分离神经胶质干细胞的方法

专利名称：分离神经胶质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及人类或动物细胞的培养，或基因工程技术，具体是一种分离神经胶质干细胞的方法。
背景技术：
在中枢神经系统(CNS)中，少突胶质细胞(OL)形成包裹轴突的髓鞘，便于神经冲动的快速传输。哺乳动物出生前有大量少突胶质干(OP)细胞，在CNS发育过程中，OP分化为成熟OL，轴突才能正常髓鞘化。最近，对脱髓鞘的动物模型以及多发性硬化(MS)的研究表明，成熟个体的CNS中也存在OP细胞，可以分化补充丢失的OL。这些实验结果引起人们研究OP细胞分化和修复能力的极大兴趣。
目前有多种从啮齿类动物组织中分离OP和OL细胞的方法。Jean deVellis实验室建立了一种方法，从原代混合培养的新皮层细胞中分离OP细胞(McCarthy and de Vellis 1980)。最近，有报导从围产期的大鼠、小鼠或狗获得称为少突球的悬浮OP细胞团，并进一步扩增的方法。
这些细胞团的分离和扩增需要bFGF和PDGF等生长因子，以及从成神经细胞瘤细胞系B104获得的条件培养基。Vitry et al.已证明小鼠自由悬浮的干细胞球是OP前体细胞，通过在B104条件培养基中加入高浓度的胰岛素和孕酮可以获得成熟的少突球。虽然采用分离少突球的方法获得的OP细胞进行的研究得出了许多关于OP细胞生物学机制的结果，但是用这种方法获得的OP细胞有许多限制条件。单独的一个干细胞球是许多细胞的集合体，并不清楚是否所有这些细胞都有完全相同的表型，是否它们都一定分化为OL细胞。存在着分化的不确定性。另外，由上述方法获得的OP细胞在培养过程中的自发成熟程度没有经过严格的检验，这同样会使成熟和分化研究结果的解释复杂化。
为此，建立了小鼠神经少支胶质干细胞株一直是困扰在全世界范围内所有生物及神经学科学家的一道难题。鉴于神经少支胶质干细胞在进行诸如诱导细胞分化的体外细胞实验，细胞信号传导的细胞模型，分子生物学及细胞生物学研究，及用于治疗中枢神经脱髓鞘药物的筛选所扮演的重要作用，全世界范围内所有生物及神经学科学家一直在不断探索一种方法来建立无缺陷的小鼠神经少支胶质干细胞株。迄今为止获得了广泛承认的只是大鼠神经少支胶质干细胞株CG4建立。然而，由于探索病因最重要的动物模型如基因敲除技术只在小鼠身上得到应用。为了保持实验的连续性及可靠性，就必须建立有效及可靠的小鼠神经少支胶质干细胞模型。以往的小鼠神经少支胶质干细胞株都有不同的缺陷。因而并未得到全世界科学界的一致认可，也因此未得到广泛应用。
中国专利1727472公开了“一种简单分离提纯脑神经干细胞的方法”，其是利用凝胶对神经细胞进行三维立体培养，利用神经干细胞在无接着点环境中可以增殖并形成神经球的特征达到对神经干细胞的分离、扩增和提纯的目的。形成的神经球经免疫荧光标记，90％左右的细胞为Nestin阳性，说明此方法分离扩增提纯的神经干细胞快速有效。经此法分离提纯的神经干细胞可以在体外分化成神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞。

发明内容
本发明就是为了解决适用于多种基因型小鼠，采用多种细胞培养分选步骤，获得高纯度OP细胞，表型稳定，可分化为成熟OL细胞的问题，进一步建立人类少支胶质干细胞，而提供一种分离神经胶质干细胞的方法。
本发明是按以下技术方按实现的。
