专利名称：木糖还原酶的改造和木糖醇脱氢酶与木酮糖激酶的过表达促进耐热酵母菌多形汉逊酵母 ...的制作方法
技术领域：
本申请涉及通过发酵进行纤维素乙醇生产的领域，具体涉及包括木糖的来源的发 酵，更具体涉及用于通过木糖发酵进行乙醇生产的重组多形汉逊酵母(H. polymorpha)菌 株，且还更具体涉及过表达具有改变的NADPH亲和力的突变多形汉逊酵母木糖还原酶、以 及内生的或重组的木糖脱氢酶和木酮糖激酶的多形汉逊酵母菌株，所述菌株通过在包含木 糖的培养基上发酵获得提高的乙醇生产量。背景从木质纤维素生产乙醇是化石燃料的环境友好型的可选方案。由于大部分的木质 纤维素材料由木糖组成，有必要将木糖有效地发酵成乙醇使得工艺具有成本效益[1]。一些酵母菌、丝状真菌和细菌能够将木糖转化成乙醇。首先，酵母菌和大部分其他 真菌使用优先将NADPH作为辅酶的木糖还原酶EC 1. 1. 1. 21 (XR)将木糖还原成木糖醇。然 后，其用严格依赖NAD的木糖醇脱氢酶EC 1. 1. 1.9 (XDH)将木糖醇氧化成木酮糖[2]。辅 因子特异性的区别导致氧化还原失衡，该氧化还原失衡导致乙醇生产量减少和木糖醇堆积 [3，4，5，6，7，8]。已通过代谢改造减少木糖醇生产量，该代谢改造旨在优化)(R和)(DH的表 达水平[9，10，11，12] JfXR的辅因子特异性从NADPH改变为NADH[13，13a]，或修饰宿主细 胞的氧化还原代谢[14，15，16]。在木糖发酵期间避开氧化还原失衡所使用的其他方法是基 于真菌或细菌木糖异构酶EC5. 3. 1.5 (XI)的表达，该木糖异构酶将木糖直接转化成木酮糖 且不需要氧化还原辅因子[17，18]。木酮糖激酶EC 2.7. 1. 17 (XK)(木糖代谢中的第三酶)的另外的过表达已显示提 高在携带XR-XDH-及XI的菌株中的需氧和厌氧木糖利用[12，19]，该木酮糖激酶将木酮糖 转化成木酮糖-5-磷酸，木酮糖-5-磷酸进入戊糖磷酸途径，且然后进入中间代谢。需要XK 的过表达以克服该酶天然低的表达水平[3，5]。过表达导致木糖更有效地转化成乙醇[5，20] ο耐热甲基营养酵母菌多形汉逊酵母能够在提高的温度下(45°C -48°C )进行乙 醇发酵[21，22，23]。多形汉逊酵母的这个性质使其成为用于有效的同时糖化和发酵过程 (SSF)中的有力候选者。SSF结合木质纤维素物质的酶水解与随后在同一容器中释放的糖 的发酵。开发使用多形汉逊酵母从纤维素物质中进行乙醇生产的实用性的主要优势是该 酵母菌具有(i)良好地开发的分子遗传学方法和(ii)模型菌株CBS4732的整个基因组序 列的可用性[24，25]。3
概述本公开内容描述了重组多形汉逊酵母菌株的构建，该重组多形汉逊酵母菌株过表 达修饰的)(R(K341R N343D)和在Δ xyll背景上的天然)(DH和XK。示出了菌株的木糖消耗、 乙醇和木糖醇生产量与过表达天然XR、XDH和XK的菌株的木糖消耗、乙醇和木糖醇生产量 的对比，用于对比以证实当多形汉逊酵母菌株在包含木糖的培养基上生长时，改变的XR 酶的过表达提高乙醇产量。本文还公开了相关的重组核酸、突变酶和使用其在木糖上进行 乙醇发酵的方法。附图描述
