产生hpv31 l1蛋白的方法
【专利摘要】本发明涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV31?L1蛋白的方法。具体地，本发明公开了产生表达HPV31?L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法以及由所述方法产生的重组汉逊酵母细胞。本发明还公开了利用所述重组汉逊酵母细胞产生HPV31?L1蛋白的方法以及所产生的HPV31?L1蛋白在制备预防性疫苗中的用途。
【专利说明】用汉逊酵母表达系统产生HPV31 LI蛋白的方法发明领域
[0001]本发明属于医药生物工程【技术领域】，涉及产生HPV31 LI蛋白的方法，尤其涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV31L1蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一种无包膜的闭环双链DNA病毒，属乳多空病毒科多瘤病毒亚科，主要侵犯人体的上皮黏膜组织，进而诱发各种良性及恶性增生病变。
[0003]目前已鉴定出来的不同亚型HPV超过200种，HPV感染具有明显的组织特异性，不同型别的HPV对于皮肤和黏膜的嗜向性不同，能诱发不同的乳头状病变，大约有30多种HPV型别与生殖道感染有关，其中有20多种与肿瘤相关。根据HPV诱发病变的良恶性不同，HPV可大致分为两类:1)高危型(如 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68等):高危型HPV与人类多种组织恶性肿瘤密切相关，主要引起重度不典型增生和浸润癌；2)低危型(如HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV72、HPV81等):低危型HPV可引起表皮细胞良性增殖性性病，如尖锐湿疣和扁平湿抚等。
[0004]HPV主要由病毒外壳和基因组DNA构成。基因组长约7900bp，有8个病毒蛋白编码基因。其中6个ORF编码的蛋白在病毒复制的早期表达，称为早期蛋白；2个ORF编码的蛋白在病毒复制的晚期表达，称为晚期蛋白。晚期蛋白包括主要外壳蛋白LI及次要外壳蛋白L2,并参与病毒外壳的形成。
[0005]HPV病毒外壳蛋白能够进行自组装，在多种表达系统中单独表达的LI蛋白或将LI蛋白与L2蛋白共表达时均能自组装成病毒样颗粒(virus-like particle, VLP),其中以在酵母系统、杆状病毒昆虫表达系统及哺乳动物细胞表达系统等产生的VLP更接近天然病毒的结构。利用外源表达体系生产的VLP免疫后能够在体内诱发产生中和抗体，获得良好的免疫保护效果。
[0006]多形汉逊酵母(Hansenula Polymorpha),又称作Pichia augusta,是当前公认的最为理想的外源基因表达系统之一。多形汉逊酵母作为单细胞真核微生物，既具备原核生物生长快速、易于遗传操作等特点，又有真核细胞翻译后加工和修饰等功能。此外，汉逊酵母还具备安全性好、易于培养、成本低廉、表达量高及遗传稳定等优势，并且能够克服诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株不稳定、产量低及糖基化侧链过长以及毕赤酵母(Pichia Pastoris)外源基因整合拷贝数较低的问题。目前，应用汉逊酵母表达系统生产的药物(如胰岛素，商品名Wosulin)及HBV疫苗(商品名Hepavax-Gene)均已上市销售。
[0007]在中国发明专利公开CN102586287A及CN102719453A中公开了应用汉逊酵母表达系统表达HPV16及HPV18型别LlVLP的方法。然而关于HPV31型别的LI蛋白是否可在汉逊酵母系统中实现高效表达并组装成VLP颗粒，目前并没有公开报道。在上述2篇已公开的专利申请中，未给出HPV16及HPV18L1的外源基因整合拷贝数的结果及提高外源基因拷贝数的方法。在外源蛋白的诱导表达方面，HPV16及HPV18L1在发酵罐中的诱导时间均需超过20小时，且没有提供蛋白表达水平的具体信息。此外，作为一个重要蛋白纯化指标，关于纯化过程及纯化完成时外源蛋白HPV16及HPV18L1的纯度也没有公开。