一种分离神经胶质干细胞的方法a.原代细胞培养乳鼠大脑皮层，移入含有HBSS的培养皿内，经吸液管吹打，细胞滤网过滤，4℃，2000rpm离心2min，收集细胞，加入0.05％胰酶-EDTA，37℃孵育；分离的细胞以每孔5×104的密度种在未包被的六孔板内增殖培养基中培养；b.mOP细胞的分离和传代收集原代培养18天后的原代培养细胞，低密度重新种植到未包被培养皿，培养2-3星期，直到出现OP细胞群，分离；置于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育，传代20次获得为mOPpri细胞，传代50次获得mOP细胞。
所述分离神经胶质干细胞的方法，其低密度种植是以1.0×102低密度种植到60mm未包被培养皿。
所述分离神经胶质干细胞的方法，其重新种植OP细胞的培养皿作为“母皿”，附在150mm培养皿底部，在每个150mm培养皿中放置一个60mm“母皿”，为了从“母皿”中获得OP细胞，将2-6个空白未包被的60mm“俘获皿”用一滴无菌琼脂糖分别粘在150mm大皿底部。在大皿内加入PM淹没60mm培养皿。
这样，经本发明建立的细胞株可广泛应用于有关于干细胞分化条件下的基础研究，包括诱导细胞分化的体外细胞培养，细胞信号传导的细胞模型，分子生物学及细胞生物学研究；用于治疗中枢神经脱髓鞘疾病的病因探索及药物筛选；进一步可以用此方法分离并建立人类神经少支胶质干细胞株，因而对所有脱髓鞘疾病，如多发性硬化症等有重大的治疗意义；以及体内用于中枢神经髓鞘再生动物实验，行为学研究，并结合各类生长因子进行体内及体外的综合研究。
本发明较之其他任何方法都更加简单。不用振荡筛选，不用抗体，培养皿也不用包被。因而时间及成本都大大降低。
本发明第一次在全世界范围内建立了小鼠神经少支胶质干细胞株。纯度达到100％，表达所有的神经少支胶质干细胞特异抗原，经过长期培养，染色体没有突变。而且，体内及体外实验都证实可以分化为成熟的少支胶质细胞。


图1A是分离自第5天新生小鼠大脑皮层原代培养6天的细胞形态；图1B是分离自第5天新生小鼠大脑皮层原代培养18天的细胞形态；图1C是胰酶消化后的二次培养2周后生长情况；图1D是俘获并分离的少支胶质干细胞mOPpri；图2A是传代20代前的mOPpri细胞形态；图2B是传代50代后的mOP细胞形态；图3A是mOP细胞在PM培养液中增殖并借助肝素传代细胞；图3B是2周后分化成熟的mOP细胞；图3C是实时PCR分析胶质干细胞Nestin，NG2及成熟少支胶质细胞MBP，MAG，PLP，MOG，MOBP的表达情况对比分析。
具体实施例方式
材料和方法动物，细胞系和培养基C57BL/6J小鼠由Jackson实验室购得。大鼠B104成神经细胞瘤细胞系由Kekule-Institutfur Organische Chemie und Biochemie，Bonn，De提供，培养基DMEM/F12，1％青霉素/链霉素，10％胎牛血清(Bottensteinand Sato 1979)增殖培养基(PM)10μg/ml生物素(Sigma)，5μl/ml N1(Sigma-Aldrich)，30％的B104条件培养基，溶于DMEM溶液中。细胞培养用试剂无特别说明均购于Invitrogen。细胞滤网和Falcon管购于Falcon Labware。
原代细胞培养出生一天的乳鼠深度麻醉，大脑转移到未包被的培养皿内。去掉脑膜小心分离出新皮层，转移到含有Hanks平衡盐溶液(HBSS)的培养皿内。在50ml的Falcon管中用吸液管反复吹打，依次用70μm和40μm直径的细胞滤网过滤。4℃，2000rpm离心2min，收集细胞，加入0.05％胰酶-EDTA，37℃孵育5min，进一步分离细胞。台盼蓝染色细胞计数，以每孔5×104的密度种在未包被的六孔板内，培养基为PM。