图1，本公开内容使用的质粒的线性设计ρΧ1Μ-Ζ、ρΧ1Ν-Ζ、ρΧ1Μ-Ζ-Χ2、ρΧ1Ν-Ζ-Χ2 和 pGLG61/HpXYL3。表达盒 prGAP-XYLl-trAOX、prGAP-XYL2-trXYL2 和 prGAP_XYL3_trA0X 分别用白框、灰框和加点框示出。修饰型XYLl ORF用黑框示出。Zeocin抗性基因(Zeor) 和遗传霉素抗性基因(APH)用阴影线指出，其被连接到编码甘油醛磷酸脱氢酶(GAP)的受 损的组成型基因启动子。作为自主复制序列的多形汉逊酵母LEU2基因和端粒区(TEL 188) [29]用交叉阴影线示出。复制起点ORI和氨苄青霉素抗性基因(bla)_以箭头示出。限制 位点:P, PstI ；H, HindIII ；S, SacI ；Si, SalI ；B, BamHI ；Sell, SacII ；Xb, XbaI ；RI, EcoRI ； NdI，NdeI ；N, NotI。图2，来自利用木糖的多个酵母菌的)(R辅因子结合位点序列与多形汉逊酵母XYLl 序列的比对。保守序列用粗体示出。加下划线的氨基酸被改变(K —R和N —D)。图3，在 48°C下通过 CBS4732 (A) ,XRn/XDH/XK (B)和 XRm/)(DH/XK (C)的木糖发酵的 对比。符号乙醇(■)、木糖醇(·)、生物质(▲)和木糖( )。图4，表1示出了本公开内容中使用的菌株和质粒。图5，表2示出了对比于对照菌株的本文描述的多形汉逊酵母转化体的XR、)(DH、XK 活性、以及乙醇和木糖醇生产率。图 6，表 3 示出了在 48°C 下通过 2Et-/2xPDCl 和 2Et_/2xPDCl/XRm/XDH 进行的木 糖发酵的对比。图7，图7A示出了编码木糖还原酶的克隆的多形汉逊酵母xy 11基因的DNA序列， 起始密码子和终止密码子突出显示。图7B示出了克隆的多形汉逊酵母木糖还原酶蛋白质 的蛋白质序列，突变发生前的NADPH结合位点突出显示。方法、菌株和结果详述菌株和培养基于37°C下，在YPD(0.5%酵母提取物、蛋白胨、2%葡萄糖)或基本培养 基(无氨基酸的0.67% YNB、4%木糖或2%葡萄糖)上培养酵母菌株多形汉逊酵母 CBS4732 (leu2-2) [26]、Δ xyl 1 [22]和转化体(表 1)。对于 CBS4732 菌株，将亮氨酸 GOmg L—1)补充到培养基中。为了在YPD上选择酵母菌转化体，加入130mg L^1-ISOmg L—1的zeocin 或 0. 5mg Γ-0. 6mg Γ1 的 G418。大肠杆菌 DH5a 菌株AM15、recAl、endAl、gyrA96、thi_l、hsdR17 mk+)、supE44、relAl、deoR、Δ (lacZYA-argF)U169)被用作质粒增殖的宿主。如前所述，于 37°C下，在LB培养基中培养菌株DH5ci [27]。转化的大肠杆菌细胞被保持在包含IOOmg L—1的氨苄青霉素的培养基上。
分子牛物学技术应用了标准的克隆技术[27]。使用Wizard 基因组DNA纯化试剂盒(!Iomega， Madison,WI,USA)将多形汉逊酵母的基因组DNA分离。根据制造商说明书使用限制性核酸 内切酶和 DNA 连接酶(Fermentas，Vilnius, Lithuania)。用 Wizard 和 SV 小量制备 DNA 纯化系统(ftOmega，Madison, WI, USA)进行从大肠杆菌分离质粒。根据制造商说明书，用 高保真Platinum iTaq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)进行所关注的片段的 PCR-扩增。在GeneAmp PCR 系统 9700 热循环仪(AppliedBiosystemsJoster City, CA,USA)中进行PCR。