[0008]为实现HPV31L1蛋白在汉逊酵母中的高效表达并且能够纯化获得高纯度的HPV31VLP蛋白，在本发明中，应用了 Zeocin抗性筛选结合G418抗性筛选的双重筛选策略，特别应用了浓度高达16mg/ml的G418抗性平板筛选传代并稳定后的重组汉逊酵母表达菌株。通过检测，筛选获得的HPV31高表达菌株的拷贝数可超过60个拷贝。在发酵诱导过程中，通过提高诱导表达温度至35°C可以显著提高HPV31L1蛋白的表达水平。此外，针对VLP纯化过程中常用的层析介质P0R0S50HS在纯化HPV31VLP时不易洗脱(高浓度NaCl洗脱目标蛋白时仍有50%目标蛋白挂柱)的特点，本发明使用POROS XS层析介质，使得目标HPV31L1蛋白在高浓度NaCl洗脱时能够实现80%以上蛋白的洗脱，从而大幅提高了HPV31L1蛋白的产量。
[0009]发明概述
[0010]在第一个方面，本发明提供了一种产生表达HPV31L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤:
[0011]a)通过将包含编码HPV31L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体；
[0012]b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和
[0013]c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。
[0014]在第二个方面，本发明还提供了根据上述方法产生的重组汉逊酵母细胞。
[0015]在第三个方面，本发明还提供了一种产生HPV31L1蛋白的方法，包括以下步骤:
[0016]i)在适于HPV31L1蛋白表达的条件下培养本发明的重组汉逊酵母细胞；和
[0017]ii)从培养物中回收并纯化HPV31L1蛋白。
[0018]在最后一个方面，本发明还提供了根据本发明的方法产生的HPV31L1蛋白在制备用于预防HPV31感染的疫苗中的用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1重组汉逊酵母细胞表达水平的SDS-PAGE检测。1_8:8株不同重组汉逊酵母菌株的诱导表达；9:标准品(10μ g/mL) ；10:蛋白质分子量标志物。
[0020]图2以MOX启动子片段为探针的Southern印迹检测结果。以ATCC26012基因组DNA为对照。1:对照(上样量为100ng) ；2:对照(上样量为500ng) ；3:对照(上样量为250ng)；4:对照(上样量为125ng);5:高表达重组菌HP_l#/pRMHP2.l_31hp的基因组DNA (上样量为
7.8ng，其亮度介于500ng和100ng对照之间)；6:高表达重组菌HP_2#/pRMHP2.l_31hp的基因组DNA (上样量为7.8ng，其亮度介于500ng和100ng对照之间)。
[0021]图3发酵过程中HPV31L1蛋白表达的Western Blot检测(35°C条件下诱导表达)。
1:诱导O小时；2:诱导I小时；3:诱导3小时；4:诱导5小时；5:诱导7小时；6:诱导9小时；7:诱导10小时；8:标准品(10 μ g/mL) ；9:预染蛋白质分子量标志物。
[0022]图4A:HPV31L1蛋白的P0R0S50HS纯化电泳图。1:上柱样品；2:流穿液；3_5:不同浓度NaCl洗脱液；6:清洗液；7:蛋白质分子量标志物。
[0023]B:HPV31L1蛋白的POROS XS纯化电泳图。1:上柱样品；2:流穿液；3_5:不同浓度NaCl洗脱液；6:清洗液；7:蛋白质分子量标志物。
[0024]C:HPV31L1蛋白的CHT纯化电泳图。1:上柱样品；2:流穿液；3，4:不同浓度磷酸盐洗脱液；6:清洗液；7:蛋白质分子量标志物。
[0025]图5纯化的HPV31L1蛋白的透射电镜观察结果。
[0026]发明详述
[0027]本发明人成功地建立了利用汉逊酵母产生HPV31L1蛋白的方法，所产生的HPV31L1蛋白能够自组装成病毒样颗粒，可用于制备预防HPV感染的疫苗。
[0028]本发明首先提供了一种产生表达HPV31L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤:
[0029]a)通过将包含编码HPV31L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体；
[0030]b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和
[0031]c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。
[0032]本发明还包括根据所述方法产生的重组汉逊酵母细胞。