mOP细胞的分离和传代原代培养18天后收集细胞，以1.0×102低密度种植到60mm未包被培养皿，培养2-3星期，直到出现OP细胞群并扩增。重新种植OP细胞的培养皿作为“母皿”，附在150mm培养皿底部(每个150mm培养皿中放置一个60mm“母培养皿”)。为了从母皿中获得OP细胞，将空白未包被60mm“俘获皿”(2-6个)用一滴无菌琼脂糖粘在150mm大皿底部。在大皿内加入PM淹没60mm培养皿，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育。“俘获皿”，有单个细胞源OP细胞出现，则转移培养皿到培养箱中使OP细胞进一步增殖。此时的细胞定义为小鼠原代少突胶质干(mOPpri)细胞。扩增后分装，在液氮中冷冻保存，备用。
mOPpri细胞每三天传代，0.05％胰酶-EDTA37℃，5％二氧化碳培养箱内消化10min。消化后的细胞收集到15ml离心管中，4℃，2000rpm离心2min，种植于未包被的T75培养瓶中，种植液为新鲜PM，置于37℃，5％二氧化碳培养箱内。传代20次获得mOPpri细胞，传代50次获得小鼠少突胶质干(mOP)细胞。
体外mOP细胞诱导分化体外诱导的标准程序是1)mOP细胞用0.05％胰酶-EDTA消化，收集，用1×HBSS洗，重新种植于T75培养瓶中，密度1×105。2)每天用不含胰酶的PM培养基换液，未贴壁细胞被清除。3)偶尔会出现成团细胞，轻轻摇动培养瓶，更换不含胰酶的培养基可以消除这些细胞团。2周后mOP细胞出现典型的分化表型。
实时RT-PCR从三个T75培养瓶中收集mOP细胞混合，用RNeasy mini试剂盒，依照制造商提供说明，提取总RNA。cDNA由400ng/90μl总RNA，SuperScriptFirst-Strand RT-PCR合成系统(Invitrogen)合成。表2列出了用于RT-PCR分析的引物序列。400ng反转录总RNA(用Sybr Green缓冲液稀释)，正义、反义引物各200nM，终体积25μl，采用Sybr Green PCR核心试剂，以及ABIPRISM7700序列探测系统仪进行实时定量RT-PCR分析。RT-PCR产物用溴化乙啶进行琼脂糖凝胶染色，确保只有预期大小的单一扩增产物。对于mOP细胞基因表达分析，诱导后细胞任意给定基因的相对表达量用与对照细胞(未诱导)的倍数变化来表示。
免疫细胞化学和免疫组化
A2B5杂交瘤由American Type Culture Collection获得。NG2抗体，NeuN，GD3，和O4抗体购于Chemicon，GFAP，MBP，PLP，MAG抗体购于Santa Cruz Biotechnology。CD11b抗体购于Serotec。荧光二抗购于Jackson Immunoresearch，DAPI封片剂购于Vector Laboratories。mOPpri或mOP细胞在六孔板里未包被的玻片上培养，4％多聚甲醛固定30min，1-5％牛血清白蛋白(BSA)室温终止0.5-2hrs，一抗用1％BSA-PBS稀释，4℃孵育过夜。
抗体稀释比例NG2(1∶1000)；NeuN(1∶2000)；GD3(1∶100)；O4(1∶100)；GFAP(1∶1000)；MBP(1∶100)；PLP(1∶100)；MAG(1∶100)；CD11b(1∶100)。PBS洗三次，荧光二抗用1％BSA-PBS(磷酸缓冲液磷酸钠盐50mM，NaCl 200mM，pH7.4)按1∶500稀释，室温避光孵育45min。玻片用PBS清洗3次，每次5min，之后用DAPI封片剂封片，荧光显微镜观察。