如前所述，进行通过电穿孔的酵母菌多形汉逊酵母的转化[28]。质粒构津分别携带天然)(R和修饰型)(R的重组质粒pXIN-Z和pXIM-Z基于质粒 pUC57 (Fermentas, Vilnius, Lithuania)被构建。来自质粒pK08_GAPpr [22]具有HpGAP 启动 子和HpAOX终止子的BamHIAacI片段被克隆到具有预先消除的限制位点NdeI和HindIII 的BamHI/&icI消化的质粒pUC57中。在制得的质粒中，位于HpGAP启动子和HpAOX终止子 之间的限制位点NdeI和NotI被去除且产生唯一的HindIII位点。使用引物对HpXlfor (CCC AAG CTT ATG CAC ACG CAG ATT AGC AM MT CTTG)和 HpXlrev (CGC AAG CTT TTA GAT AAA GGT TGG AAT TTC GTTCCA GGT CC)从 CBS4732 的基因组 DNA 中将 XYLl 的 ORF 进行 PCR-扩 增，且将其克隆到HindiII位点中，以产生表达盒prGAP-XYLl-trAOX(所有的引物中的限 制位点都加下划线)。通过重叠PCR进行)(R基因的修饰。引物对HpXlMfor (CAT CTT GGT CAT TCC AAG GTC CGA CCA AAAGGA GAG ACT G)禾口 HpXlMrev (CAG TCT CTC CTT TTGGTC GGA CCT TGG AAT GAC CAA GAT G)被用来产生制得的修饰XR中的K341 — R和N343 — D 取代(突变的不匹配碱基用黑体示出)。引物HpXlfor和HpXlrev被用于修饰型)(R基因的 克隆，如上关于天然基因所描述的。使用引物对Ko58(CGG GGT ACC TG CAG ATA ACT TCG TAT AGC ATAC)和 Ko59 (CGG GGT ACC TG CAG TAA TTC GCT TCG GAT AAC)将给予 zeocin 抗性的酵母菌选择性标志物从质粒ρΡ αΒ (Invitrogen)中进行PCR-扩增，且将其克隆到 PstI线性化载体中而产生pXIN-Z或pXIM-Z (图1)。使用相应的引物对Ll (CTC GGA TCC CAA TTA TCA TTA ATA ATC) /Ko 135 (CAG CAG AAG GAT TGT TCA TTT TGT TTC TAT ATT ATC)禾口 Ko134(GAT AAT ATA GAA ACA AAA TGA ACA ATC CTT CTG CTG) /Ko 133 (ACA GGA TCC ATC CAT GAG AAA CG)，将具有自身终止子和 HpGAP启动子的多形汉逊酵母XYL2基因从CBS4732的基因组DNA中扩增。引物Ll和Kol33 被用于通过重叠PCR获得含有用HpGAP启动子驱动的具有自身终止子的XYL2基因的片段。 此片段被克隆到BamHI线性化质粒pXIN-ZipXIM-Z中，分别得到重组构建体ρΧ1Ν_Ζ_Χ2和 PX1M-Z-X2 (图 1)。包含prGAP-XYL3-trA0X的表达盒被作为SacII限制片段从质粒pK08/GAP/HpXYL3 中获得[23]，且被克隆到SacII线性化质粒pGLG61中[29]。制得的质粒被指定为pGLG61/ HpXYL3(图1)。构建的质粒的准确性通过序列测定来证实。构建的质粒在表1中示出。生物化学方法在37°C下分光光度测定细胞提取物中的)(R活性。XR分析混合物包含=Tris-HCl 缓冲液(pH 7. 0) lOOmM.NADPH 0. 15mM和木糖350mM。反应始于细胞提取物的加入[3]。为了 评价关于NADPH或NADH的KM，在四种不同的辅因子浓度20 μ M、50 μ M、100 μ M和150 μ M (每种重复三次)下测量)(R活性。