[0033]来源于不同HPV31病毒株的HPV31L1蛋白的氨基酸序列会存在差异。本发明人通过对数据库中所有的HPV31L1蛋白序列进行比对，在HPV31L1蛋白每个氨基酸位置上选取出现频率最高的氨基酸残基，获得了示于SEQ ID N0:1的氨基酸序列，该序列是HPV31L1蛋白最具代表性的共有序列。因此，本发明中的HPV31L1蛋白优选具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。
[0034]为了利用汉逊酵母高效地表达HPV31L1蛋白，发明人根据SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列，针对汉逊酵母进行核苷酸序列的密码子优化。优化原则包括:a)按照汉逊酵母遗传密码使用频率表(http: //www.kazusa.0r.jp/codon/cg1-bin/showcodon.cgi?species=4905)选用使用频率最高或较高的密码子；b)避免对基因转录或蛋白翻译有潜在影响的负调控元件，如PolyAT区、PolyGC区、沉寂子(Sliencer)区及内部剪接位点等；c)对包含5’端UTR、HPV31L1编码区及3’端UTR在内的mRNA 二级结构进行综合分析，避免复杂RNA 二级结构的形成，使mRNA 二级结构的自由能降低；d)在编码区上游尽可能采用与汉逊酵母启动子下游天然序列完全一致的5’UTR区；e)消除常用的限制性内切酶识别位点。经过优化的核苷酸序列示于SEQ ID N0:2。本发明中所使用的编码HPV31L1蛋白的核苷酸序列优选为SEQ ID N0:2所示的序列。
[0035]本发明可以应用的汉逊酵母表达载体为申请号为201210021524.X的中国专利申请中描述的汉逊酵母表达载体PRMHP2.1 (包含示于SEQ ID NO:9的序列)。通过将包含编码HPV31L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸克隆进PRMHP2.1载体，可以获得本发明的表达构建体。本领域技术人员应当了解，本发明的表达构建体还可以用其它载体构建，例如已授权的中国专利CN100400665C中所描述的载体。
[0036]为了能在汉逊酵母中表达，所述表达构建体中的外源多核苷酸可操纵地与启动子和终止子连接。
[0037]如本文所用，“可操纵地连接”指至少两个多核苷酸的功能连接。例如，可操纵地连接包括启动子与另一个多核苷酸之间的连接，其中所述启动子序列起始并介导该另一个多核苷酸的转录。可操纵地连接包括终止子与另一个多核苷酸之间的连接，其中所述终止子终止该另一个多核苷酸的转录。
[0038]适用于本发明的启动子包括但不限于M0X、FMD、A0X1和DHAS启动子。在一些实施方案中，本发明中使用的启动子是来自汉逊酵母的MOX启动子。适用于本发明的终止子包括但不限于来自汉逊酵母的MOX终止子。
[0039]将表达构建体转化至汉逊酵母细胞可以用多种本领域已知的方法进行，包括但不限于电穿孔和PEG介导的转化。
[0040]另外，本领域中已经开发多种用于表达外源蛋白汉逊酵母菌株，包括但不限于CGMCC2.2498汉逊酵母、ATCC34438汉逊酵母和ATCC26012汉逊酵母细胞。这些汉逊酵母菌株也可以应用于本发明。在一些实施方案中，用于转化本发明的表达构建体的汉逊酵母细胞是ATCC26012汉逊酵母细胞。
[0041]在转化后，可以依据载体上携带的抗性基因来选择重组汉逊酵母细胞。合适的抗性基因包括但不限于Zeocin抗性基因和G418抗性基因。依据所使用的载体，也可能使用营养缺陷培养基来筛选重组汉逊酵母细胞。在一实施方案中，使用Zeocin来选择重组汉逊酵母细胞。在另一实施方案中，使用G418来选择重组汉逊酵母细胞。在一优选实施方案中，组合使用Zeocin和G41 8来选择重组汉逊酵母细胞。Zeocin的筛选浓度可以是0.25、
0.5,0.75、1.0或者1.5mg/ml，优选0.5mg/ml。使用的G418的筛选浓度可以是2、4、8、10、
12、14、16、18 或 20mg/ml,优选 16mg/ml。
[0042]外源多核苷酸在汉逊酵母中的表达水平与其在汉逊酵母中的拷贝数正相关。因此，还可以通过Southern印迹或定量PCR等方法进行进一步的筛选含有多拷贝外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。优选外源多核苷酸拷贝数大于15的重组汉逊酵母细胞，更优选外源多核苷酸拷贝数大于60的重组汉逊酵母细胞。
