用于治疗神经变性症状的人类神经细胞的移植的制作方法

用于治疗神经变性症状的人类神经细胞的移植的制作方法
【专利摘要】提供了治疗神经变性症状的方法。可以在神经元变性区域和/或远离神经元变性区域移植神经干细胞。方法包括从生成与要替换的神经元相对应的特定类型神经元的区域中分离出神经干细胞。方法包括分离出分泌影响特定类型神经元的生长和/或再生的生长因子的神经干细胞。在本发明中，我们公开了通过移植外部培养和扩增的神经祖细胞来治疗这类病症的方法，该病症包括由于缺乏在神经回路中产生特定神经递质的细胞而出现的数种神经变性病症，上述神经祖细胞在移植到神经组织中时分化成能够以足以制服神经变性相关症状的量和方式结合和制造神经递质的神经元。
【专利说明】用于治疗神经变性症状的人类神经细胞的移植
[0001] 本申请是申请号为200580039450. 0、发明名称为"用于治疗神经变性症状的人类 神经细胞的移植"的申请的分案申请，该母案申请是2005年11月17日提交的PCT申请PCT/ US2005/041631进入中国国家阶段的申请。

【技术领域】
[0002] 本发明所公开的方法涉及通过特别有益于这类治疗方法的细胞的移植治疗病症 的方法。特别地，所公开的方法提供了用神经干细胞（NSCs)治疗神经变性病症的方法。

【背景技术】
[0003] 神经变性病症以伴有由疾病、遗传性症状或创伤（例如外伤性或缺血性脊髓或脑 损伤）引起的神经元退化的症状为特征。
[0004] 控制肢干骨骼肌收缩的脊髓回路包括激感运动神经元和抑制性GABA能（即生成 GABA的）和甘氨酸能（即生成甘氨酸的）中间神经元。运动神经元是源自脊髓灰质前角的 神经。运动神经元的轴突作为刺激肌肉纤维的传出运动纤维自脊髓节段中出现。运动神经 元进行的搏动刺激肌肉纤维收缩。GABA，γ-氨基丁酸，是哺乳动物神经系统的天然生成的 代谢物，其充当神经递质以抑制或压制电势的神经传导。GABA能中间神经元的缺失导致运 动神经元引起的肌肉收缩的抑制性调节异常（dysregulation)。在没有抑制性中间神经元 对兴奋性神经元的控制的情况下，发生兴奋性神经元的烧毁，这导致肢干肌肉的痉挛性不 受控收缩或不受控僵硬。运动神经元的缺失导致驰缓性截瘫，在该疾病中，患者不能收缩肌 肉并因此不能移动。
[0005] GABA能中间神经元在脊髓中受损的一个例子包括与胸降或胸腹主动脉的暂时阻 断相关的并发症。这种阻断是血管手术中修复胸腹主动脉的动脉瘤所必须的步骤。在阻断 持续期间，部分脊髓不能获得血液循环并可能变成缺血性的。根据缺血间隔的持续时间，随 后的神经变性机能障碍可能神经变性地表现为下肢轻瘫或完全形成的痉挛性或驰缓性截 瘫。
[0006] 尽管只部分了解引起缺血诱发性神经变性的机制且可能涉及兴奋性氨基酸、前列 腺素和/或氧自由基的过度释放/活性，受暂时缺血性损害影响的脊髓神经元种群是确定 的。例如，从具有完全形成的痉挛性截瘫的动物中取出的脊髓的组织病理学分析表现出小 抑制性神经元的选择性损失；但是，α-神经运动元仍然存在于之前缺血的脊柱节段中。已 经描述了具有脊柱缺血性损伤的人类对象中类似的脊柱神经元病理学。
[0007] 相反，在患有驰缓性截瘫的动物中，看出pan-necrotic神经变性变化，这影响了 小的抑制性和兴奋性中间神经元以及腹侧运动神经元。在脊柱局部缺血后的神经元变性期 间，如同在病灶性或全面脑缺血中那样，也观察到局部小神经胶质的损伤依赖型活化和炎 性变化，例如被巨噬细胞浸润。根据损伤程度，炎性变化通常在缺血性损伤后两天至七天达 到顶峰，然后在两周至四周的后缺血性期间表现出炎性成分的逐渐丧失。
[0008] 在过去二三十年，已经作出相当大的努力以在动物模型中评估各种材料的脊柱移 植的治疗潜力。因此，已经在数种脊柱损伤（包括机械外伤性损伤、化学损伤的脊髓）的模 型或具有进行性α-运动神经元变性的遗传控制动物（ALS转基因小鼠或大鼠）中使用直 接脊柱基因疗法改善神经变性机能障碍。
[0009] -般而言，研究证实神经元表型在由胎儿组织，而不是由已经在体外扩增的神经 前体生成的移植物中的长期存活和保存。实际上，体外扩增并移植到机械或化学损伤脊髓 中的神经前体的仅仅有限的神经元分化和成熟已经得到证实。细胞优先分化成非神经元细 胞类型。尽管这种优先的非神经元分化的机制没有被完全了解，但假设可能涉及促炎细胞 因子（例如TNF a、TGF β )在先前损伤位置的局部释放。
[0010] 神经变性代表细胞疗法的特别具有挑战性的生物环境，且既定神经变性疾病中存 在的细胞死亡信号（Rothstein等人，1992 ;Howland等人，2002 ;Turner等人，2005)可能与 移植物存活不相容。此外，成人脊髓被视为缺乏允许再生的细胞和/或信号（Park等人， 2002)，且大部分NSC移植研究已经表现出差的或有限的分化（Cao等人，2002 ;Yan等人， 2003 ;Yan 等人，2004)。
[0011] 细胞疗法中的主要问题之一是移植的细胞的低细胞存活（低于5% )。迄今所有 移植的细胞在体内注射后不久就产生显著的细胞死亡。因此，为了输送有效剂量的细胞，最 终剂量必须以至少20倍注射。这又要求大得多的细胞制造规模，这引起更进一步的规章和 经济障碍。此外，这类细胞在体内的存活率不能保持。不能证明有效剂量的细胞疗法的可 再现施用就不能被政府和其它管理机构（例如食品和药品管理局）批准使用。
[0012] 当治疗神经变性疾病和在大面积的身体、组织或器官（例如整个神经系统）而非 单个局部区域上散布的症状时，产生更多挑战。例如，在ALS中，神经变性涉及沿整个脊髓 的运动神经元以及运动皮层中的那些神经元的缓慢死亡。同样，在多数溶酶体病中，神经元 破坏牵涉脑和脊髓的多数区域。阿尔茨海默氏症牵涉大脑的大部分。即使在更局部的神经 变性疾病，例如帕金森症和亨廷顿氏舞蹈病中，受影响的纹状体面积也相当大，比手术可以 到达的移植区域大得多。因此，神经变性疾病的细胞疗法预计需要更宽的移植程序。
[0013] 因此，需要改进的治疗神经变性症状的方法。还需要改进的培养和移植动物神经 干细胞和人类神经祖细胞的方法，这类细胞一经移植，就可以克服之前发现的所有限制并 提供功能益处。因此，这种治疗神经变性症状的方法在体内产生强劲的神经元分化，能够实 现在各种变性条件下的长期神经元存活和在缺乏发育信号（developmental cues)的成人 组织中成熟成与治疗相关的神经元亚种群，并提供比细胞本身的位置宽的治疗范围。


【发明内容】

[0014] 所公开的方法包括治疗神经变性症状的方法。特别地，所公开的方法包括将已经 体外扩增的NSCs、神经祖细胞或神经前体移植到需要它们的对象体内，从而使这些细胞可 以改善神经变性症状。在一个实施方案中，所公开的方法包括确认、分离、扩增并制备要用 于治疗神经变性症状的供体细胞。可以选择要移植的供体细胞以对应于对该症状、其征候 和/或其效应有作用的单元或其欠缺。
[0015] 所公开的方法的细胞包括在移植时产生足以结合到神经元下部结构中以改善病 状或症状的量的神经元的细胞。在一个实施方案中，所公开的方法包括通过移植从哺乳动 物的中枢神经系统中分离出的并已经在体外扩增的多能神经祖细胞或神经干细胞来治疗 神经变性疾病或症状。例如，扩增的神经干细胞的移植可用于在患有各种形式脊髓病（伴 有痉挛状态、僵硬、抽搐、麻痹或任何其它肌肉活动过度的征候）的对象中改进行走功能。
[0016] 治疗方法可以包括经由移植向受损神经区域供应适当数量的NSCs，其可以分化成 足量的GABA能神经元和/或甘氨酸能神经元以减弱有缺陷的神经回路，包括活动过度的神 经回路。
[0017] 在一个实施方案中，所公开的方法包括在运动神经元疾病中恢复运动功能。可以 向至少一个神经变性区域，例如神经变性脊髓供应能够分化成运动神经元的适当数量或治 疗有效量的NSCs或神经祖细胞以恢复运动功能。NSCs通过取代变性的神经肌肉接点来发 挥其治疗效果。
[0018] 协同地或替代性地，NSCs通过表达和释放出保护变性组织的神经元以使它们更多 地存活更长时间的营养分子来发挥其治疗效果。可以促使NSC源神经元投射到脊神经前根 中并刺激肌肉，其中NSCs参与患有变性运动神经元疾病的患者体内与宿主运动神经元的 广泛相互联系。因此，在一个实施方案中，来自人类胎儿脊髓的NSCs可以移植到腰索中，在 此这些细胞可以分化成与宿主神经元形成突触性接触并表达和释放出运动神经元生长因 子的神经元。
[0019] 在一个实施方案中，所公开的方法包括提供神经干细胞或神经祖细胞，它们与宿 主组织结合并为宿主神经元提供一种或多种生长因子以保护它们免受组织中存在的变性 影响。该方法包括在脊髓区域中引入足量的NSCs或神经祖细胞以使NSCs分泌有效量的至 少一种生长因子。
[0020] 在一个实施方案中，所公开的方法包括提供在神经变性症状中进行细胞替换的干 细胞的临床前评测中使用动物模型的方法。
[0021] 在一个实施方案中，所公开的方法包括提高移植的NSCs分化成神经元的效力。该 方法包括使高度富集的NSCs或神经祖细胞以其未分化状态扩增，从而在移植时，移植物中 足量（例如20% )的细胞选定神经元方向（fate)。
[0022] 在一个实施方案中，所公开的方法包括在不提高要移植的NSCs或神经祖细胞数 量的情况下提高分化细胞的数量。在一个实施方案中，该方法包括以下述方式制备扩增的 供体种群--一经移植，NSCs或神经祖细胞就高达十倍地在体内分裂且不形成肿瘤，由此 有效地提高输送细胞的总数。
[0023] 所公开的方法的细胞可以分离自或获自非人类的哺乳动物的胎儿、新生儿、青少 年、成人或死后组织。所公开的方法的细胞可以分离自或获自中枢神经系统、血液或分化成 神经元的干细胞的任何其它合适来源。细胞也可以获自胚胎干细胞。例如，在一个实施方 案中，细胞包括从发育中的胎儿脊髓中分离出的神经上皮细胞。在某些例子中，神经前体细 胞可以是从中枢神经系统的特定子区域中分离出的神经祖细胞。
[0024] 根据所公开的方法，神经干细胞在培养时扩增。在一个实施方案中，神经前体细胞 可以是能够在培养时扩增并能够在分化时生成神经元和神经胶质的多能NSCs。
[0025] 在移植时，细胞可以是未分化的、在体外预分化或完全分化的。在一个实施方案 中，诱导细胞分化成神经谱系（lineage)。所公开的方法的细胞可以在促炎细胞因子和受损 组织中存在的其它环境因子的存在下就地进行神经元分化。
[0026] 使用本方法，可以通过将细胞移植或引入适合改善疾病、失调或症状的区域来处 理神经回路。通常，移植到支持移植细胞存活的神经组织或非神经组织中。在所公开的方 法中使用的NSC移植物在神经变性环境中良好地存活，在此NSCs可以以延缓神经变性症状 或疾病的发作和推进的形式发挥有力的临床作用。
[0027] 在一些情况下，可以移植到身体的边远（remote)区域中，且细胞可以迁移到其预 计靶点。相应地，所公开的方法也可以包括人类NSCs的部分移植。本文所用的术语"部分 移植"是指在部分神经变性区域中移植扩增的NSCs。例如，将人类NSCs部分移植到脊髓的 腰段中。NSCs对变性运动神经元的至少部分作用包括将神经营养素和营养细胞因子经由典 型细胞机制输送到变性宿主运动神经元中。为此，使用所公开的方法部分移植到脊髓腰段 中的NSCs在患有运动神经疾病的转基因动物模型中表现为存活、产生大量神经元分化、促 进运动神经元存活并在移植临近区域以及远离移植区域的区域中发挥作用。