在37 °C下分光光度测定细胞提取物中的)(DH活性。)(DH分析混合物包含Tri s_HCl 缓冲液(pH 8. 8) IOOmM, MgCl2 1 OmM、NAD 3mM和木糖醇300mM。反应始于细胞提取物的加 入[幻。如前所述[30]，且具有一些修改，在37°C下分光光度测定细胞提取物中的XK活 性。XK分析混合物包含Tris-HCl缓冲液(pH 7. 8)50mM、MgCl2 5mM、NADH 0. 2mM、磷酸烯醇 丙酮酸 ImM、D-木酮糖 8. 5mM、乳酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 27) (Fluka, St. Louis, MO, USA) 10U、 丙酮酸激酶(EC 2. 7. 1. 40) (Fluka，St. Louis，M0，USA) 0. 05U 和 ATP 2mM。反应始于细胞提 取物的加入。对于XK分析，另一个没有丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的空白被用来使多形汉逊 酵母中的)(DH活性的干扰最小化。所有的分析实验重复至少两次。分析转化体细胞在富YPX培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、4%木糖)中生长2天， 且被接种到具有12%木糖的YNB培养基中。在48°C的温度下于有限的通风(140转XmirT1) 中进行发酵。使用基于乙醇氧化酶/过氧化物酶的酶试剂盒“Alcotest”测定培养基中的乙 醇浓度[31]。如前所述(Enzymatic determination of D—sorbitol and xylitol(D_ 山梨 糖醇和木糖醇的酶法测定)，R-Biopharm GmbH, Darmstadt, Germany)，且具有稍微的修改， 酶法测定培养基中的木糖醇浓度。硝基四唑蓝(Nitrotetrazolium Blue) (NTB) 12mM和吩 嗪硫酸甲酯15mM被用来分别代替碘硝基四唑氯化物和心肌黄酶。在570nm测量被还原的 NTB的吸光率。通过如前所述的化学方法分析来自矿物培养基中的发酵的木糖浓度[32]。实验进行至少两次。MMXR的改造为了促进木糖的乙醇发酵和减少木糖醇形成，多形汉逊酵母的)(R已经受位点特 异性诱变，以降低其对NADPH的亲和力。多形汉逊酵母)(R的辅因子结合位点的氨基酸序列 (序列ID号1)显示与其他利用木糖的酵母菌的相应位点的严格同源性(图幻。在本工 作中，发明人分别用精氨酸和天冬氨酸代替在氨基酸位置341和343的赖氨酸和天冬酰胺， 以获得具有序列ID号2的辅因子结合位点的突变的多形汉逊酵母)(R蛋白质。这些代替 类似于那些用于细假丝酵母(Candida tenuis)中的)(R辅因子特异性的成功修饰而进行的 取代[33]。菌株构建