[0043]本发明人令人惊奇地发现，组合使用Zeocin和G418来选择重组汉逊酵母细胞，特别是使用高达16mg/ml的G418来进行选择能够获得外源多核苷酸拷贝数大于15，特别是大于60的稳定的重组汉逊酵母细胞。
[0044]在另一方面，本发明还提供了一种产生HPV31L1蛋白的方法，包括以下步骤:
[0045]i)在适于HPV31L1蛋白表达的条件下培养本发明的重组汉逊酵母细胞；和
[0046]ii)从培养物中回收并纯化HPV31L1蛋白。
[0047]本领域已知可用于培养汉逊酵母的各种培养基和基本培养条件，本领域技术人员能够根据需要进行选择或修改。本发明的重组汉逊酵母表达菌株的培养根据所需蛋白量可以在烧瓶进行或在不同规模的生物反应器(如30L的发酵罐)进行。根据所选用的启动子，可以在培养中加入合适的诱导物来诱导所述HPV31L1蛋白的表达。在使用MOX或FMD启动子的情况下，可以加入甲醇作为诱导物。酵母发酵培养常规在30°C下进行，而本发明人却令人惊奇地发现，本发明的重组汉逊酵母细胞在35°C进行蛋白表达的诱导能够使外源蛋白表达量显著提高。
[0048]所产生的HPV31L1蛋白的纯化可以使用本领域已知的各种蛋白纯化方式，如盐析、超滤、沉淀、层析等或这些方式的组合。在一个优化的实验方案中，首先用层析介质POROS XS进行初步纯化，随后利用层析介质Macro-Pr印陶瓷羟基磷灰石(Type II，40 μ m)
进一步纯化。
[0049]利用本发明的方法制备的纯化的HPV31L1蛋白可以自组装成病毒样颗粒(实施例9，图5)，并在小鼠中显示出良好的免疫原性(实施例10)，因此本发明也提供了所述HPV31L1蛋白在制备用于预防HPV31感染的疫苗中的用途。
实施例
[0050]下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。
[0051]实施例1:HPV31L1共有氨基酸序列的分析
[0052]全长的HPV31L1蛋白由504个氨基酸组成，经过GenBank检索后，使用Vector NTI软件AlignX功能进行氨基酸序列比对分析，获得最具代表性的HPV31L1共有氨基酸序列(consensus amino acid sequence,即在HPV31L1每个氨基酸位置均米用出现频率最高的氨基酸残基的序列)，其序列如SEQ ID NO:1所示。
[0053]实施例2:HPV31L1编码基因的优化设计及人工合成
[0054]为了利用汉逊酵母高效地表达HPV31L1蛋白，发明人根据SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列，针对汉逊酵母进行核苷酸序列的密码子优化。优化原则包括:a)按照汉逊酵母遗传密码使用频率表选用使用频率最高或较高的密码子山)避免对基因转录或蛋白翻译有潜在影响的负调控元件，如PolyAT区、PolyGC区、沉寂子(Sliencer)区及内部剪接位点等；c)对包含5’端UTR、HPV31L1编码区及3’端UTR在内的mRNA 二级结构进行综合分析，避免复杂RNA 二级结构的形成，使mRNA 二级结构的自由能降低；d)在编码区上游尽可能采用与汉逊酵母启动子下游天然序列完全一致的5’UTR区；e)消除常用的限制性内切酶识别位点。经过优化的核苷酸序列示于SEQ ID NO:2。
[0055]根据以上核苷酸序列，委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行的全序列人工合成，克隆于T载体中(命名为T-31hp)，并对其进行测序验证。实施例3:产生携带HPV31L1核苷酸序列的表达构建体
[0056]本发明所应用的汉逊酵母表达载体为申请号为201210021524.X的中国专利申请中描述的汉逊酵母表达载体PRMHP2.1(SEQ ID N0:9)。
[0057](I) MOX启动子及MOX终止子的PCR扩增
[0058]以汉逊酵母菌株ATCC26012及ATCC34438的混合基因组DNA为模板，用以下引物对扩增获得大小为1518bp的MOX启动子，同时在上游引入NotI酶切位点；
[0059]MOX 启动子上游引物:5 ’ -AAGGAAAAAAGCGGCCGCAACGATCTCCTCGAGCTGCTCGC-3，(SEQID N0:3)
[0060]MOX 启动子下游引物:5’-TTTGTTTTTGTACTTTAGATTGATGTC-3’ (SEQ ID N0:4)
[0061]以汉逊酵母菌株ATCC26012及ATCC34438的混合基因组DNA为模板，用以下引物对扩增获得大小为311bp的MOX终止子，同时在下游引入BglII酶切位点；