[0028] 相应地，所公开的方法提供了治疗痉挛状态、僵硬或肌肉活动过度症状的方法。该 方法包括从哺乳动物中分离出至少一个神经干细胞并使神经干细胞体外扩增成扩增种群。 该方法还包括使扩增种群浓缩并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区 域。至少20%的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。
[0029] 在一个实施方案中，症状源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑损伤、 中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢性局 部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
[0030] 在一个实施方案中，从选自中枢神经系统、外周神经系统、骨髓、周围血液和脐带 血中分离出神经干细胞。
[0031] 在一个实施方案中，哺乳动物是发育中的非人类的哺乳动物（developing mammal)〇
[0032] 在一个实施方案中，发育中的非人类的哺乳动物的胎龄为大约6. 5至大约20周。
[0033] 在一个实施方案中，从人类胎儿脊髓中分离出神经干细胞。
[0034] 在一个实施方案中，扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干细 胞。
[0035] 在一个实施方案中，扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因子。
[0036] 在一个实施方案中，生长因子选自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它们的组合。
[0037] 在一个实施方案中，治疗有效量的扩增种群能够在体内生成至少1000个GABA能 神经元。
[0038] 在一个实施方案中，治疗有效量的扩增种群能够在体内生成至少1000个甘氨酸 能神经元。
[0039] 在一个实施方案中，至少40 %的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。
[0040] 在一个实施方案中，引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一部分 注入接受者脊髓的多个区域。
[0041] 在一个实施方案中，至少30 %的扩增种群能够在体外分化成神经元。
[0042] 在另一实施方案中，提供神经干细胞。该神经干细胞能够治疗痉挛状态、僵硬和肌 肉活动过度症状。该神经干细胞分离自哺乳动物中并在体外扩增成扩增种群。将包括该神 经干细胞的扩增种群浓缩，并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域。 至少20%的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。
[0043] 在所公开的方法的另一实施方案中，提供了治疗慢性疼痛的方法。该方法包括从 哺乳动物中分离出至少一个神经干细胞并将神经干细胞体外扩增成扩增种群。该方法还包 括使扩增种群浓缩并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域。至少20% 的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。
[0044] 在一个实施方案中，慢性疼痛源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑损 伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢性 局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
[0045] 在一个实施方案中，治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个GABA能神经元。
[0046] 在一个实施方案中，治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个甘氨酸能神经 J Li 〇
[0047] 在一个实施方案中，至少40 %的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。
[0048] 在一个实施方案中，引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一部分 注入接受者脊髓的多个区域。
[0049] 在一个实施方案中，这些区域包括背角。
[0050] 在一个实施方案中，这些区域包括鞘内空间。
[0051] 在进一步实施方案中，提供神经干细胞。该神经干细胞能够治疗慢性疼痛。该神 经干细胞分离自哺乳动物中并在体外扩增成扩增种群。将包括该神经干细胞的扩增种群浓 缩，并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域。至少20%的扩增种群能 够在接受者脊髓中生成神经元。
[0052] 在所公开的方法的另一实施方案中，提供了治疗运动神经元变性的方法。该方法 包括从哺乳动物中分离出至少一个神经干细胞并将神经干细胞体外扩增成扩增种群。该方 法还包括使扩增种群浓缩并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域。至 少20%的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。
[0053] 在一个实施方案中，运动神经元变性源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤 性脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化 症、慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
[0054] 在一个实施方案中，该方法包括从富含至少一种神经元亚型的区域中分离出神经 干细胞，其中该神经元亚型产生能够有效改善运动缺陷的生长因子。
[0055] 在一个实施方案中，扩增种群包括一定量的能够分化成足以分泌治疗有效量的至 少一种生长因子的神经元的神经干细胞。
[0056] 在一个实施方案中，该方法包括从富含运动神经元的区域中分离出神经干细胞。
[0057] 在进一步实施方案中，提供能够治疗脊髓空洞症的神经干细胞。该神经干细胞分 离自哺乳动物并在体外扩增成扩增种群。将包括该神经干细胞的扩增种群浓缩，并将治疗 有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域。至少20%的扩增种群能够在接受者脊 髓中生成神经元。
[0058] 在所公开的方法的另一实施方案中，提供了治疗脊髓空洞症的方法。该方法包括 从哺乳动物中分离出至少一个神经干细胞并使神经干细胞在体外扩增成扩增种群。该方法 还包括使扩增种群浓缩并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的脊髓空洞。至少20% 的扩增种群能够在接受者脊髓的脊髓空洞中生成神经元。
[0059] 在一个实施方案中，脊髓空洞症源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑 损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢 性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
[0060] 在一个实施方案中，该方法包括从富含至少一种神经元亚型的区域中分离出神经 干细胞，其中该神经元亚型产生能够有效改善脊髓空洞症的生长因子。
[0061] 在一个实施方案中，包括从富含运动神经元的区域中分离出神经干细胞。
[0062] 在一个实施方案中，扩增种群包括一定量的能够分化成足以分泌治疗有效量的至 少一种生长因子的神经元的神经干细胞。
[0063] 在一个实施方案中，治疗有效量的扩增种群能够生成至少1，000个神经元。
[0064] 在一个实施方案中，将扩增种群的至少100, 000个神经干细胞引入接受者脊髓的 脊髓空洞中。
[0065] 在再一实施方案中，提供能够治疗脊髓空洞症的神经干细胞。该神经干细胞分离 自哺乳动物并在体外扩增成扩增种群。将包括该干细胞的扩增种群浓缩，并将治疗有效量 的扩增种群引入接受者脊髓的脊髓空洞。至少20%的扩增种群能够在接受者脊髓的脊髓空 洞中生成神经元。
[0066] 在所公开的方法的再一实施方案中，提供了将至少一个神经干细胞扩增成神经干 细胞的扩增种群的方法。每次神经干细胞扩增在不分化的情况下超过30次细胞倍增。该 方法包括从中枢神经系统组织中离解神经干细胞并向培养皿提供至少一种细胞外蛋白质。 细胞外蛋白质包括至少大约10微克/毫升的聚-D-赖氨酸和大约1毫克/毫升纤连蛋白。 该方法还包括在培养皿中在不存在血清的情况下培养离解的神经干细胞并在培养皿中添 加至少一种生长因子。生长因子选自bFGF、EGF、TGF-α、 aFGF和它们的组合。该方法进一 步包括使培养的细胞在汇合之前传代（passaging)。
[0067] 在一个实施方案中，扩增的神经干细胞能够分化成神经元。
[0068] 在一个实施方案中，将神经干细胞扩增包括将纤连蛋白作为可溶因子添加到培养 基中。
[0069] 在一个实施方案中，离解细胞并使细胞传代包括酶促离解。
[0070] 在一个实施方案中，酶促离解包括用胰蛋白酶处理细胞。
[0071] 在一个实施方案中，将治疗有效量的扩增种群引入接受者神经系统的至少一个区 域中以治疗神经变性症状。
[0072] 因此，所公开的方法优于现有药理学方案的优点是提供促进移植的NSCs分泌营 养分子的能力的方法，这些营养分子可以在最佳生物利用率的条件下输送到变性运动神经 元中。
[0073] 所公开的方法的再一优点包括提供实现NSCs种群的更高比例的神经元分化的方 法。
[0074] 所公开的方法的再一优点包括实现来自NSCs的部分移植的临床作用。
[0075] 在本发明和附图的下列详述中描述并容易看出所公开的方法的其它特征和优点。

【专利附图】

【附图说明】
[0076] 图1.人类脊柱干细胞的扩增。从7-8周大的死后胎儿脊髓组织中分离出人类脊 柱祖细胞（a. k. a. NSC)系，并连续传代大约130天的纯培养期。在每次传代时，将收取时回 收的细胞数除以平板接种时的初始细胞数以获得细胞数的增加倍数。将每次传代时增加的 倍数相乘，由此获得累积增加倍数（左Y轴）。将细胞数量的增加倍数除以每一培养期（X 轴），由此计算每次传代时的细胞倍增次数（右Y轴）。将该方法重复三次（连续扩增1、2 和3)。