为了产生具有过表达的天然)(R或修饰型)(R的菌株，或为了产生具有同时过表达 的天然狀或修饰狀与》)H的菌株，将多形汉逊酵母Axyll [22]菌株分别用McI线性化质 粒pXIN-Z和pXIM-Z或ρΧ1Ν-Ζ-Χ2和ρΧ1Μ_Ζ_Χ2转化。转化体在补充zeocin的YPD培养 基上生长。通过使用相应的引物的PCR考查转化体中表达盒的存在。为了表达XK，重组质 粒pGLG61/HpXYL3被转化入过表达天然或修饰型)(R和)(DH的受体菌株多形汉逊酵母。在 增加浓度的G418的存在下，转化体在YPD培养基上生长。允许转化体生长的G418的最大 浓度是0. ^gXmr10能够在选择性培养基上生长的菌落在用高达20转化体Xmg-1DNA的 频率孵育三天之后出现。通过在非选择性培养基中培养10-12代，然后转移到具有G418的6选择性培养基来使转化体稳定。通过PCR证明稳定的转化体的基因组DNA中由HpGAP启动 子驱动的重组XYL3基因的存在。由于基于pGLG61的质粒启动多个整合进入受体菌株的基 因组[四]，通过Southern杂交来考查构建的菌株，以选择具有相同量的XK表达盒的重组菌 株。选择负载3拷贝XK表达盒的菌株(数据未示出)。构建的酵母菌菌株在表1中示出。构津的菌株的牛物化学分析研究了构建的重组菌株的一种中的)(R(指定为XRm)生物化学性质。测量了 )(R(具 有辅因子NADPH和NADH两者)JDH和XK的比活性以及天然)(R(XRn)和改造的XRm的亲和 力(表2)。XRm特征在于使用木糖作为底物的NADPH的Km为152 μ Μ，这比天然)(R的NADPH 的ΚΜ(9μΜ)高17倍。对于NADH来说，改造的XRm的Km保持几乎不变(112μΜ)。在XRm菌 株中具有NADPH的)(R的比活性与过表达天然)(R的菌株相比降低了 4. 8倍。在两种菌株中 具有NADH的)(R的比活性保持不变。具有另外过表达的)(DH的菌株XfoiADH和XRmADH与 野生型菌株相比具有增加两倍的》)H比活性。与CBS4732相比，菌株Xfoi/)(DH/XK和XRm/ XDH/XK中的XK过表达导致增加高达2. 4倍的XK比活性(表2)。木糖发酵对比在有限的通风下通过构建的菌株分批培养的木糖发酵。使用了包含木糖 (12% )和初始浓度2g(干重)XL—1生物质的矿物培养基。通过构建的菌株得到的乙醇和 木糖醇的生产量的结果在表2中示出。XRm菌株的乙醇生产率是9. 8mgX (LXh)―1，该生产 率比Xfoi和野生型菌株CBS4732的生产率分别高1. 5倍和1. 3倍。这些菌株的木糖醇生产 量变化不大。与XfoiADH和CBS4732相比，菌株XRmADH的乙醇生产率(18. 4mgX (LXh)-1) 分别增加了 1. 5倍和2. 4倍。与XRn/XDH和CBS4732菌株相比，菌株XRm/XDH具有减少 1. 3倍和2. 6倍的木糖醇生产量。与菌株XfoiADH/XK的乙醇生产率(13. 8mgX (LXh)"1) 和菌株CBS4732的乙醇生产率(7. 5mgX (LXh)―1)相比，菌株XRm/)(DH/XK的乙醇生产 率(54. 7mgX (LXhr1)高4倍和7. 4倍。菌株XRm/)(DH/XK的木糖醇生产量显著地降到 0. 9mgX (LXh)、该木糖醇生产量比XfoiADH/XK的木糖醇生产量和对照菌株的木糖醇生 产量分别低4. 7倍和3倍。菌株Xfoi/)(DH/XK、XRm/)(DH/XK和CBS4732的代表性发酵概况在 图3中示出。注意到，在发酵期间由多形汉逊酵母菌株消耗的木糖较低。在木糖发酵的初 始阶段，产生的乙醇在发酵1-2天之后被再利用。