冷冻的动物大脑在Hacker低温保持箱中切为8μm的切片，4％多聚甲醛固定10min，之后用0.1％的Triton-X100处理5min。多克隆兔抗EGFP血清(1∶1000，Molecular Probes)和山羊抗-MBP(1∶200，Santa Cruz)用于双染。所有Cy2/Cy3标记的荧光二抗都购于Jackson。
细胞计数和凋亡研究用96孔板中的六孔重复种植mOP细胞，密度5×103，种植液PM。从每一孔中任选三个独立视野计数，计算平均值，得到细胞数目。对于保护作用实验，mOP细胞以每孔1×104的密度种于96孔板。细胞凋亡用膜连蛋白-V-FITC和PI双染色的方法评价(凋亡探测试剂盒，Biovision)。
用荧光计和荧光显微镜研究mOP细胞分化MBP/A2B5荧光比用来量化mOP细胞的分化程度。如前所述方法在24孔未包被培养皿内培养mOP细胞，并对MBP和A2B5做免疫染色。Cy2/MBP的激发/发射波长为485/528，Cy3/A2B5的激发/发射波长为530/590，用荧光计测量，KC4软件(Bio-Tek)分析。
mOP细胞的体内分化mOP细胞占培养皿底面积50％后，用慢病毒pSico-EGFP(由Dr.TylerJacks惠赠)转染同时加入polybrene 8μg/ml。3天以后用荧光显微镜观察，90％以上mOP细胞呈现EGFP阳性。mOP细胞用0.05％胰酶-EDTA消化，5mlHBSS洗三次，每次2000rpm，2min。最后一次离心后进行细胞计数，以5×104/μl密度重悬于HBSS。
激光捕获微切片(LCM)来源细胞的切片，激光捕获和RNA提取所有的步骤都在无RNase的情况下操作。植入EGFP-mOP细胞的小鼠脑径向切片速冻于置于干冰上的异甲基丁烷中。冰冻脑片在沿纹状体切成8um厚，立即放到位于干冰上的铝箔纸上。立刻在剃度乙醇溶液脱水，然后在二甲苯中孵育两次，每次两分钟进行清洗。将切片置于封闭湿盒5分钟，在使用PixCell II LCM系统进行LCM之前可以将切片保存在切片盒置于干燥容器中最多3小时。如前所述，LCM系统使用功率为75mM，持续时间750us，点样大小7.5um，靶电位为20mV。总RNA的提取按照QIAGEN的RNA提取试剂盒的流程来进行。总RNA溶于无RNase水中，然后对其浓度进行定量分析。将总RNA分装-70度保存。
结果混合小鼠脑细胞的原代培养培养取材于新生小鼠新皮层，扩增OP细胞，在B104条件增殖培养基中培养。培养到六天的时候，培养细胞有了显著的增殖(图1A)，并且形态各异的细胞都存在，OP细胞通过其胞体小，双极或三极的形态特征和相差显微镜下的双折射现象而得以识别。OP细胞的增殖将持续到18天培养皿长满为止(图1B)。
二次混合培养扩增小鼠OP细胞为了从18天的原代培养中纯化OP细胞，将细胞胰酶消化下来，重新以低浓度(1.0×102)种到含PM培养基的未经包被处理的60mm培养盘中，促进单细胞增殖集落的形成(“二次培养”)。经过1-2周的生长，我们可以检测到单细胞增殖集落(图1C)。在这些集落中的细胞表现出类似原代培养18天观察到的OP细胞具有双极或三极形态，以及相差显微镜下双折射的特征。当把非贴附细胞收集重新种在新的培养盘后，一周后就可以观察明显的OP细胞生长。
小鼠OP细胞的高纯度培养在原代和二次培养中观察到的OP细胞相对于其他脑细胞的低贴附性，并被用于在高纯度OP细胞培养中。将未包被的60mm培养盘(俘获皿)放在一个更大的培养盘底部。一个二次原代培养盘(母皿)也放在这个大培养盘的底部，大培养盘内加上PM培养基直到母皿和俘获皿都被浸没。观察俘获皿，直到出现单细胞增殖集落，这时候将俘获皿移出来，放回到培养箱中继续培养扩增和分化。用这个方法得到早期传代小鼠OP细胞，在下文就叫做mOPPri细胞(图1D)。