[0077] 图2.扩增的人类脊柱干细胞的形态。（A)固定的未染色扩增培养物的相衬图，20x 物镜，（B)抗巢蛋白（anti-nestin)抗体染色。
[0078] 图3.获自扩增的人类脊柱干细胞的分化培养物的表征。使第15-16代的扩增细 胞在培养时分化大约14天，固定并用各种神经元特异性抗体染色。（A) Tau和MAP2 ; (B) 3型 β微管蛋白；(C) GABA; (D)乙酰胆碱转移酶。
[0079] 图4.人类中脑干细胞的扩增。从7-8周大的死后胎儿中脑组织中分离出人类中 脑祖细胞（a. k. a. NSC)系并连续传代大约170天的纯培养期。在每次传代时，将收取时回 收的细胞数除以平板接种时的初始细胞数以获得细胞数的增加倍数。将每次传代时增加的 倍数相乘，由此获得累积增加倍数（Y轴）。
[0080] 图5.扩增的人类中脑干细胞的多巴胺吸收（uptake)活性。活细胞中的多巴胺转 运体活性（DAT)由中脑干细胞系及其一种无性亚系（其在检定时分化22或44天）决定。 在存在⑴或不存在（-)DAT抑制剂诺米芬辛（10 μ M)的情况下，用放射性同位素标记的 多巴胺培养细胞。洗涤细胞以去除未并入的多巴胺并溶解在液态闪烁体（scintillation cocktail)中。然后使用闪烁计数器测定总细胞放射性（dpm)。
[0081] 图6.外因对人类中脑干细胞系的神经元分化和多巴胺能分化的影响。将来自两 个人类中脑干细胞系（527RMB和796RMB)的冷藏神经干细胞解冻并以40,000个细胞/孔 的密度在存在bFGF的4孔小室载玻片中平板接种，使其增殖6天。随后，取出细胞并使细 胞再分化8天。细胞根据与塞尔托利细胞条件培养基（SCCM，在N2中稀释1 : 1)接触的 时机和持续时间分成四组。一组在增殖和分化过程中接触SCCM(条件1);第二组仅在增 殖过程中接触（条件2);第三组仅在分化过程中接触（条件3);第四组不接触SCCM(对照 物，Cont.)。每隔一天改变培养基，并在增殖阶段每天添加促细胞分裂剂。每种条件维持 四个孔以允许对多个标记物进行染色。在分化时，将细胞使用4%低聚甲醛固定，并使用抗 MAP2ab (图6A)和酪氨酸羟化酶（图6B)的抗体以及GFAP和Gale免疫染色。使用40x物 镜计数免疫染色细胞，且每个孔计数至少三个视场。在分析保持在任何条件下的细胞时都 几乎或完全没有检测到GFAP+或GalC+，因此从分析中排除这些抗原。
[0082] 图7.人类脊柱干细胞移植引起的大鼠痉挛状态/僵硬和运动缺陷的降低。通过 腰脊髓的缺血性损害制造痉挛大鼠。在一组（black circle)中，用培养时扩增的人脊柱干 细胞（16代）移植大鼠 （η = 9)，而另一对照组（white circle, η = 7)仅接受没有细胞的 培养基。在研究持续期间（8周），每天以1毫克/千克向两组施用免疫抑制剂FK506。每 周一次用ΒΒΒ评分法评估各个动物的运动协调。
[0083] 图8.人类脊柱干细胞移植引起的大鼠痉挛状态/僵硬和运动缺陷的降低。通过 腰脊髓的缺血性损害制造痉挛大鼠。在一组（black circle和black squire)中，用培养时 扩增的人脊柱干细胞（16代）移植大鼠 （η = 13)，而另一对照组（filled triangle,η = 6) 仅接受没有细胞的培养基。在研究持续期间（12周），每天以3毫克/千克向两组施用免疫 抑制剂FK506。每周一次用BBB评分法评估各个动物的运动协调。
[0084] 图9.在使用活细胞（L，红）和死细胞（对照物，C)移植物（蓝）的情况下，用临 床和病理学测量的级数（A-B)以及终点（C-E)分析表示的人类NSC治疗对G93AS0D1大鼠 运动神经元疾病严重性的作用。
[0085] A-B.图A是显示在整个观察过程中实验和对照动物之间的显著区别的 Kaplan-Meier 图（P = 0· 0003)。图 B 显示了两组之间（P 分别=0· 00168 和 0· 00125)肌 肉衰弱的两个主要测量标准（BBB和斜面分数）的区别。
[0086] C-E.实验和对照大鼠中的存活（C)、疾病发作时间（time-to-disease-onset) (D) 和运动神经元数（E)。图C显示了两组之间（P = 0. 0005)显著的11天寿命差异。图D显 示了两组之间（P = 0. 0001)疾病发作时间显著的7天差异。图E显示了活和死NSC组（P =0. 01)之间腰部隆突中3, 212个细胞的差异。（E)底部的插页显示了 128天大的代表性 实验（上）和对照（下）大鼠之间运动神经元存活的差异；箭头代表侧向运动神经元组。 Size bars :150 微米。

【具体实施方式】
[0087] 所公开的方法涉及治疗神经变性症状。此外，所公开的方法包括移植到有需要的 对象中的神经干细胞的制备方法。制备移植用的细胞可以包括在体外将特定细胞种群扩增 至足以作为神经变性症状的治疗方法进行商业应用的程度。在一个实施方案中，变性或受 损神经区域的治疗方法包括向该区域供应有效数量的足以改善神经变性症状的神经干细 胞。
[0088] 本文所用的神经变性症状可以包括伴有神经元的损伤或退化的任何疾病或病 症或征候或其病因或影响。神经变性症状可以包括，但不限于，亚历山大病、AlpeW s Disease、阿尔茨海默氏症、肌萎缩侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张、脑白质海绵 状变性、科凯恩综合征、皮质基底节变性、克-雅氏病，亨廷顿氏舞蹈病、Kennedy' s Disease、克拉伯病、路易体痴呆、马查多-约瑟夫病、多发性硬化、帕金森氏病、佩-梅氏 病、Niemann-Pick^ s Disease、原发性侧索硬化、Refsum' s Disease、山德霍夫氏病， Schilder' s Disease、Steele-Richardson_01szewski Disease、脊髓瘦与受损神经兀有关 的任何其它症状。其它神经变性症状可以包括或由外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、中 风、外伤性脑损伤和遗传性症状引起。
[0089] 所公开的方法包括使用NSCs改善神经变性症状。本文所用的术语"NSCs"也可以 指神经或神经元祖蛋白，或神经上皮前体。可以根据它们分化成三种主要CNS细胞类型（神 经元、星形细胞和少突胶质细胞）的能力在功能上定义NSCs。
[0090] 在一个实施方案中，NSCs是多能的以使各个细胞具有分化成神经元、星形细胞或 少突胶质细胞的能力。在一个实施方案中，NSCs是双能的以使各个细胞具有分化成三种 CNS细胞类型中的两种的能力。在一个实施方案中，NSCs包括在体外生成神经元和星形细 胞的至少双能细胞并包括在体内生成神经元的至少单能细胞。
[0091] 生长条件可以影响细胞向一种或另一种细胞类型分化的方向，这意味着细胞没有 被限定为单一谱系。在有利于神经元分化的培养条件中，细胞，特别是来自人类CNS的细胞 大部分对于神经元和星形细胞是双能的，且极少分化成少突胶质细胞。因此，所公开的方法 的分化细胞培养物可以产生神经元和星形细胞。在一个实施方案中，神经元与星形细胞的 比率可以达到50 : 50比率。
[0092] 所公开的方法包括获得位于哺乳动物CNS区域（例如神经上皮）中的NSCs。其它 可以分离出NSCs的CNS区域包括CNS的脑心室和subventricular区域和包括有丝分裂前 体以及后有丝分裂神经元的其它CNS区域。在一个实施方案中，所公开的方法可以使用位 于发育中的哺乳动物CNS区域中的NSCs。
[0093] 在一个实施方案中，NSCs获自对所需神经元种群天然为神经原性的区域。所需细 胞种群可以包括特定神经元表型的细胞，其可以取代或增补在神经病症状中缺失或失活的 这类表型。
[0094] 通过从CNS的不同区域并跨越胎儿发育期间的不同胎龄分离出NSCs，可以获得各 种不同的神经元亚型，包括可用于治疗特定神经变性疾病或症状的那些。针对最佳扩增和 神经元分化能力，从CNS的不同区域并跨越不同胎龄分离出的NSCs。哺乳动物CNS的标志 之一是神经元亚型的多样性。单一的NSCs种群可能在培养时自发产生仅仅少数截然不同 的神经元亚型。此外，来自特定胎儿胎龄的细胞可以建立培养的细胞的生理相关性。
[0095] 在所公开的方法的一个实施方案中，要移植到对象中的细胞源自受损神经区域 的人类胎儿对应物。在一个实施方案中，NSCs分离自胎龄大约6. 5至大约20周的人类 胎儿CNS区域。在一个实施方案中，在大约7至大约9周的胎龄分离来自胎儿脊髓的细 胞。应该认识到，可分离神经干细胞种群的比例可以随供体年龄而变。细胞种群的扩增 能力也可以随供体年龄而变。NSCs的这类区域和时间特异性表明NSCs起到命运限制性 (fate-restricted)祖细胞而非空白细胞或单一细胞种群的作用。
[0096] 包括GABA能神经元的体外种群的比例通常恒定在大约5-10%。
[0097] 腹侧中脑的NSCs与获自相同妊娠期的脊髓的NSCs不同。特别地，来自腹侧中脑 的NSCs只产生表达酪氨酸-羟化酶的多巴胺能神经元，而来自脊髓的NSCs只产生生成乙 酰胆碱的胆碱能神经元。但两种细胞类型均同时生成更普遍存在的gluamate能和GABA能 神经元。因此，在一个实施方案中，所公开的方法包括从腹侧中脑中获得NSCs以治疗通过 表达酪氨酸-羟化酶的多巴胺能神经元的移植至少部分改善或减缓的症状。
[0098] 因此，对于运动障碍，例如以多巴胺能神经元缺失为特征的帕金森病的治疗，所公 开的方法的一个实施方案包括使用源自腹侧中脑之类区域（在此，多巴胺能神经元的神经 发生充足）的NSCs。此外，NSCs可以在人类胎儿发育中多巴胺能神经元的神经发生充足的 胎龄获得。因此，在一个实施方案中，所公开的方法包括从来自大约7至大约9周胎龄的腹 侧中脑中获得NSCs以治疗运动障碍。
[0099] 为了治疗由腹侧运动神经元缺失引起的运动神经元疾病，例如肌萎缩性脊髓侧索 硬化症或驰缓性截瘫，所公开的方法的一个实施方案包括使用源自脊髓之类区域（在此， 腹侧运动神经元的神经发生充足）并获自人类胎儿发育中腹侧运动神经元的神经发生充 足的胎龄的NSCs。因此，在一个实施方案中，从大约7至大约9周胎龄的脊髓中分离出NSCs 以治疗运动神经元疾病。
[0100] 但是，应该理解的是，在一些情况下，这类区域特异性的限制对于实际用途而言相 当宽。因此，来自脊髓各个区域，例如颈部、胸部、腰部和骶骨节段的NSCs可以互换使用以 移植并治疗NSCs相应来源以外的位置。例如，源自颈部脊髓的NSCs可通过将这些细胞移 植到患者腰段中来治疗痉挛状态和/或僵硬。
[0101] 也可以从出生后的和成人的组织中分离出NSCs。源自出生后和成人组织的NSCs 在量上与其分化成神经元和神经胶质的能力以及其生长和分化特征相当。但是，来自各种 出生后和成人CNS的NSCs的体外分离效力远低于来自胎儿组织的NSCs的分离效力，后者 含有更丰富的NSCs种群。无论如何，与胎儿源NSCs相同，所公开的方法能够使至少大约 30 %的源自新生儿和成人来源的NSCs体外分化成神经元。因此，出生后和成人组织可如上 文在胎儿源NSCs的情况中所述的那样使用，但胎儿组织的使用是优选的。