多形汉逊酵母菌株中的XR突变体、XD和XK基因的表达，所述多形汉逊酵母菌株 在提高的温度下(48°C )过表汰用于改讲的木糖乙醇发酵的丙酮酸脱羧酶。为了改进木糖乙醇发酵，在具有提高水平的丙酮酸脱羧酶活性的重组多形汉逊酵 母菌株中过表达改造型的木糖还原酶(XR)和天然木糖醇脱氢酶O(DH)。前面已描述了初始 菌株的构建和生物化学特征[35，36]。为了产生具有同时过表达的修饰型)(R和)(DH的菌株，多形汉逊酵母菌株用kal线性化质粒PX1M-Z-X2转化(图1) [37]。转化体在补充有zeocin (150mgX L—1) 的YPD培养基上生长。能够在选择性培养基上生长的菌落在用高达40转化体Xmg4DNA的 频率孵育三天之后出现。通过在非选择性培养基中培养10-12代，然后转移到具有zeocin 的选择性培养基来使转化体稳定。使用用于在强组成型启动子HpGAP控制下负载修饰的 XYLl基因的表达盒的引物Ll/HpXlrev，和使用用于在相同启动子控制下负载XYL2基因的 表达盒的引物Ll/Kol33，通过PCR考查转化体中表达盒的存在。在Dmytruk 0.等人的文章中描述了所使用的引物的序列以及XYLl基因的修饰[37]。考查了在有限的通风下和于48°C下通过构建的菌株分批培养的木糖发酵。使 用了包含木糖(12%)和初始浓度2g(干重)ΧΙ^生物质的矿物培养基。通过构建的 菌株的乙醇生产量的结果在表3中示出。2Et-/2xPDC 1 /XRm/XDH菌株的乙醇生产率是 0. IlgX (LXhr1)，这比初始菌株2Et"/2xPDC的生产率高2. 7倍。菌株2Et-/2xPDCl和 2Et-/2xPDCl/XRm/XDH的代表性发酵概况在图5中示出。改造的)(R和天然)(DH的过表达明显地中和了多形汉逊酵母构建的重组菌株中的 氧化还原失衡，导致在木糖发酵期间乙醇生产率的显著提高。碰如前所述[6]，利用木糖的天然酵母菌仅在其)(R具有连接NADH的活性时显示乙 醇发酵。多形汉逊酵母的狀属于具有双辅因子特异性的酶，但是NADPH是特别优选的(> 10倍)。在这种情况下，我们关注于具有对于NADPH的增加的Km的)(R的改造。根据细假 丝酵母的狀基因的数据[33]，使用位点特异性诱变，在辅因子结合位点的框中的位置341 和343的赖氨酸和天冬酰胺残基分别被精氨酸和天冬氨酸代替。在强组成型HpGAP启动子 的控制下，在Axyll背景上过表达修饰型)(R基因。这导致对于NADPH的Km的显著增加， 而对于NADH的Km保持几乎不变。获得的结果与报道的来自细假丝酵母的修饰型狀的特 征[33]具有良好一致性。构建的XRm菌株显示与野生型菌株相比在乙醇生产率上的少量 增加，而天然XR的过表达不具有正效应。这些菌株的木糖醇生产量变化不大。需要强调， 突变的)(R显示对NADPH的显著降低的比活性，这导致XRm的乙醇生产率的增加。为了进一 步提高乙醇生产量，)(DH与修饰XR —起被表达。木糖利用途径的初始两阶段的酶的过表达 导致乙醇生产率提高2. 4倍，且伴随着木糖醇生产量降低2. 6倍。在先前的工作中，我们开发了共-过表达大肠杆菌XI和自身XK的多形汉逊酵母 菌株。该菌株特征为具有在木糖发酵期间显著提高的乙醇生产量[23]。在本研究中，过表 达修饰的)(R以及)(DH和XK的构建的菌株XRmADH/XK特征为具有与野生型菌株相比显著 增加的乙醇生产率(高达7.4倍)。重要地，通过该菌株得到的木糖醇生产量大量降低 0. 9mgX (LXh)-1)相比于通过野生型菌株得到的4. 