早期传代mOPPri细胞的鉴定当把OP细胞在PM培养基中传大概20代后，用多种OP细胞和成熟少突胶质细胞标志物来鉴定mOPPri细胞的成熟程度。完全分化成熟的少突胶质细胞表达髓磷脂形成所需的特异成分，包括半乳糖苷(GalC)，髓磷脂相关糖蛋白(MAG)，髓磷脂基础蛋白(MBP)，髓磷脂蛋白(PLP)，髓磷脂相关少突胶质细胞基础蛋白(MOBP)。
mOPPri细胞种在未包被的玻璃片上，PM培养2天，免疫细胞化学检测其成熟程度。所有的mOPPri细胞为A2B5阳性，而98.6％的细胞表现GD3阳性，97.2％的细胞表现O4阳性。82％的mOPPri细胞为NG2阳性。mOPPri细胞中高比例的A2B4和O4阳性细胞表明大多数细胞处于OP少突胶质母细胞的晚期。4％-6％的细胞为MAG，MBP和PLP阳性，但没有细胞染上小胶质细胞标志物CD11b。小部分细胞染上了星型胶质细胞的标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(＜0.2％)和神经元标志蛋白NeuN(＜0.1％)，(图2A，图2B，表1mOPPri)。OP细胞和少突胶质细胞标志物在培养细胞中的分布范围，表明处于早期传代的mOPPri细胞在PM培养基中培养有自发分化的趋势。将mOPPri细胞种到未包被培养盘中，连续8天不更换PM培养基来进一步鉴定这种自发成熟趋势。2天后mOPPri细胞开始表现出分化的形态特征。4至8天后基本所有的细胞都被观察到有复杂的多分枝形成。
具有稳定OP细胞特征的mOP细胞筛选尽管存在mOPPri细胞的自发成熟，在每次传代后都可以观察到较多数目的双极mOPPri细胞(图3A)。这些细胞是进行了自我更新重新成为早期OP细胞。第50代的mOP细胞表现出整个培养过程中一致出现的双极或三极OP细胞的形态(图3B)。
另外，对mOPPri细胞的免疫组化分析表明其自发成熟的趋势显著减少。很明确的一点是，100％的培养mOP细胞为OP标志物Nestin，A2B5和NG2染色阳性。82％的细胞染上了GD3，只有36％的细胞染上了晚期OP阶段标志物O4(图2A，图2B，表1mOP)。MBP，MAG，或PLP均未观察到阳性染色，也没有任何GFAP或NeuU染色的存在。
另外根据mOP细胞有稳定的OP细胞形态，在不更换PM培养基的连续5天观测细胞数目翻倍时间与MBP/A2B5染色比例的关系(图略)，在3天和5天的时候可以观察到凋亡细胞的增多(图略)。
mOP细胞在细胞培养中的分化为了分离富含已分化为少突胶质细胞的mOP细胞，用选择培养基来筛选高度贴壁的细胞。先用胰酶将mOP细胞消化下来，重新以一个低密度种到未包被培养盘中。漂浮细胞通过每天换PM培养基的方法去除。在培养过程中偶尔可见少突胶质细胞球，轻摇培养皿，使少突胶质细胞球脱离皿底漂浮，更换培养基从而去除这些细胞聚集物。两周后，培养皿中绝大多数的细胞具有成熟少突胶质细胞的形态特征。为进一步确认这种分化，使用即时RT-PCR技术在未分化mOP细胞和分化mOP细胞中分析少突胶质前体细胞和少突胶质细胞特异表达基因的mRNA水平。
检验bHLH转录因子Olig1和Olig2的mRNA水平依据Olig1在脱髓鞘损伤的修复中发挥作用，而Olig2在OP细胞的特化中起作用。在分化mOP细胞和少突胶质细胞特异基因表达的诱导是通过计算分化mOP细胞mRNA与mOPPri细胞mRNA的比例来确定的。当在分化mOP细胞中编码Nestin和NG2的mRNAs表达水平低时，编码少突胶质细胞特异MBP，MAG，PLP，MOG和MOBP的mRNA显著地上升。另外，Olig2(而不是Oligl)的mRNA在分化mOP细胞中有上升，GFAP(星型胶质细胞标志蛋白)，βIIITublin(神经元标志蛋白)和CD11b(小胶质细胞)的mRNA则未见上升(图3C)。