[0102] 可以从在培养中扩增的胚胎干细胞的操作中获得各种神经元亚型。因此，根据所 公开的方法，可以根据需要从其它不相关或不需要的细胞中分离并提纯特定的神经元亚型 以改进结果，并可用于治疗相同的神经变性症状。
[0103] 所公开的方法中的NSCs可以来自一个位置并作为自体移植物移植到相同对象体 内的另一位置。此外，所公开的方法中的NSCs可以源自遗传相同的供体并作为同系移植物 移植。再进一步，所公开的方法中的NSCs可以源自遗传不相同的同种成员，并作为同种异 体移植物移植。或者，NSCs可以获自非人类来源并作为异种移植物移植。随着有力的免疫 抑制剂的发展，同种异体移植物和非人类神经前体的异种移植物，例如猪来源的神经前体， 可以移植到人类对象种。
[0104] 样品组织可以通过任何标准方法离解。在一个实施方案中，组织通过温和机械研 制使用吸移管和不含二价阳离子的盐水缓冲液离解以形成离解细胞的悬浮液。需要足以获 得主要单细胞的离解以避免过高的局部细胞密度。
[0105] 对于NSCs的成功商业应用，保持强劲一致的培养是合意的，其具有通过许多连续 传代而稳定扩增和分化的能力。如上所述，培养方法可以被优化以实现来自不同区域和CNS 发展期的各个NSCs细胞系的长期稳定扩增，同时保持它们截然不同的祖细胞性质。
[0106] 为此，已经令人惊讶地发现，促进NSCs (NSCs)与底物的粘合有助于加速NSC或祖 细胞的有丝分裂速率，从而提供显著改进--即更强劲的NSC或祖细胞培养。特别地，除了 避免过高的局部细胞密度和保持促细胞分裂剂浓度外，已经发现，细胞外基质蛋白的浓度 影响NSCs的长期有丝分裂和分化能力。细胞外基质蛋白可以包括聚-D-赖氨酸、聚-L-赖 氨酸、聚-D-鸟氨酸、聚-L-鸟氨酸、纤连蛋白和它们的组合。其它细胞外基质蛋白可以包 括纤连蛋白、核纤层蛋白、胶原蛋白及其组合的各种同种型、片段、重组形式或合成模拟物。 或者或此外，应该认识到，所公开的方法可以包括能够促进有效细胞粘合的任何其它合适 的物质，从而使各个单独的细胞在不会毒害细胞或阻碍细胞分裂的情况下在整个培养期间 粘附到培养底物上。
[0107] 尽管细胞外基质蛋白可以有效地促进细胞粘合，但不同的氨基酸聚合物，例如 聚-L/D-鸟氨酸或聚-L/D-赖氨酸可能在某些浓度下对各个细胞系的细胞是毒性的。培养 持续时间也会影响沉积在盘表面上的聚合物的最终量，这影响了细胞的存活力。对于所公 开的方法中使用的NSCs，聚合物的浓度可以在大约0. 1微克/毫升至大约1毫克/毫升的 范围内。在一个实施方案中，将100微克/毫升聚-D-赖氨酸溶于中性pH值的0. 01M HEPES 缓冲液或水中并施加到培养皿上。将培养皿在室温培养1小时。然后将培养皿用水充分漂 洗并在使用前干燥。
[0108] 所公开的方法也可以包括用细胞外基质蛋白两次涂布培养皿。在一个实施方案 中，将培养皿用纤连蛋白或纤连蛋白衍生物处理，然后如上所述施加聚-L/D-鸟氨酸或 聚-L/D-赖氨酸。在一个实施方案中，使用由人类血浆制成的纤连蛋白。但是，应该认识到， 可以使用任何其它合适形式或来源的纤连蛋白，例如猪或牛纤连蛋白、重组纤连蛋白、纤连 蛋白片段、合成肽或纤连蛋白的其它化学模拟物。在一个实施方案中，可以施加大约〇. 1微 克/毫升至大约1毫克/毫升的纤连蛋白。
[0109] 在包括来自人类脊髓的NSCs的扩增的一个实施方案中，用100微克/毫升 聚-D-赖氨酸将培养皿处理足以使细胞外蛋白质粘合到培养皿上并涂布培养皿的时长。该 时长可以为大约5分钟至大约3小时。然后用水洗涤培养皿。在将培养皿风干后，将培养 皿在室温下用大约25毫克/毫升纤连蛋白处理大约5分钟至数小时或在37 °C用大约1毫 克/毫升纤连蛋白处理大约1小时至数天。随后，取出纤连蛋白并将培养皿洗涤至少一次 或储存在PBS中直至使用。
[0110] 或者，可以将纤连蛋白作为直接供应给细胞的可溶因子添加到生长培养基中。在 该实施方案中，可以通过在用纤连蛋白处理培养皿之外或代替这种处理在生长培养基中添 加1微克/毫升纤连蛋白来使NSCs扩增。由于涂有纤连蛋白的器皿的相对较短的贮存期 限，在细胞平板接种时将附着蛋白作为可溶因子供应到生长培养基中对于NSCs的商业大 规模培养特别有利。该方法还可用于制造要求相当精确的条件和可再现性（如在cGMP规 程下所要求的那样）的神经干细胞系和用于制造治疗用神经干细胞系。
[0111] 在一个实施方案中，将分离出的NSCs以大约1，000至大约20, 000个细胞/平方 厘米的密度添加到培养皿中。这种密度有利于各个细胞在培养皿中的均匀分布和粘合，避 免细胞的局部密集，来富集NSCs的培养。
[0112] 在一个实施方案中，NSCs在不存在血清的情况下扩增。在一个实施方案中，NSCs 在指定的无血清培养基中培养以避免NSCs暴露在足以使NSC的有丝分裂和分化能力失稳 的血清浓度下。此外，NSCs与某些生长因子，例如白血病抑制因子（LIF)或睫状神经营养 因子（CNTF)的接触也会使NSCs失稳并应该避免。
[0113] 可以在培养过程的任何阶段向培养物中添加促细胞分裂剂以增强NSCs的生长。 促细胞分裂剂包括碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF)、表 皮生长因子（EGF)、转化生长因子-a (TGFa)和它们的组合。
[0114] 所公开的方法的NSCs可以以至少两种不同的培养形式生长和扩增。一种培养形 式包括被称作悬浮培养的聚集形式，通常被称作簇生聚集形式。另一培养形式包括被称作 粘附培养的分散的非聚集形式。
[0115] 在所公开的方法的NSCs的分散粘附培养中，细胞形成单层，其中各个细胞最初直 接接触培养底物。最后，在培养周期后，细胞可以零星形成簇，其中在底层上形成至少一层 附加细胞层，即使底层中的细胞单独粘附到底物上。当培养物以高细胞密度培养或允许达 到高细胞密度时，尤其发生这种簇生，这在一种实施方案中被最小化以实现NSCs或祖细胞 的最佳扩增或NSCs多能能力的最佳保持。在所公开的方法的一个实施方案的分散粘附培 养中，对于每次细胞分裂，能够使人类NSCs在少于大约4天内分裂。
[0116] 分散粘附培养的另一显著特征在于，所公开的方法的NSCs分裂以生成各自保持 其多能能力的子细胞。在一个实施方案中，所公开的方法的NSCs的分散粘附培养包括在不 存在显著分化情况下至少20次细胞倍增的扩增能力。多数NSCs可以在损失其神经原性潜 能之前扩增超过至少50次细胞倍增。在一个实施方案中，在所公开的方法的分散粘附培养 中扩增的NSCs表现出改进的神经元分化，其在一个实施方案中产生至少大约30%的神经 元分化。在许多情况下，至少50%的NSCs分化成神经元。尽管分散粘附形式的培养是更优 选的培养形式，但不同培养方法能够分离在体外或体内具有不同分化潜能的先天不同的细 胞种群。
[0117] 本发明还能够在没有基因变异或饲养细胞并入的情况下从各种来源中无性分离 NSCs。因此，可以在如上制成的细胞培养皿中接种非常低量，优选少于1000个细胞/平方 厘米的细胞。
[0118] 在NSCs接种后的数天，细胞可以形成充分分离的群落。群落生长至所需尺寸，例 如至少大约250至大约2000个细胞。在一个实施方案中，手工选取至少一个细胞群落并单 独接种到新的细胞培养皿，例如多孔板上。
[0119] 分离的无性系种群可以通过连续传代扩增并用于建立多个神经干细胞系。已经从 人类CNS的各个区域（包括脊髓、中脑和后脑）中分离出许多这类无性细胞系。无性细胞 系可用于富集特定细胞表型，例如更高比例的神经元亚型。例如，可以用所公开的方法分离 使表达酪氨酸羟化酶的多巴胺能神经元、GABA能神经元、胆碱能神经元和其它特异性表型 的神经元富集的无性细胞系。
[0120] 在一个实施方案中，多克隆或单克隆神经干细胞系可以被诱导以进一步富集神经 元的特定亚型。已经筛选出许多生长因子、化学品和天然物质以从中脑或脊髓的NSCs中识 别特定神经元（例如表达酪氨酸羟化酶的多巴胺能神经元和生成乙酰胆碱的胆碱能神经 元）的有效诱导剂。该因子或化学品或其组合可以在NSCs的有丝分裂阶段和/或分化阶 段中引入。在一个实施方案中，多巴胺能表型的神经干细胞系作为供体种群进一步富集以 治疗帕金森病。
[0121] 可以由具有所需体外分化型式（pattern)的干细胞的分离获得各种神经元亚型。 体外结果可以在体内基本再现。这意味着干细胞的体内潜在效力可以通过干细胞的体外分 化型式预测。在注入活的出生后对象中时，未分化或预分化状态的NSCs在很大程度上在体 内产生在体外观察到的分化型式。因此，在体外产生生成酪氨酸羟化酶的神经元的NSC也 会在体内产生生成酪氨酸羟化酶的神经元。相反，在体外不组成性地产生生成酪氨酸羟化 酶的神经元的NSC也不会在体内产生生成酪氨酸羟化酶的神经元。
[0122] 但是，体外存在的分化信号与体内的相比是有限的。因此相当一部分的分化神经 元可能不表达主要神经递质表型。在NSCs的有丝分裂阶段中或在其分化过程中可以使用 其它信号（例如来自传入或传出神经元的信号或模拟这类天然信号的试剂）重构分化表 型。NSCs具有响应体内以及体外存在的信号的能力。因此，一旦移植到缺血性损伤的脊 髓中，脊柱NSCs与在体外相比，生成比例高得多的GABA能神经元。因此，NSCs是可塑的。 NSCs的这种可塑性质是它们的多能性的特征，因此，这种可塑性可用于识别表型诱导剂和 识别可以进一步与NSC种群结合以改变其性质的方向的条件。
[0123] 在一个实施方案中，这种改编程序包括处理来自脊髓组织的NSCs以获得运动神 经元表型的增强的表达。处理条件包括与各种肌肉细胞或外围神经系统衍生细胞（例如神 经嵴细胞或神经节的神经元）一起培养NSCs或其分化细胞。也可以用已知在运动神经元 或在脊髓中表达并生成的分子的cocktails处理NSCs以增强运动神经元表型的NSC表达。
[0124] 为了诱导人类中脑的多巴胺能表型的NSC表达，用来自塞尔托利细胞之类细胞或 通过其筛选或组合获得的任何其它合适的化学品或细胞的分子（例如锂、GDNF、BDNF、多效 蛋白、促红细胞生长素、条件培养基）处理NSCs。这种诱导能够使移植的NSCs在体内表达 并保持多巴胺表能表型。
[0125] 在一个实施方案中，所公开的方法的NSCs可以包括用于移植的预分化细胞。为 了细胞的最大产量和为了程序的简化，收取主要包含未分化细胞种群的汇合培养物用于移 植。应该认识到，由于提高的细胞密度，也可以存在次要的刚开始自发分化的细胞种群。
[0126] 在一个实施方案中，使NSCs传代包括从底物中收取或分离细胞。在一个实施方案 中，所公开的方法包括使用至少一种酶从底物中收取或分离细胞。当NSCs的细胞周期时间 短到足以使细胞表面上的促细胞分裂剂受体失活时，就要避免酶处理。但是，人类NSCs的 细胞周期时间比啮齿动物NSCs长得多，因此人类NSCs对酶处理没有那么敏感。因此，在所 公开的方法中，使用酶处理收取来自人类的NSCs。尽管人类NSCs可以在酶处理存在下变得 临时对促细胞分裂剂不起反应，但促细胞分裂剂受体的反复失活会导致NSCs比例的降低。