2mgX (LXh)"1)。XDH的另外的过表达 和)(DH与XK —起的另外的过表达导致乙醇生产率的逐渐增加和同时木糖醇生产量的降低。 可假定，木糖利用的初始阶段在多形汉逊酵母中的木糖乙醇发酵中是限制性的。在图3中， 示出了 XRmADH/XK和Xfoi/)(DH/XK的发酵概况。在发酵期间，通过构建的多形汉逊酵母菌 株和野生型菌株两者的木糖的消耗非常低(图幻。这可表明在多形汉逊酵母中吸收木糖 效率非常低，且编码推定的木糖转运蛋白的相应的基因应该被克隆和过表达。此外，狀的 瓶颈下游不能被除外且需要进一步研究。发酵概况显示合成乙醇的再利用。这种现象的原 因还不清楚。在另一个研究中，本发明人已分离出多形汉逊酵母2Et0H_突变体，该多形汉逊 酵母2Et0H_突变体特征在于显著降低的合成乙醇的消耗(Ishchuk等人，未公开)。但是， 相应的突变的分子本质仍不清楚。本研究构建的多形汉逊酵母的重组菌株显示在高温木糖发酵期间显著增加的乙 醇生产率。另一方面，来自木糖的乙醇生产量与目前最好的木糖发酵菌株相比仍非常低 [13a，17，34]。因此，需要进一步努力，以改进耐热酵母菌多形汉逊酵母中的木糖乙醇发酵。结论CN 102046776 A说明书7/11 页 在本工作中，在携带Axyl缺失的菌株中，突变形式的)(R(K341 — RN343 — D)与天 然)(DH和)(R —起的共-过表达导致在高温木糖发酵期间乙醇生产率显著增加(7. 4倍)，且 同时木糖醇生产量降低。整合到过表达多形汉逊酵母丙酮酸脱羧酶基因PDCl而缺少Axyl 缺失的多形汉逊酵母菌株的染色体中的相同的构建也使从木糖进行的乙醇发酵增加约三 倍。因此预期，还携带Axyl缺失的多形汉逊酵母菌株中的PDCl基因和突变的)(R基因的 过表达的组合将进一步提高从木糖得到的乙醇生产量。通过引用并入以下参考文献中的每一个都在此引用，以提供对本文所公开的发明的更好理解， 且提供对将使得任一个本领域普通技术人员能够制造和使用本文所描述的物质和过程的 技术、来源和物质的描述。因此，以下参考文献中的每一个在此通过引用以其整体并入，如 果本文所提供的任何公开内容与并入的参考文献冲突，在这样的情况下，本文所公开的冲 突主题内容控制所引用的参考文献。权利要求中的术语在参考文献部分之后的权利要求中，术语“基因”是一个简略的表达，其是指编码 通过所命名的基因确定的酶的任何多核苷酸。除非在权利要求中另有明确说明，否则“基 因”可以但没有必要包括非编码序列。除非另有说明，多核苷酸可具有与所命名的基因相同 的一级结构，所命名的基因是在生物体的基因组中内生的，或是连接到其他多核苷酸元件 的所命名的基因的重组形式，或是所命名的基因的合成形式，或是突变形式，在该突变形式 中，所命名的基因中的各种元件已改变但基因仍编码可操作形式的所确定的酶。术语“突变 的”是指在所命名的基因中的使其不同于内生形式的基因的任何改变。“天然的”是指当基 因存在于生物体的基因组中时的基因的内生结构。参考文献1. 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1.一种重组多形汉逊酵母(H. polymorpha)菌株，所述菌株包括至少一种重组核酸，所 述重组核酸单一地或组合地包括至少一种编码木糖醇脱氢酶的基因、至少一种编码具有对 NAD(H)比对NADP(H)高的结合亲和力的木糖还原酶的基因，和至少一种编码木酮糖激酶的 基因，所述基因中的每一种被可操作地连接到至少一种在所述多形汉逊酵母菌株中过表达 所述基因的启动子，且其中，与不含所述基因的亲代多形汉逊酵母菌株相比，所述重组多形 汉逊酵母菌株在包含木糖的培养基中发酵时产生更大量的乙醇。