[0062]MOX 终止子上游引物:5’-GGAGACGTGGAAGGACATACCGC-3’ (SEQ ID NO:5)
[0063] MOX 终止子下游引物:5’-GAAGATCTCAATCTCCGGAATGGTGATCTG-3’ (SEQ ID NO:6)
(2)产生携带HPV31L1核苷酸序列的表达构建体
[0064]以携带31hp的重组质粒T_31hp为模板，用以下引物对扩增获得大小为1563bp的HPV3ILlhp基因，同时在上游引入MOX启动子区3’端的重叠序列，在下游引入MOX终止子5’端的重叠区；
[0065]31上游引物:
[0066]5’-CATCAATCTAAAGTACAAAAACAAAATGTCGCTGTGGAGACCATCTGAAG-3’ (SEQ ID NO:7)
[0067]31 下游引物:5，-GCGGTATGTCCTTCCACGTCTCCTTATTTCTTGGTCTTCTTGCGCTTCGC-3，(SEQ ID N0:8)
[0068]以MOX启动子、31hp基因、MOX终止子三个片段为混合模板，用以下引物对扩增获得大小为3.4Kb的31hp表达盒，扩增产物在上游携带NotI酶切位点，在下游携带BglII酶切位点。
[0069]MOX 启动子上游引物:5 ’ -AAGGAAAAAAGCGGCCGCAACGATCTCCTCGAGCTGCTCGC-3，(SEQID N0:3)
[0070]MOX 终止子下游引物:5’-GAAGATCTCAATCTCCGGAATGGTGATCTG-3’ (SEQ ID NO:6)
[0071]通过Notl+Bglll双酶切将31hp表达盒克隆入pRMHP2.1载体中，获得表达构建体PRMHP2.1-3Ihp。
[0072]实施例4:重组汉逊酵母细胞的产生
[0073]( I)重组表达构建体质粒的提取及酶切
[0074]挑取转化入实施例3中获得的重组表达构建体质粒的大肠杆菌菌落，扩大培养后使用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit试剂盒(Omega B1-Tek公司)提取质粒，并用BglII进行单酶切，应用E.Z.N.A Gel Extract1n Kit试剂盒(Omega B1-Tek公司)进行回收,用50 μ L预热至55°C的无菌水进行洗脱，通过测定OD26tl进行DNA定量，并将线性化的片段稀释至10ng/μ 1，保存于-20°C冰箱中，备用。
[0075](2)汉逊酵母细胞的处理
[0076]挑取汉逊酵母菌株ATCC26012单菌落，接入含5ml的YPD液体培养基的小试管中，30°C培养12小时；取菌液5ml转接至200ml YPD培养基中，30°C培养4-6小时，至OD6tltol约为 1.0-1.5，于 5000rpm 离心 1min ;用 200ml0.lmol/L 磷酸盐缓冲液(含 25mmol/L DTT，pH7.5)重悬菌体,充分混匀，于30°C孵育30min, 5000rpm离心1min,弃上清，留菌体。用预冷的STM溶液200ml洗菌体，菌体吹吸均匀，于4°C 5000rpm离心3min，弃上清，留沉淀。用冰冷的STM溶液10ml重悬菌体，于4°C 5000rpm离心3min，弃上清，留沉淀。根据菌体量用50-200 μ I冰冷的STM溶液重悬菌体，并将菌液转移至高压后的离心管中，冰浴，准备转化。
[0077](3)汉逊酵母细胞的电转化
[0078]按质粒:菌体=1: 2的量加入重组汉逊酵母表达质粒15 μ 1，菌液30 μ 1，充分吹吸均匀，置于冰浴中待转化；将事先用酒精浸泡，且紫外照射后，于-20°C冷藏的电转杯取出，加入质粒菌体混合液；按电压2500V、电阻150 Ω、电容50 μ F的条件进行电击；电击后迅速加入1ml已平衡至室温的YPD溶液，轻轻混匀后转移至EP管中；将电转后的菌体于30°C水浴中放置Ih,每间隔15min轻轻颠倒3次；将已孵育2h的菌液,于5000rpm离心1min,弃上清；用200 μ I YPD溶液重悬菌体，以100 μ I/板涂布于含0.5mg/ml Zeocin的YPD平板中，于30°C倒置培养3-7天。
[0079](4)重组汉逊酵母表达菌株的传代、稳定
[0080]挑取Zeocin抗性平板上长出的重组菌株单菌落，接种于5ml含0.5mg/ml Zeocin的YPD液体培养基中，于30°C、200rpm摇床培养24-48小时，至OD值达50后，以1:1000的比例转接于5ml含0.5mg/ml Zeocin的YPD液体培养基中，培养至OD值达50后，再以1:1000的比例转接于5ml含0.5mg/ml Zeocin的YPD液体培养基中，以此类推，连续传10次并进行菌种的保存。保存体系为菌液:60%甘油=1:1，根据需要量保存菌种，通常为500 μ I菌液+500 μ 160% 甘油；