[0127] 在一个实施方案中，在收取细胞时，通过简短离心来浓缩细胞。细胞可以进一步在 最终临床可用溶液（例如盐水、缓冲盐水）中洗涤并再悬浮，或者再悬浮在储存或休眠溶液 (hibernation solution)中。或者，细胞可以再悬浮在冷冻介质，例如加有二甲亚砜的介 质，或任何其它合适的冷冻保护剂中，并冷冻储存。
[0128] 配制休眠溶液以更长时间保持活细胞的存活力。在一个实施方案中，可以改造储 存溶液以便将活性细胞在即用制剂中船运到移植手术地点以立即使用。适合将活细胞船运 到遥远地点的条件还包括可以将大约〇°C至大约20°C的温度范围保持至少24小时的保温 设备。在大约〇°C至大约8°C储存大约24小时至大约48小时的活细胞能够移植以治疗疾 病或症状。
[0129] 在一个实施方案中，在溶液，例如如上所述的临床上可用的休眠或冷冻溶液中浓 缩细胞。在一个实施方案中，将细胞浓缩至可以与细胞施用时的细胞密度相同或不同的适 当细胞密度。在一个实施方案中，施用时的细胞密度可以为大约1，〇〇〇个细胞/毫升至大 约1，000, 000个细胞/毫升，这取决于诸如注射位置、注射位置的神经变性状况、产生有益 效果所必须的最小剂量和毒副作用考虑因素之类的因素。在一个实施方案中，所公开的方 法包括以大约5, 000至大约50, 000个细胞/毫升的细胞密度注射细胞。
[0130] 用于使扩增的细胞悬浮以输送到治疗区域的介质体积在此被称作注射量。注射量 取决于注射位置和组织的变性状况。更具体地，注射量的下限可以由高细胞密度的粘性悬 浮液的实际液体操作以及细胞的簇生趋势决定。注射量的上限可以由注射量所施加的避免 损伤宿主组织所必须的压力限度以及实际手术时间决定。
[0131] 使用已知方法的供体细胞的低细胞存活导致必须将大量细胞输送到相对较小的 区域上以努力实现有效治疗。但是，注射量是施加在宿主组织上的静水压力，与高注射量联 系在一起的长注射时间加剧了手术风险。此外，供体细胞的过量注射导致宿主薄壁组织的 受压和随后的损伤。在试图补偿体积限制时，已知方法要求制备高细胞密度的注射用悬浮 液。但是，高细胞密度促进了移植的细胞的紧密簇生并抑制了细胞迁移或扩散，从而使有效 治疗不能超出有限区域并损害了无缝结合到宿主组织中。
[0132] 相反，由于通过本公开的方法制成的细胞的改进的体内存活，每次注射需要较少 数量的细胞。实际上，在从注射时间开始六个月后，已经证明存在多达三至四倍的注射细胞 数，这表明使用本公开的方法显著的量化存活。此外，由于这种量化存活，可以实现所需细 胞剂量的可再现施用。相应地，在一个实施方案中，细胞浓缩至大约1，〇〇〇至大约200, 000 个细胞/毫升的密度。在一个实施方案中，对于有效移植，使用大约5, 000至大约50, 000 个细胞/毫升。在另一实施方案中，使用大约10, 〇〇〇至30, 000个细胞/毫升。在一个实 施方案中，细胞可以以每个注射位置小于大约100毫升的注射量悬浮输送到治疗区域。例 如，在人类对象的神经变性症状的治疗中，可以沿脊柱束双侧进行多次注射，可以使用每个 注射位置0. 1和大约100晕升的注射量。
[0133] 在所公开的方法中可以使用任何适用于将细胞注入所需区域的器件。在一个实施 方案中，使用能够随时间经过以基本恒定的流速输送亚微升量的注射器。细胞可以通过针 或软管或任何其它合适的输送装置装载到该器件中。
[0134] 在一个实施方案中，用于治疗神经变性症状的所需注射位置包括至少一个脊髓区 域。在一个实施方案中，将细胞移植到脊髓的至少一个特定节段或区域中，例如脊髓的颈 部、胸部或腰部区域。在腰部区域中，例如，仅有5对神经根横穿椎骨的多骨管道，其中每对 神经根在大范围分布的每一腰部level处离开脊柱。由于脊髓腰部区域中较低的神经根密 度，腰部区域特别适合提供细胞注射的安全位置。在一个实施方案中，细胞在脊髓薄壁组织 的中间区域中移植。
[0135] 在一个实施方案中，细胞在大约5至大约50个位置注射。在一个实施方案中，细 胞在脊髓每侧各大约10至大约30个位置注射。至少两个位置可以相隔大约100微米至大 约5000微米。在一个实施方案中，注射位置之间的距离为大约400至大约600微米。可以 根据在整个脊柱段中生成基本不间断和邻接的供体细胞和根据经证实在大鼠或猪之类的 动物模型体内实现大约2-3个月存活的注射平均量来确定注射位置之间的距离。在一个实 施方案中，沿脊髓中线的两侧注射细胞以跨越可用于治疗痉挛症状/僵硬或运动神经元存 活的至少数个腰段的长度。可以由动物模型中的结果推断在人体内的确切注射量。
[0136] 在一个实施方案中，注射的目标位置是脊髓的灰质。在灰质内，可以插入针尖，从 而在特定的薄层（lamina)位置沉积NSCs。例如，为了输送GABA/甘氨酸能神经元以治疗痉 挛状态/僵硬，将NSC输送到包含薄层V-VII的区域中。或者，可以将NSC输送到各种脊柱 节段（从颈部到腰部）的灰质的背角中或其附近，以治疗神经性疼痛或慢性疼痛。或者，可 以将NSCs输送到各种脊柱节段（从颈部到腰部）的灰质的腹角中或其附近，以治疗运动神 经元疾病，例如ALS。
[0137] 所公开的方法的细胞可以在体内生成大量神经元。当NSC在移植之前没有明显 预分化时，NSCs可以在分化之前在体内增殖多达2至4次细胞分裂，由此进一步增加有效 供体细胞的数量。在分化时，神经元分泌特定神经递质。此外，神经元将生长因子、酶和对 不同症状有益的其它蛋白质或物质分泌到体内移植物周围的环境（mileu)中。因此，因为 移植的细胞在体内生成大量神经元的能力和由于神经变性症状可以由包括神经元衍生成 分（element)在内的成分缺失引起或导致这种成分缺失，可以通过所公开的方法治疗多种 病症。因此，通过所公开的方法可以有效地治疗由于缺乏这类神经元衍生成分，例如生长因 子、酶和其它蛋白质而患有CNS组织变性的患者。
[0138] 与移植的神经元分泌的生长因子、酶和其它蛋白质或物质响应的症状包括遗传性 溶酶体病，例如 Tay-Sach' s 病、Niemann-Pick' s 病、Batten' s 病、Crabb' s 病、共济失调 和其它。
[0139] 此外，所公开的治疗方法包括移植体外扩增的细胞，其可以替换受损或变性的神 经元，提供对其它神经元的抑制性或刺激性作用和/或释放出有助于神经元再生的营养因 子。
[0140] -个实施方案包括供应其它运动神经元作为受损或变性神经元的替代物。例如， 所公开的方法包括在脊髓空洞内提供充足的神经下部构造以填充空穴。神经下部构造如果 能够减缓与由外伤性脊柱损伤、遗传性症状或任何其它病因引起的脊髓空洞症有关的脊髓 空洞扩大，其就是适当的。应该认识到，提供适当的神经下部构造也有助于缓解变性脊髓引 起的其它并发症。
[0141] 并非所有NSCs都可治疗给定疾病。在不同疾病中受影响的神经元种群的类型可 以不同。因此，治疗有效性的NSCs供体种群有助于替换缺失的神经单元。例如，痉挛状态、 癫痫发作、运动障碍和其它肌肉活动过度障碍的治疗可以包括提供治疗有效量的能够分化 成生成GABA或甘氨酸的抑制性神经元的细胞。通过检查分化的神经元表型，可以在体外评 估NSCs的不同种群。然后不仅在适当的神经递质表型方面，还在神经元的适当形态、迁移 和其它表型特征方面，使用体外分化型式预测细胞在体内产生适当表型的效力。
[0142] 在一个实施方案中，移植能够生成与症状病因相关性受损或受伤神经元亚型相对 应的神经元亚型的NSCs。例如，对象中激感回路的活动过度可能由遗传症状或神经元损伤 引起--该神经元损伤来自脊髓外伤、胸/胸腹主动脉手术、中风、癫痫、脑外伤、亨廷顿氏 舞蹈症、膀胱失禁、活动过度的肠运动和由受伤或遗传性症状引起的肌肉的任何其它不受 控收缩。与脊髓不同地，痉挛状态、癫痫发作或其它活动过度在脑中由于许多不同的病源而 出现。病灶性癫痫被认为起因于缺乏对回路的GABA exerting tonal控制而引起的失调活 动过度。为此，公开的方法包括通过移植体外扩增的NSCs在受影响的区域中提供抑制性神 经递质，例如GABA或甘氨酸。在痉挛状态、癫痫发作和其它活动过度的情况下，在体内生成 能够分化成抑制性神经元，例如GABA能或甘氨酸能神经元的许多NSC以待移植，从而减弱 与痉挛状态、癫痫发作和其它神经活动过度相关的至少一条活动过度的神经回路。所公开 的方法因此可用于治疗癫痫症和类似的癫痫发作症状。
[0143] 所公开的方法还可用于治疗由脑缺血引起的局部麻痹、麻痹、痉挛状态、僵硬或任 何其它运动、表达或认知征候。脑缺血可以由于脑部中风引起或由心脏病发作引起，在此脑 血液循环中断相当长的时间。因此，其与上述脊髓缺血类似。一些中风患者产生中枢来源 的发作以及其它缺陷，例如记忆丧失、麻痹或局部麻痹。这些来自脑缺血的缺陷也可能由于 海马状突起和/或脑区域中抑制性中间神经元的选择性缺失引起。因此，所公开的方法可 用于治疗患有局部麻痹、麻痹、痉挛状态或其它运动、表达或认知征候的中风患者。
[0144] 在局部麻痹、驰缓性截瘫和其它与肌肉收缩控制的损失相关的症状（例如由ALS、 外伤性脊髓损伤、缺血性损伤或遗传性症状引起的那些）中，所公开的方法包括提供神经 元移植以发挥充足的营养影响，从而减缓运动神经元的损失。特别地，所公开的方法促进 了移植的NSCs分泌营养分子的能力，这些营养分子可以在最佳生物利用率的条件下输送 到变性运动神经元中。这类营养分子包括exocitosed超氧化物歧化酶，例如超氧化物歧 化酶（S0D1)、溶酶体酶、和非proteinatious分子，例如细胞生成的抗氧化剂。移植的细胞 分泌的其它营养因子可以包括global细胞源性神经营养因子（GDNF)、脑源性神经营养因 子（BDNF)、血管表皮生长因子（VEGF)、多效蛋白、血管内皮生长因子（VEGF)、促红细胞生长 素、midkine、胰岛素、胰岛素样生长因子1 (IGF-1)、和胰岛素样生长因子2 (IGF-2)或任何 其它有益的营养成分。
[0145] 对所公开的方法治疗多种神经变性症状的能力有所帮助的另一因素包括NSC分 化细胞沿现有神经元纤维大面积迁移的能力。移植细胞的迁移导致供体神经元和/或神经 胶质的全面分布和结合以及这类细胞分泌的治疗成分的全面或分散性供应。
[0146] 细胞的广泛迁移能够使关键的治疗性蛋白质和物质全面和稳定地输送到有需要 的对象的整个神经系统和体内。由此，所公开的细胞是治疗性蛋白质和物质的有效输送载 体。对于这类输送目的，所公开的方法包括将细胞移植到神经系统内的各个位置，包括CNS 薄壁组织、心室、硬膜下、鞘内和硬膜外腔、外围神经系统位置，以及移植到神经系统外的区 域中，例如肠、肌肉、血管内系统和皮下位置。
[0147] 实施例1.人类脊髓神经干细胞/祖细胞的扩增