2.如权利要求1所述的重组多形汉逊酵母菌株，其中所述重组核酸的所述基因中的每 一种被整合到多形汉逊酵母染色体中。
3.如权利要求1所述的重组多形汉逊酵母菌株，其中所述多形汉逊酵母菌株具有使至 少一种编码木糖还原酶的天然基因不可操作的突变。
4.如权利要求1所述的重组多形汉逊酵母菌株，其中相对于所述亲代多形汉逊酵母菌 株，所述多形汉逊酵母菌株中的所述基因中的每一种被过表达。
5.如权利要求1所述的重组多形汉逊酵母菌株，所述菌株还包括至少一种编码丙酮酸 脱羧酶的序列，所述序列可操作地连接到在所述重组多形汉逊酵母菌株中过表达所述丙酮 酸脱羧酶的启动子。
6.如权利要求1所述的重组多形汉逊酵母菌株，其中至少一种启动子包括从多形汉逊 酵母获得的HpGAP启动子。
7.如权利要求1所述的重组多形汉逊酵母菌株，其中所述重组木糖还原酶基因是天然 多形汉逊酵母木糖还原酶基因的突变体。
8.如权利要求7所述的重组多形汉逊酵母菌株，其中所述木糖还原酶基因具有在所述 天然多形汉逊酵母木糖还原酶基因中将编码位置341赖氨酸的第一密码子变为编码精氨 酸的密码子的突变，以及将表达位置343天冬酰胺的第二密码子变为编码天冬氨酸的密码 子的突变。
9.一种制造乙醇的方法，所述方法包括在使得重组多形汉逊酵母制造乙醇的条件下， 在包括木糖的培养基中培养权利要求1-8中任一项所述的重组多形汉逊酵母菌株。
10.一种重组核酸，所述重组核酸包括来自多形汉逊酵母的编码木糖还原酶基因的序列。
11.如权利要求10所述的重组核酸，其中所述编码木糖还原酶的序列编码根据序列ID 号1的NADPH/NADH结合结构域。
12.如权利要求10所述的重组核酸，其中所述编码木糖还原酶的序列编码根据序列ID 号2的NADPH/NADH结合结构域。
13.如权利要求10所述的重组核酸，所述重组核酸根据序列ID号3。
14.如权利要求10所述的重组核酸，所述重组核酸编码根据序列ID号4的蛋白质。
15.权利要求10所述的重组核酸，所述重组核酸编码除了在根据序列ID号2的 NADPH/NADH结合结构域具有突变的根据序列ID号4的蛋白质。
全文摘要
公开了在高温木糖发酵期间的具有显著增加乙醇生产率且同时降低木糖醇生产量的重组体基因构建体和菌株。该构建体包括编码木糖还原酶的多形汉逊酵母XYL1基因，所述木糖还原酶发生突变以降低酶对NADPH的亲和力。在强组成型HpGAP启动子控制下的修饰形式的XYL1基因在Δxyl1背景中被过表达。还构建了在Δxyl1背景中过表达突变酶和天然木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的重组多形汉逊酵母菌株。在高温木糖发酵(48℃)期间评价了构建的菌株的木糖消耗、乙醇和木糖醇生产量。示出了与野生型菌株相比，重组菌株中的乙醇生产率显著增加(高达7.4倍)。此外，通过重组菌株得到的木糖醇生产量大量减少0.9mg×(L×h)-1对通过野生型菌株得到的4.2mg×(L×h)-1。
文档编号C12N1/19GK102046776SQ200980119950
公开日2011年5月4日 申请日期2009年6月1日 优先权日2008年5月30日
发明者奥莱纳·迪米特拉克, A·希博尼 安德烈, 安德烈·Y·沃罗诺夫斯基, 康斯坦丁·迪米特拉克, 查尔斯·阿巴斯 申请人:阿彻丹尼尔斯米德兰德公司