[0081]将传至10次的重组汉逊酵母表达菌株接入5ml不含Zeocin抗性的YPD液体培养基中，于30°C、200rpm摇床培养至OD值达50后，以1:1000的比例转接于5ml YI3D液体培养基中，以此类推，在不含Zeocin抗性的YPD液体培养基中连续传5次。
[0082]将稳定后的菌液涂布含16mg/ml G418的YPD平板，于30°C倒置培养2_3天。
[0083]实施例5:重组汉逊酵母菌株的表达研究
[0084]从含16mg/ml G418的YPD平板中挑取多个重组汉逊酵母单菌落，接入含5ml的YPG液体培养基的小试管中，30°C培养24小时；将菌液转接于含30ml YPM诱导培养基的10ml三角瓶中，初始密度为0D_=1，于30°C摇床诱导72小时，每隔12小时于菌液中加入终浓度为0.5%的甲醇溶液。
[0085]取1ml诱导后的菌液转移至50ml的离心管中，于1000rpm离心1min,弃上清；以50ml的细胞裂解重悬菌体沉淀，充分混匀后，在超声仪中按“功率60%、时间20min、开5s、关5s”的超声破碎程序进行菌体破碎，破碎过程中需保持冰浴；将超声破碎的菌液，于1000rpm离心1min,收集上清后进行SDS-PAGE检测,诱导结果(如图1所示)显示:高表达的重组汉逊酵母菌株表达水平可达20 μ g/ml以上。
[0086]实施例6:重组汉逊酵母细胞的外源多核苷酸拷贝数检测
[0087](I)酵母基因组DNA的提取及定量
[0088]接种2株实施例5获得的高表达酵母菌株到5ml的YPD液体培养基中培养基，30 °C培养16~24h ;取2ml酵母培养液，室温4500g离心3min收集菌体；应用500 μ I SCED溶液(lmol/L山梨醇、10mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L EDTAUOmmoI/L DTT 二硫苏糖醇)重悬菌体，并加入50mg玻璃珠充分震荡5min，加入50μ 110mg/ml溶壁酶，37°C温浴Ih ;加入60 μ I的10%SDS，30 μ I的蛋白酶K，10 μ I的RNaseA酶，室温放置10分钟后在55°C的水浴中培养2h ;加入350 μ I饱和酚及350 μ I氯仿，充分混合后于13000rpm，离心10分钟，收集分层后的上层液；加入等体积(约700 μ I)氯仿，于13000rpm，离心10分钟，收集分层后的上层液；往上层液中加入140 μ I的3mol/L乙酸钠溶液，轻轻混匀后再加入700 μ I异丙醇，混匀后室温放置5min，于13000rpm，离心10分钟。弃上清，加入lml70%乙醇进行清洗，于13000rpm，离心10分钟，倒去上清，DNA沉淀置于室温放置30min后，加入100 μ I TE溶解。通过测定OD26tlnm进行基因组DNA的定量，并将线性化的片段稀释至lOOng/μ 1，保存于-20°C冰箱中，备用。
[0089](2) Southern印迹方法进行外源多核苷酸拷贝数的定量
[0090]a:探针制备
[0091]本发明所应用的MOX探针申请号为201210021524.X的中国专利申请中描述的MOX 探针，应用 Roche 公司的 DIG DNA Labeling and Detect1n kit 试剂盒(Cat No:11093657910)进行探针制备。具体步骤为:向EP小管中加入10 μ I MOX启动子区的PCR产物(200ng/l.! 1)，并用封口膜封上，沸水煮沸10分钟。立即放入预冷(_20°C)的无水乙醇小盒中(骤然冷却)。擦干管外壁乙醇，离心(约10s)，依次加入5μ I内毒素检查用/Κ>2μ llOxHexanucleotide Mix>2 μ IlOx dTP Labeling Mixture、I μ 17Klenow Enzyme(labeling grade)，混匀，封口膜封口。37°C水浴过夜，_20°C保存。
[0092]b: Southern 印迹
[0093]应用北京美莱博医学科技有限公司的地高辛杂交检测试剂盒I (Cat No:DI⑶-110)及HyB高效杂交液(Cat No:Hyb-500)按照产品说明书进行Southern印迹检测。