[0148] 获得来自大约7-8. 5周胎龄的至少一个供体的脊髓。使用机械研制在不合Ca++ 和Mg++的磷酸盐缓冲盐水中离解该脊髓的单一连续组织。然后将所得细胞悬浮液接种到 用聚-L-鸟氨酸或聚-D-赖氨酸和人类纤连蛋白或其它细胞外基质蛋白预涂的组织培养板 中。将组织培养物处理过的板或烧瓶用100微克/毫升聚-D-赖氨酸在室温培养1小时。 然后将它们用水洗涤三次并干燥。然后将它们用25毫克/毫升在室温培养5分钟。有时， 在室温使用10毫克/毫升纤连蛋白1小时。有时，在37°C使用1毫克/毫升纤连蛋白18小 时。用1种人重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)补充由N2(DMEM/F12加上胰岛素、转铁 蛋白、硒、腐胺和孕酮）构成的培养基。在一个实施方案中，可以使用〇. 1纳克/毫升-100 纳克/毫升的范围。在一个实施方案中，最好使用10纳克/毫升的bFGF。
[0149] 所得初始培养物由后有丝分裂和增殖NSCs以单层形式构成。随后，在培养大约5 至大约20天后，分裂的巢蛋白阳性NSCs在培养物中超过未分裂的神经元或缓慢分裂的神 经胶质。在这些培养条件下，NSCs选择性地偏向扩增。通过温和酶处理，例如使用胰朊酶， 使扩增的NSC种群传代。将细胞在不含血清或基本不含血清的培养基中培养。尽管细胞可 以忍受低浓度血清，但最好避免使细胞接触血清，因为血清含有许多促进NSCs的神经胶质 分化的细胞因子，例如LIF和CNTF。由此，在传代过程中，通过添加特定酶抑制剂，例如胰朊 酶抑制剂而非血清，终止所用的酶。在每次传代时，计数收取细胞的数量，并将一部分重新 接种以进一步扩增。如图1中所示，使用本发明的方法，人类NSCs可以在数量上扩增1018 倍，同时保持其生长和分化性能。细胞可以可再现地扩增。如图1中所示，以细胞的可再现 生长曲线和倍增时间将细胞的连续传代重复三次。在扩增过程中，几乎所有细胞都表达巢 蛋白--有丝分裂神经上皮细胞的体内标记物，且不含分化神经元和神经胶质的抗原，例 如3型β微管蛋白和GFAP。该细胞通过免疫染色对PSA-NCAM(committed神经元族蛋白 的一种可能的标记物）、〇4和GalC (少突胶质细胞的标记物）和RC2 (放射神经胶质的标记 物）呈阴性。因此，通过免疫染色测定，NSCs在整个延长的扩增周期内稳定地保持它们的 抗原profile表达。形态和桌蛋白表达的例子分别显不在图2A和B中。
[0150] 实施例2.人类脊髓神经干细胞/祖细胞的分化
[0151] 在NSCs扩增过程中的任何时候，通过提取培养物中的促细胞分裂剂，例如bFGF， 可以使培养物分化。NSCs的分化在去除促细胞分裂剂后大约1-3天发生，并表现出独特 的异源（heterogeneous)细胞形态。到分化大约4-7天，可以通过免疫染色使非特异性抗 原，例如MAP2c、tau和III型β微管蛋白直观化。到大约12-14天，在整个培养物中明显 表现出细长的束状轴突以及亚细胞蛋白质运输的清楚极化。到大约28天，突触蛋白，例如 synapsin和synaptophysin，局限到轴突终端，表现为点状染色。可以提供星形细胞的另一 饲养层以进一步促进神经元的长期成熟。如图3中所示，人类脊柱NSCs的分化产生神经元 与神经胶质的混合培养物,其中神经元强劲地表达神经元特异性抗原，例如tau、MAP2ab (A) 和3型β微管蛋白（B)，并构成培养物的大约50%。如图3B中所示，培养物自发生成伸长 数厘米的长的成束的轴突束。如图3C中所示，相当大比例的神经元是GABA能的。培养物 中也存在胆碱能的运动神经元（图3D)。培养物中明显存在GABA神经元预示了人类脊柱 NSCs用于治疗由特定回路中GABA生成量的降低引起的各种神经病症状的有用性。同样地， 胆碱能神经元的存在表明人类脊髓NSCs能够进行运动神经元分化并预示了其用于治疗由 运动神经元的逐渐变性引起的各种运动神经元疾病的有用性。对治疗而言，使NSC在有或 没有进一步表型增强状况的情况下扩增，收取并注入有缺陷的神经区域。
[0152] 实施例3.人类中脑神经干细胞/祖细胞的扩增
[0153] 获得7-8. 5周胎儿胎龄的一个中脑组织。如实施例1所述获得来自中脑组织的 NSCs。细胞经过160天纯培养期连续传代，且所得扩增显示在图4中。在整个扩增期间，NSCs 稳定地保持其多能性和神经原性潜能以及它们的分化潜能，从而产生多巴胺能神经元。通 过酪氨酸羟化酶（TH)和多巴胺转运体（DAT)的神经元表达评定多巴胺能神经元。
[0154] DAT表达是多巴胺能神经元的标志。通过测量其穿过培养中的分化神经元的突触 膜输送放射性同位素标记的多巴胺的作用，可以评定神经元中的DAT表达。通过放射性同 位素标记的多巴胺吸收（uptake)检定法，评定DAT在来自分化人类中脑NSCs和单克隆衍 生人类中脑NSCs的培养物中的作用。检定结果表明了人类中脑NSCs的强劲的功能性多巴 胺能活性。此外，其表明，特别倾向于在分化时产生更高比例多巴胺能神经元的分离出的 NSC单克隆种群可以使多巴胺能表型富集（图5)。
[0155] 产生富集的多巴胺能神经元的NSCs特别可用于治疗帕金森病。类似地，在从用于 特定表型的增强的分化的组织中分离出来时预编程的NSCs可用于分离其它特定的所需神 经元，例如可用于治疗阿尔茨海默氏症的前脑胆碱能神经元、可用于治疗神经元疾病（例 如ALS)的脊柱胆碱能神经元、可用于治疗抑郁的血清素能神经元、和可用于治疗癫痫和亨 廷顿氏舞蹈病的GABA能神经元。
[0156] 实施例4.人类中脑神经干细胞/祖细胞的分化。
[0157] 人类中脑NSCs/祖细胞可以如实施例2中所述分化。在NSCs的有丝分裂过程中或 在其分化过程中，可以通过用含有各种外源因子的培养物处理来增加所需表型的比例。能 够增加来自人类中脑NSCs的多巴胺能表型的这类因子的例子是如图6A和6B所示的来自 塞尔托利细胞的条件培养基。
[0158] 在图6A和6B所示的研究中，将冷藏的神经干细胞解冻并以每孔40, 000个细胞 的密度在存在促细胞分裂剂的4-孔室载玻片中平板接种，并使其增殖6天，此时取出促细 胞分裂剂并使细胞分化8天。细胞根据与塞尔托利细胞条件培养基（SCCM，在N2a中稀释 1 : 1)接触的时机和持续时间分裂成四组。一组在增殖和分化期间与SCCM接触（条件 1);第二组仅在增殖期间接触（条件2);第三组仅在分化期间接触（条件3);第四组不接 触SCCM(对照物或cont.)。每隔一天更换培养基，并在增殖阶段每天添加促细胞分裂剂。 每种条件维持四个孔以允许对多个标记物进行染色，并测试三个细胞系：796MB、527MB和 566SC。来自脊髓的566SC细胞不具有可测得的TH阳性神经元，从图中省略。
[0159] 在分化时，使用4%低聚甲醛固定细胞并使用抗MAP2抗体[AP20无性系（Sigma)， 其识别MAP2ab亚型]、神经元特异性β -微管蛋白[Tujl (Covance)]和酪氨酸轻化酶 (Pel-Freez)以及GFAP(Dako)和GalC(Chemicon)免疫染色。使用40x物镜计数免疫染色 的细胞，且对于每个孔，计数至少三个视场。在分析保持在任何条件下的细胞时都几乎或完 全没有检测出GFAP+或GalC+细胞，因此这些抗原从分析中排除。此外，566SC细胞在保持 在所述条件下之后太密而不能测定数量，其不包括在最终分析中。
[0160] 分析表明，用外源因子处理可以影响人类中脑NSCs，从而搜寻有用的蛋白质因子 或化学品以进一步富集多巴胺能神经元。由此，可以使用人类NSCs有效筛选新型合成/天 然化学品和蛋白质因子以获得特别有用的用于治疗特定适应症（例如帕金森氏病）的种 群。
[0161] 实施例5.通过人类脊柱神经干细胞/祖细胞的移植治疗大鼠的痉挛状态和僵硬
[0162] 为了引发暂时脊髓缺血，使用之前在Taira，（1996)中所述的技术。Sprague Dawley(SD)大鼠在氟烷（1. 5% )中麻醉。将2Fr Fogarty 导管穿入左股动脉并经降主 动脉到达左侧锁骨下动脉位置。为了测量主动脉血流阻断下方的远端动脉压力（DBP)，在尾 动脉中插入聚乙烯（PE-50)导管。
[0163] 在用0. 05毫升盐水充填主动脉内气囊导管时引发脊髓缺血。通过从插有PE-50 导管的颈动脉中抽取一部分动脉血（10. 5-llcc)，再现主动脉血流阻断期间的全身低血压。 用此方法可以引发大约40mm Hg的全身低血压。血流阻断的效力表现为在尾动脉中测得的 DBP的立即和持续下降。在引发脊髓缺血大约10分钟后，使气囊瘪塌，重新输入从颈动脉中 提取的血液。当动脉血压稳定（在回流后大约20-30分钟内），去除动脉管路，并将创口封 闭。
[0164] 在引发脊髓缺血后，以大约2天间隔使用改性21点户外运动标准（BBB标准）评 定运动功能的恢复。仅选择BBB分数为0-4的动物进行实验组的移植研究。
[0165] 在缺血性损害后的大约7-21天，将BBB分数为0-4的痉挛大鼠在室内空气中用 1.5-2%氟烷麻醉并放在脊柱装置上。然后进行Thll-L2椎骨的部分椎板切除术。将顶圆 直径为80至100微米的玻璃毛细管连接到压控微量注射器上。每次注射时对大鼠注射0. 5 微升含有5, 000、10, 000、15, 000或20, 000个人类神经干细胞/组细胞的细胞悬浮液。每 一大鼠在脊髓各侧（左侧和右侧）上接受总共6-8次注射，它们均匀分布在暴露出的L2-L6 节段之间。注射中心定为中心灰质（薄层V-VII)(与L3位置的脊髓背部表面的距离：1毫 米）。在移植之后，用3% H202和青霉素/链霉素混合物清洗并用2层封闭。然后使大鼠 恢复。
[0166] 在脊柱移植之前大约3天，在所有动物中开始用FK_506(Prograf ;Fujisawa ;1毫 克/千克；腹腔内注射）进行免疫抑制治疗。在移植之后，动物在整个存活期内每天接受 免疫抑制治疗。可以用FK-506有效防止这些移植物的免疫排斥。大鼠存活大约2或7周 (对于每个时间点，η = 5)。
[0167] 在存活期结束时，将大鼠用戊巴比妥（40毫克/千克；腹腔内注射）麻醉并用肝素 化盐水经心脏灌注1-2分钟，然后用在0. 1M磷酸盐缓冲液（PB)中的4%低聚甲醛经心脏灌 注。切开脊髓并在相同的固定剂中在4°C后固定过夜。在后固定之后，将脊髓组织冷藏在分 级蔗糖溶液（10、20和30%)中总共三天。然后切割冷冻的冠状、纵侧或水平切片（10-20微 米）。对于免疫组织化学，将自由浮动切片（30微米）在含有5 %正常羊血清（NGS)，0. 2 % TritonXlOO(TX)的PBS，0. 1Μ(ρΗ = 7.4)中在室温下放置2小时以阻断非特异性蛋白质活 性。然后在4°C用各种人类特异性一抗培养过夜。
[0168] 在用一抗培养之后，将切片在PBS中洗涤3遍，并用结合到荧光标记（Alexa488或 594 ;4微升/毫升；Molecular Probes)上的第二羊抗兔或鼠抗体培养。所有阻断和抗体 制品在0. 1M PBS/0. 2% TX/5% NGS中制造。对于双标记实验，同时施用来自不同物种的一 抗，然后施用与不同荧光标记结合的二抗。在对照实验中，省略一抗。对于普通核染色，将 DAPI (3微升/毫升）添加到最终二抗溶液中。在染色后，将切片在室温干燥并用Prolong anti-fade 试剂盒（Molecular Probes)覆盖。