mOP细胞在小鼠脑中的分化将mOP细胞用慢病毒pSico标记上EGFP(mOP-EGFP)，将它们立体注射到成年小鼠胼胝体和右脑室中检验其体内分化潜能。移植三周后，处死动物做大脑切片，用EGFP-Cy2和MBP-Cy3两种抗体做双标。可以检测到在整个大脑内植入mOP-EGFP细胞的迁移(图略)。
免疫组化的结果表明mOP-EGFP细胞可以成为髓鞘形成细胞，尤其在小鼠脑的白质区域。进一步用激光捕获胼胝体或皮层处单个EGFP阳性细胞研究其区域特异分化，用少突胶质前体细胞和少突胶质细胞特异引物对进行即时RT-PCR。各自的标志物mRNA表达(诱导)水平通过mOP-EGFP-胼胝体和mOP-EGFP-皮层的比值来确定。在胼胝体和皮层分布的mOP-EGFP细胞编码α-actin，Nestin，NG2，Olig1，GFAP，βIIITublin和CD11b的mRNA水平基本没有变化。但是，比起皮层处的mOP-EGFP细胞，胼胝体处的mOP-EGFP细胞有MBP，MAG，PLP和Olig2的mRNA的强烈诱导表达(图略)。
表1MOP细胞的表形及特征

表2实时PCR的引物

权利要求
1.一种分离神经胶质干细胞的方法，其特征在于a.原代细胞培养乳鼠大脑皮层，移入含有HBSS的培养皿内，经吸液管吹打，细胞滤网过滤，4℃，2000rpm离心2min，收集细胞，加入0.05％胰酶-EDTA，37℃孵育；分离的细胞以每孔5×104的密度种在未包被的六孔板内增殖培养基中培养；b.mOP细胞的分离和传代收集原代培养18天后的原代培养细胞，低密度重新种植到未包被培养皿，培养2-3星期，直到出现OP细胞群，分离；置于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育，传代20次获得为mOPpri细胞，传代50次获得mOP细胞。
2.根据权利要求1所述分离神经胶质干细胞的方法，其特征在于低密度种植是以1.0×102低密度种植到60mm未包被培养皿。
3.根据权利要求1所述分离神经胶质干细胞的方法，其特征在于重新种植OP细胞的培养皿作为“母皿”，附在150mm培养皿底部，在每个150mm培养皿中放置一个60mm“母皿”，为了从“母皿”中获得OP细胞，将2-6个空白未包被的60mm“俘获皿”用一滴无菌琼脂糖粘分别在150mm大皿底部，在大皿内加入PM淹没60mm培养皿。
全文摘要
本发明公开了一种分离神经胶质干细胞的方法，属于人类或物细胞的培养，或基因工程技术。本发明首先进行原代细胞培养，将乳鼠大脑皮层，经细胞滤网过滤，收集细胞，孵育，分离的细胞在增殖培养基中培养；然后将原代培养细胞种植、培养2－3星期至出现OP细胞，分离，孵育，传代20次获得为mOPpri细胞，传代50次获得mOP细胞。经这样的设计，本发明已经开发出一种新的少支胶质干细胞模型及分离方法，大大方便了少突胶质细胞成熟、分化和功能的体内体外研究。本发明采用多阶段细胞培养的分选步骤，获得高纯度OP细胞，适用于各种基因敲除型小鼠，其表型稳定，解决了在体内、外少支胶质干(op)细胞分化为成熟的少支胶质细胞问题。
文档编号C12N5/06GK101033459SQ200610082339
公开日2007年9月12日 申请日期2006年5月24日 优先权日2006年3月10日
发明者林彤 申请人:林彤