[0094]Southern印迹检测结果(如图2所示)显示:在16mg/ml的g418抗性平板筛选获得的高表达重组汉逊酵母HP-l#/pRMHP2.l_31hp菌株及HP_2#/pRMHP2.l_31hp菌株外源多核苷酸拷贝数超过60个。表明了应用zeocin抗体筛选结合g418抗性筛选的双重筛选策略，特别是采用高达16mg/ml浓度的g418抗性平板筛选有助于获得高拷贝整合且能进行HPV31L1蛋白高表达的重组菌株。
[0095]实施例7:HPV31L1重组汉逊酵母表达菌株的发酵工艺
[0096]发酵种子液:取I支冻存甘油菌(HP-l#/pRMHP2.l_31hp)，融化后吸取50 μ I接入5ml YPD培养基中，于30°C、200rpm摇床培养20_24hr，A6tltol约2_5，检定合格后各吸取Iml接入2瓶500ml YPD培养基中，于30°C、200rpm摇床培养20_24hr至A6tltlnm约15-20，检定合格后作为发酵种子液待用。
[0097]发酵工艺:发酵起始培养基含有酵母粉300g，蛋白胨150g，甘油100g，基础盐(K2S04273g，MgSO410g, 85%H3P04400ml, K0H62g), 10L 纯化水充分溶解，加入 30L 发酵罐中，纯化水定容至14L，121°C，30min灭菌，冷却至30 °C后加入60ml PTMl微量元素液(CuSO4.5Η206.0g, ΚΙ0.088g, MnSO4.Η203.0g, Na2MoO4.2Η200.2g, H3BO30.02g,CoCl2.6Η200.5g, ZnCl220.0g, FeSO4.7H2065.0g, B1tin0.2g,浓 H2S045.0ml，纯化水定容至1L，0.22 μ m滤膜过滤除菌)，氨水调节pH5.6，接种I瓶500ml发酵种子液，此时发酵体积为15L。起始搅拌转速为200rpm、空气流量0.5Nm3/hr、罐压0.5bar，发酵中控制溶氧值为20-80%。起始生长期维持约25hr后，菌液A6tltlnm达到20左右，溶氧开始快速上升，开始以100ml/hr流速流加补料培养基(50%甘油(W/V)，12ml PTMl)，此时进入流加生长期。培养约6-8hr后，菌液A6tltol达到90左右，停止流加，氨水调节pH值至6.0。溶氧开始回升后开始流加甲醇(含12ml/L PTMl)进入诱导表达期，诱导期将温度调升至35°C，甲醇初始流加速率为50ml/hr，每小时取样，甲醇电极测定甲醇浓度，通过调节甲醇流加速率使甲醇浓度控制在< 5g/L。
[0098]下罐离心及表达量检测:诱导1hr后下罐，4°C条件下以5000rpm离心30min收集湿菌体，_20°C冻存备用。另外，取1ml发酵液转移至50ml的离心管中，于1000rpm离心lOmin，弃上清，以50ml的细胞裂解液重悬菌体沉淀，充分混匀后进行超声破碎，超声破碎液进行Western印迹检测，Western印迹检测结果如图3所示:整个诱导周期可在10小时内结束，HPV31的发酵液表达量可接近100μ g/mL。
[0099]实施例8:HPV31L1重组蛋白的纯化工艺研究及优化
[0100]菌体破碎:取_20°C保存的HPV31表达湿菌体，按照10ml/g湿菌体的比例加入
0.9%生理盐水清洗。菌体洗涤后，按20ml缓冲液/g湿菌体加入破碎缓冲液(含0.5mol/LNaCl，0.02%Tween-80,0.05mol/L MOPS)充分溶解，使用高压匀浆破碎，破碎压力1500bar，循环破碎5-8遍，镜检破碎率> 90%。菌体破碎液在4°C条件下以1000rpm离心30min，收集上清液，再加入50%硫酸铵,沉淀30min后,4°C条件下1000rpm离心30min,收集上清液。
[0101]层析纯化第一步:1)常规工艺:经Iym过滤的菌体破碎上清液，上样于层析介质P0R0S50HS,目的蛋白吸附到层析介质上，以0.5M~1.5M NaCl梯度洗脱；2)优化工艺:经I μ m过滤的菌体破碎上清液，上样于层析介质POROS XS,用0.5M~1.5M NaCl梯度洗脱。应用以上2种不同的层析介质吸附HPV31L1蛋白，在不同浓度NaCl梯度洗脱后再用0.5MNaOH清洗柱子。SDS-PAGE检测层析过程中HPV31L1蛋白的纯化情况，结果如图4A及图4B所示:1)应用层析介质P0R0S50HS，在高浓度NaCl洗脱后，仍残留有50%以上的HPV31L1蛋白没有被洗脱下来；2)应用层析介质POROS XS，在高浓度NaCl洗脱后，仅有不到20%的HPV31L1蛋白没有被洗脱下来。表明在进行HPV31L1蛋白的初步层析纯化时，应用层析介质POROS XS能有利于HPV31L1蛋白的洗脱，从而大幅提高HPV31L1的得率。