[0169] 使用Leica突光显微镜分析载玻片。用Olympus数码相机捕捉图象（512X512象 素）并用 Adobe Photoshop5. 5 (Adobe Systems，MountainView，CA)加工。为了证实不同 抗体在双重染色切片中的共位性，用包括安装在Nikon显微镜（Applied Precision, Inc.) 上的PhotometricsCO)的DeltaVision deconvolution显微镜系统捕捉图象。一般而言， 截取相隔〇. 1或〇. 2微米的六十个光学切面。所用透镜是2〇X、4〇X和60x(NA1.3)。使用 SoftWorx 软件（Applied Precision, Inc)在 Silicon Graphics Octane 工作站上将数据组 去卷积和进行分析。
[0170] 使用体视学无偏见和系统的采样，评估对人类核NUMA抗体呈免疫反应性的 移植神经元的总数。在应用fractionator采样方案后，使用取自L2-L6脊柱节段 的各个第十预先染色的切片进行体视学量化。使用数值孔径1. 3的ΙΟΟχ油浸物镜 通过Leica DMLB显微镜获得光学图象（1微米厚）。使用与StagePro-control led motorized Z stage (MediaCybernetics) 一起供应的数码相机（Olympus)和 ImagePro 软 件（MediaCybernetics)捕捉光学图象。然后米用 fractionator 公式 N = QX 1/hsf X 1/ asf X 1/ssf计算移植细胞数，其中N是阳性核总数，Q是计数的细胞总数，hsf是height sampling fraction, asf 是 area sampling fraction, ssf 是 slice sampling fraction。
[0171] 为了提供移植人类NSCs在缺血性脊髓中的三维重建视图，使用取自连续切割的 脊髓的预存图象。对于三维重建，平均使用大约60-100个连续切片。在第一步骤中，使用 Ellipase软件打开一堆连续图象，并使用客户研发的排列组件（custom developed Align module) (VidiTo，SK)排列。排列方法包括在所有连续脊髓图象中确定两个形态参考点（第 一点：中央管的中心；第二点：背角的内侧缘），随后进行所有图象的电脑加工的排列。为了 确定背角和腹角的边缘，使用Laminar Mapmodule (Ellipse)在预先排列的图象堆上画出线 条。最后，使用3-D构造器（Media Cybernetics)将这堆预先排列和laminar maps标记过 的图象用于三维重建。
[0172] 人类脊柱NSCs在大鼠星形细胞上培养2至3周，这表现出多数培养物中神经元表 型的时间依赖型成熟和发育。这通过用抗NSE或M0C的人类特异性抗体染色来证实。还识 别出具有充分形成的轴树的许多神经元。多数（85-90% )NSE阳性神经元是GABA阳性的。 在一些MOC阳性神经元中观察到在轴突和树突中的突触体素表达。
[0173] 观察到在缺血性损伤后21天移植的细胞的强劲存活。这表现为清楚识别出的对 NUMA、M0C或NSE，所有人类特异性抗体呈免疫反应性的双侧移植物。取自移植脊髓节段的 水平切片的分析显示出NUMA阳性细胞在各个注射位置之间的清楚迁移。大部分NUMA阳性 细胞表现出共位性以及M0C免疫反应性。
[0174] 用共焦显微术分析的带有NUMA和GABA抗体的脊髓切片的双标记显露出平均 25-35% GABA阳性细胞。在存活七周的所有移植动物中看到GABA能表型的一致表达。
[0175] 在相同时间点（S卩，移植后七周），用突触体素和NUMA抗体的双重染色显示移植物 内致密的突触体素阳性网络。
[0176] NUMA阳性细胞只偶尔表现出与GFAP抗体的共位性。这些细胞通常局限在移植物 外围。
[0177] NUMA阳性细胞的体视学评测表明在各个移植物中平均75, 460±5, 697个持久介 质细胞。这表明比最初注射的细胞多了平均3-3. 6倍。细胞周期抗原，Ki67,是积极有丝 分裂细胞的标记物。在移植后2或7周时脊髓节段的染色仅在移植后2周时表现出hKi67 免疫反应性。在存活7周时，细胞只偶尔为Ki67阳性的。这些结果表明，移植的人类脊柱 NSCs和它们的后代以等于最初两周的平均大约三次细胞倍增的数量扩增，其随后变成后有 机分裂性的并稳定地并入。
[0178] 使用取自用M0C抗体和DAPI染色的40微米厚连续脊髓切片（总数为150-200个 切片）的图象进行移植的LE-L5区段的体积重建。三维移植物重建显示出分布在灰质范围 内的充分识别的rostrocaudally取向M0C阳性移植。如图7和图8中所示，移植细胞并用 BBB评分测量恢复运动益处，由此评估人类脊髓NSCs的功能作用。
[0179] 对于在本研究中观察到的行为恢复程度，我们已经在移植后观察了三个主要组。 第一，表现出最强劲的恢复和行走能力的动物（BBB < 16)，第二，下肢所有3个关节的积极 运动性表现出改进但不能站立的动物（BBB大约8)，和第三组，没有表现出任何恢复的动物 (即，无响应者）。尽管对移植的响应性不同的原因尚不清楚，但我们推测，与dysinhibited 初级神经末端和/或α-运动神经元相对的移植位置的差异可能起到一定作用。此外，应 该指出，动物在本研究中仅存活3个月。我们推测，移植后的长期存活和持续身体康复可能 与较高的功能恢复程度相关。无论如何，与治疗组相反，在仅注射介质的任何动物中都没有 观察到显著的恢复。
[0180] 实施例6.通过人类脊柱NSCs的移植治疗运动神经元疾病
[0181] 所公开的方法的NSCs提供了有力和显著的临床和生物学益处。为此，所公开的 方法能够治疗在整个中枢神经系统中散布的症状，例如ALS，以及局限在特定区域中的症 状，例如上述脊髓缺血。在ALS中，尽管腰索中的移植可能省略节段性运动系统的其它重要 部分，即负责呼吸运动的颈部运动神经元柱，但所公开的在脊髓中移植NSCs的方法促进了 BDNF和⑶NF和其它因子从移植细胞中释放到CSF中，在此对整个脊髓中的宿主运动神经元 产生更广的作用。
[0182] 已经令人惊讶地发现，移植到神经变性脊髓环境的腰段的人类NSCs的部分移植 物存活，进行大量的神经元分化并促进运动神经元存活和在移植位置和其它位置发挥作 用。NSCs显著延缓症状的发作并延长S0D1G93A大鼠，人类ALS (肌萎缩性侧索硬化症）模 型的寿命。
[0183] S0D1G93A大鼠代表了尤其积极形式的ALS的神经病理学和临床症状的综合模 型。[(Nagai等人，2001;H0wland等人，2002)]。来自人类胎儿脊索的NSCs可以移植到 S0D1G93A大鼠和小鼠的腰索中，在此发生神经元的大量分化，且在此分化的神经元随后与 宿主神经元形成突触接触并表达和释放⑶NF和BDNF。表现出急性运动神经元疾病的大鼠 S0D1G93A模型可用于研究和证实NSCs在疾病中的有益作用。为此，所公开的方法中使用的 NSC移植物在神经变性环境中很好地存活并发挥有力的临床作用。
[0184] 这些作用至少一部分与这些移植物表达和释放运动神经元生长因子的能力有关。 因此，所公开的方法的移植NSCs延缓了急性运动神经疾病的发作并将这些动物的寿命延 长了 10天以上，尽管移植方案受限--其被限定至腰部隆突。
[0185] 来自8周胎龄的死后人胎儿的脊髓组织的人类HSCs(NSI_566RSC)在含有成纤 维细胞生长因子（FGF-2)的无血清培养基中扩增大约12-12代，然后移植。用抗人体核 抗原（Hnu)的抗体可靠地追踪这些细胞的命运（fate) (Johe等人，1996)。使用这些细 胞的所有手术程序均根据 Animal Care and Use Committee of the JohnsHopkins Medical Institution s批准并经此引用并入本文的规程进行，使用气体麻醉（安氟醚：氧：一氧化 二氮=1 : 33 : 66)和无菌法进行。
[0186] 在显微镜引导下，将活和死NSCs移植到放在Kopf脊柱立体定位装置上的9周 大（220-300克）混合性别S0D1G93A大鼠的腰部隆突（L4&L5)中。死细胞通过在移植之 前反复冷冻和解冻来制备。用经由硅橡胶管连接到10微升Hamilton微量注射器上的 pulled-beveled玻璃微量吸移管，将细胞悬浮液在无菌条件下经由对腹角两侧上的腹角的 大约8次注射（每个注射位置5X10 4NSC，每侧四个注射位置）输送。根据实验数据（其表 明在未治疗的动物或接受环孢菌素的动物中，移植物存活不超过一个月），所有大鼠均接受 FK-506(1毫克/千克，腹腔注射）以防止免疫排斥。
[0187] 每周两次测试大鼠的运动强度和重量。运动强度试验包括basso、Beattie和 Bresnahan(BBB)运动评分标准（Basso 等人，1995)，和斜面标准（Rivlin 和 Tator，1977)。 对于BBB分数测试，在户外测试动物大约4或5分钟。所有运动性能均根据标准记录和分 级。对于斜面测试，将大鼠放在斜面毡子上，并将角度调节至使它们的位置稳定大约5秒的 最大角度。然后记录该角度作为动物的斜面分数。通过MAN0VA然后通过Fisher LSD post hoc试验分析BBB和斜面分数。疾病发作是指体重开始急剧降低的时点。通过在两组之间 比较疾病发作时的年龄和死亡年龄（用学生实验）以及用Kaplan-Meier存活分析然后用 long-rank试验，分析受移植物类型（活或死细胞移植物）影响的疾病进程。
[0188] 当BBB分数（见下文）低于3时--此时只有一个关节具有运动性或完全没有运 动性且动物被视为垂死，用灌流固定对大鼠实施安乐死。
[0189] 从用4%中性缓冲低聚甲醛灌注的动物上制备组织。通过在相同固定剂中再浸渍 4小时，进一步固定带有连接的根部和腰神经的胸-腰脊髓节段。将含有整个移植区域加上 该区段上下1毫米的边缘的区段冷藏并冷冻以进一步加工。L3-S1根部作为整标本制品单 独加工或在用玻璃吸移管的热凝顶端分离支根后进行加工。在横剖面或矢面将这些区段切 片（35微米）。用双标记免疫荧光（其在多数情况下将Hnu (-种人特异性标记物）与另一 细胞标记物结合）研究NSC存活和分化，并如Yan等人，2004中所述进行。
[0190] 使用在来自我们的免疫荧光制品的任选高放大率（ΙΟΟχ)视场上计数HNu(+)细 胞以及用HNu和表型标记物双重标记的细胞总数的非体视学方法研究NSC分化。在每一 动物中，在被移植区域隔开大约1毫米的六个切片中各使用一个视场。HNu(+)与双重标记 profiles的数量汇集自在每种情况中计数并根据实验规程分组的所有六个视场。对于每一 治疗组（η = 6/组），生成单和双重标记的细胞的平均数。
[0191] 为了在移植活或死细胞（η = 4)的大鼠中评估运动神经存活，评测在128天大时 牺牲的动物的组织。根据体视学要求在来自每一动物的L3-S1区域中每6个切片进行一次 采样（Yan等人，2004)，并用如Yan等人，2004中所述的光学fractionator计数α -运动神 经元，其被确定为具有明确的核和大于35微米的体细胞直径的多级细胞。用学生t试验分 析移植活细胞与死细胞的动物之间的差别。