[0102]层析纯化第二步:将初步纯化后的HPV 31L1蛋白上样于层析介质Macro-Prep陶瓷羟基磷灰石(Type II, 40 μ m),目的蛋白结合于层析介质上,用20~200mM磷酸盐浓度梯度洗脱，目的蛋白与杂质分离，收集洗脱的HPV31L1蛋白(见图4C)。
[0103]实施例9:透射电镜观察纯化的HPV31L1重组蛋白
[0104]用无菌水3倍稀释纯化后的HPV31L1蛋白样品，滴一小滴于腊盘上。取铜网使有支持膜的表面与样品液表面接触，静置Imin取出，取出铜网，用滤纸条吸除多余的液滴，稍晾干。取2%醋酸铀溶液，滴一小滴于腊盘上。吸附有样品的铜网放置于染液表面(样品与染液接触)，静置2min。取出铜网，用滤纸条吸除多余的液滴，白炽灯下晾干。应用JE0L-1400型号透射电镜观察VLP颗粒形态并拍照(结果图5所示)。
[0105]实施例10:用汉逊酵母重组制备的HPV31L1VLP的免疫原性研究
[0106]应用测定体液免疫效力ED5tl (半数有效剂量)的方法评价HPV31L1VLP的免疫原性
[0107](I)小鼠的免疫:85只6周龄Balb/c雌性小鼠(购自中国医学科学院实验动物研究所)，清洁级饲养。共分为6个组，包括5个实验组及I个对照组，按所需免疫剂量将HPV31L1蛋白样品进行稀释(表1)。免疫程序为:第0、3、6周各免疫一次，最后一次免疫后14天杀鼠并分离血清。
[0108]表1小鼠的分组
[0109]
【权利要求】
1.一种产生表达人乳头瘤病毒31型LI (HPV31L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤: a)通过将包含编码HPV31L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体； b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和 c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述HPV31L1蛋白的氨基酸序列示于SEQID NO:1。
3.权利要求2的方法，其中所述编码HPV31L1蛋白的核苷酸序列示于SEQID N0:2。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在所述表达构建体中所述外源多核苷酸可操纵地连接于启动子和终止子。
5.权利要求4的方法，其中所述启动子是MOX启动子。
6.权利要求4或5的方法，其中所述终止子是MOX终止子。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述载体包括SEQID NO:9所示的核苷酸序列。
8.权利要求7的方法，其中步骤c)中使用Zeocin和G418筛选重组汉逊酵母细胞。
9.权利要求8的方法,其中Zeocin的浓度是0.5mg/ml。
10.权利要求8的方法，其中G418的浓度是16mg/ml。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤b)中通过电穿孔来转化汉逊酵母细胞。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中步骤b)中的所述汉逊酵母细胞是ATCC26012汉逊酵母细胞。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述重组汉逊酵母细胞含有多拷贝的所述外源多核苷酸。
14.一种根据权利要求1-13任一项的方法产生的重组汉逊酵母细胞。
15.一种产生HPV31L1蛋白的方法，包括以下步骤: i)在适于所述HPV31L1蛋白表达的条件下培养权利要求14的重组汉逊酵母细胞；和 ?)从培养物中回收并纯化所述HPV3ILl蛋白。
16.权利要求15的方法，其中步骤i)中包括在35°C诱导所述HPV31L1蛋白表达。
17.权利要求15或16的方法，其中步骤ii)中使用POROSXS层析介质纯化所述HPV31L1 蛋白。
18.根据权利要求15-17中任一项的方法产生的HPV31L1蛋白在制备用于预防HPV31感染的疫苗中的用 途。
【文档编号】C12N15/81GK104164374SQ201310185027
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月17日 优先权日:2013年5月17日
【发明者】霍烛, 于跃, 程海, 刘娟, 王贻杰, 陈丹, 李鼎锋, 刘勇 申请人:北京安百胜生物科技有限公司, 江苏瑞科生物技术有限公司