[0192] 对于运动神经营养因子的ELISA测定，用25G注射器从气体麻醉下的动物的第四 室中进行CSF取样。从1毫米厚的新鲜脊髓切片上横向切下含有移植位置和与其相邻的区 域的组织样品。处理CSF或组织样品，并如Sheng等人，2003中所述首先测量总蛋白质。在 CSF 和脊髓样品中使用 E-MAX ImmunoAssay 系统（Promega，Madison，WI)测量⑶NF 和 BDNF 含量。在450纳米读取TMB-色原体吸光度。来自活移植物、与移植物相邻的区域和死细胞 移植物的样品之间的浓度差异用one-way AN0VA然后用Tukey's Multiple Comparison post hoc test分析。用学生t试验分析移植活细胞与死细胞的动物之间的CSF浓度差异。
[0193] 对于运动神经营养因子的免疫印迹法，用分子量标记物使如对于ELISA那样 制成的来自CSF活脊髓的蛋白质样品发生电泳，并转移到硝化纤维素膜上。在含有5% 驴血清的TBS，pH7. 4中阻断印迹，然后首先在⑶NF和BDNF抗体中（1 : 500;过夜， 4°C)，然后在HRP-linked驴抗羊IgG(对于⑶NF)和抗兔IgG(对于BDNF)中（1 : 200; 如〇1^〇1111111]11111〇1^8631'〇11)(1小时，室温）培养。所有抗体均在含有5(%驴血清的1133中 稀释。将印迹用 SuperSignal Chemiluminescent Substrate (Pierce)显影并曝光到 Kodak-XAR底片（EastmanKodak，Rochester，NY)上。然后去除（strip)印迹并用 β-肌动蛋 白抗体（1 : 500，Sigma)和 HRP-linked 驴抗鼠 IgG(l : 10000，JacksonImmunoResearch) 重新印迹。用 Bio-Rad Quantity One 软件（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)分析免 疫反应带。对每个动物计算带密度比率（⑶NF活BDNF : β -肌动蛋白），且如在ELISA实验 中那样，输入组平均值进行统计分析。
[0194] 通过用人特异性HNu抗体进行免疫染色，识别移植后22周的SOD 1G93A大鼠的脊 髓中的人NSCs。HNu(+)细胞表现为存活在腹角（A)中，并极大部分被神经元谱系标记物， 例如微管相关性表位TUJ-1染色。通过人类核蛋白（HNu)标记识别人类NSCs，且对于HNu 和对神经前体、神经元和神经胶质细胞特异性的表位，用双重免疫细胞化学追踪它们的表 型命运。在S0D1G93A大鼠中实验的最后，人类NSCs表现出强劲的移植和优异的长期存 活。大部分HNu (+)细胞（70. 4±6. 4% )基于它们的TUJ-1共位性分化成神经元谱系。大 约1/5(19.2±5.6%)!^1^+)细胞与巢蛋白共位且非常少（1.3±0.9%)的!^11(+)细胞为 GFAP阳性。
[0195] 用移植物/宿主细胞的perikaryal标记物和对宿主或移植末端呈选择性的标 记物测试人类NSCs结合到宿主回路中的能力。将切片进行HNu染色以建立移植物来源， 进行TUJ-1染色以建立神经元分化，以及识别大鼠和小鼠表位而非人类表位的突触前蛋白 Bassoon(BSN)的单克隆抗体。据发现，大鼠来源的突触小结接触到薄壁组织位置的大量 HNu(+)、TUJ-l(+)细胞。
[0196] 在共焦显微法中，带有HNU(+)核和TUJ-1 (+)细胞质的NSC源神经元细胞被大鼠 末端接触。相反，用TUJ-1和人特异性突触体素染色的制品表现出与宿主神经元，尤其是大 和小运动神经元并置的小突触小结的致密末端场。大量来自移植物的突触小结接触宿主运 动神经元。针对HNu和人NF-70染色的水平切片显示出大量来自移植物的轴突，移植物留 在左侧并优先沿腹索的白质运行。使用具有ChAT免疫反应性的细胞/处理法从腹角中的 白质中描绘出灰质。与移植位置相联地发现用抗神经丝表位NF70的人特异性抗体标记的 大量轴突，表明许多人类NSCs分化成投射神经元；这些轴突对腹角的白质表现出优选性。
[0197] 移植到S0D1G93A大鼠腹索中的NSC移植物延长了寿命并延缓了运动神经元死亡 和疾病发作和发展。在活细胞（L)和死细胞（对照物，C)移植物的情况下，临床和病理学 测量的进程分析显示在图9中。通过Kaplan-Meier和端点分析，移植活NSCs的动物表现 出显著提高的存活。Kaplan-Meier图（图9A)表明在整个观察期（P = 0. 0003)实验和对 照动物之间的显著区别。BBB户外和斜面试验分数的时间图（图9B)表明与接受死NSCs的 动物相比，移植活NSCs的动物的肌肉软弱的发展明显缓慢。
[0198] 在接受活或死NSCs并在128天大时安乐死的一小组动物中，检查NSCs对Tg 大鼠的腰部隆突（L3-S1)中运动神经存活的影响。移植死NSCs的动物的平均寿命 为138天，而移植活NSCs的大鼠的平均寿命为149天。因此，在实验和对照大鼠 （P = 0.0005)之间存在11天的显著寿命差异。对于接受死细胞的动物，平均疾病发作时间 (time-t〇-disease-〇nset)为115天，而对于移植活NSCs的动物则为122天。在两组之间 (P = 〇. 0001)观察到疾病发作时间的7天的显著差异。
[0199] α -运动神经元的体视学评估数量对于接受活NSCs的动物而言为6, 418,对于移 植死NSCs的大鼠而言为3, 206,即实验组的腰部隆突中神经元的数量为相同年龄的对照动 物的两倍之多。在128天大的代表性实验大鼠和对照大鼠中，在活和死NSC组之间观察到 在腰部隆突中3, 212个细胞的差异（P = 0. 01)。
[0200] 人类NSCs对变性运动神经提供的神经保护的可能机制包括表达和释放出两种 对哺乳动物运动神经元具有典型营养作用的肽，[BDNF和⑶NF] (Henderson等人，1994 ; Koliatsos等人，1993)。测定⑶NF和BDNF在移植S0D1G93A大鼠的脊髓中的表达和释放。 通过免疫印迹法和ELISA评测脊髓制品和CSF样品的BDNF和⑶NF。通过ELISA测定移植 活细胞的大鼠（L1和L2)和移植死细胞的动物（C)的薄壁组织和CSF中的GDNF浓度。L1 代表通过移植位置的浓度，而L2反映高或低一节段的组织中的浓度。各组之间的差异是显 著的，并由L1或L2与C组之间的极大不同引起。
[0201] 通过t试验，实验（活细胞，L)和对照（死细胞，C)组之间的CSF浓度差异也是明 显的。在移植活NSC的动物中，ELSA表现出在移植位置0. 912±0. 050pg/μ g的浓度和在 脊髓中相距一节段的位置0. 819±0. 115pg/y g的浓度。在移植死NSCs的动物中，含移植 物的脊髓节段中的这些浓度为〇. 368±0. 026pg/μ g的浓度。在CSF中，实验组中⑶NF浓 度为0. 027±0. 012pg/y 1和0. 006±0. 002pg/y 1。这些数据表明⑶NF在脊髓中的表达和 释放增加三倍，且在带有活NSCs的动物的CSF中⑶NF分泌增加五倍。
[0202] 免疫印迹法也显示了移植活NSCs的动物中较高的标准化GDNF浓度。GDNF免疫印 迹法通过检测16kDa蛋白质证实ELISA的提高状况。免疫印迹法还表现出在活细胞移植物 中0. 860 ±0. 007和在死细胞移植物中0. 708 ±0. 052的标准化⑶NF密度。
[0203] 测定实验鼠和对照组的薄壁组织和CSF中BDNF的ELISA染色。ELISA分析表现 出在移植位置（L1)0. 086±0. OHpg/μ g的浓度和在实验动物中与移植物相距一节段的位 置α2)0.054±0.009ρ8/μ8的浓度。在对照大鼠中，含移植物的节段中的BDNF浓度为 O.OlOiO.OOSpg/yg的浓度。实验和对照CSF浓度之间的差异明显。在CSF中，实验动物 中BDNF浓度为(λ 041±(X 013pg/y 1，在对照物中为(λ 010±(X 008pg/y 1。这些发现表明 BDNF浓度在脊髓中增加八倍且在实验动物的CSF中增加四倍。同时，ELISA数据表明在移 植活NSCs的动物中，尤其是在CSF中，⑶NF与BDNF相比具有分布更广的分泌。
[0204] 免疫细胞化学还表明，极大部分的移植HNu(+)细胞表达GDNF。带有活移植物的动 物中的⑶NF源是移植细胞本身。在HNu (红色）和⑶NF(绿色）的双重染色制品中，显示 出移植NSCs的细胞质内GDNF免疫反应性的充足性。在接受活移植物的动物中，在宿主运 动神经元内类似分泌泡囊的细胞质结构周围具有强烈的GDNF免疫反应性，
[0205] 用⑶NF和人突触体素（后者用于标记源自移植物的末端）染色的宿主运动神经 元的共焦显微术表明⑶NF局限在泡囊结构中而非位于所示宿主运动神经元表面上的源自 移植物的末端中。用人突触体素抗体（用于标记刺激宿主运动神经元的所有移植物末端） 和GDNF染色的片段表明，在接触宿主运动神经元的突触小结中缺乏两种蛋白质的任何共 位性。
[0206] 带有活移植物的大鼠表现出起源于移植物并刺激中央管中及其周围的结构的精 密通路。与接触宿主运动神经元的末端中不存在GDNF蛋白质的情况相反，极大部分的刺激 中央管的NSC源轴突末端与GDNF免疫反应性共位（co-localize)。在刺激中央管中的室管 膜细胞的源自移植物的末端中，观察到人类突触体素和GDNF的广泛共位。这些解剖学状况 表明，⑶NF可能经由逆转运被刺激移植物的宿主运动神经元吸收且不经由跨突触传输而被 输送到这些神经元上（Rind等人，2005)。
[0207] 移植NCSs对SOD 1G93A大鼠腹角中正在进行的变性过程的明显抵抗尤为具有发展 前景。在此报道的NSCs的存活和大量分化有利地表明，与含S0D1G93A的运动神经元有关的 炎性/兴奋毒性信号传输（Rothstein等人，1992 ;Howland等人，2002 ;Turner等人，2005) 对细胞没有明显毒性。这种因素本身提高了对使用移植物恢复变性运动神经元疾病中的运 动功能的未来细胞策略的信心。
[0208] 实施例7.通过移植人脊髓神经干细胞/祖细胞治疗外伤性脊髓损伤.治疗脊髓 空洞症
[0209] 将扩增的人脊柱干细胞注入免疫抑制的成熟雌性Sprague-Dawley或免疫缺陷的 无胸腺裸鼠中。在移植前1个月，在两组中均制造 C4-5挫伤。移植物受体（η = 24)在移 植后存活60-150天。人源NSCs形成由神经元、星形细胞和少突胶质细胞构成的大的细胞 聚集体。这些移植物总是完全填充每一损伤。Immature-appearing,NeuN+/人类核+神经 元通常构成供体细胞种群的50 %。这些神经元将人类神经丝+过程输送通过与移植物位置 相距至少2厘米的灰质核白质。在宿主和移植物神经元附近均注意到强烈的人特异性突触 体素免疫反应性，且似乎非反应性的GFAP+细胞与供体神经元并置。此外，这些移植物支持 似乎来自宿主来源的TH+和5HT+纤维的生长。这种NSC' s系由此似乎具有有利于脊柱内 灰质修复的类似初生胎儿CNS的质量。
[0210] 应该理解的是，对本文所述的优选实施方案的各种变动和修改是本领域技术人员 显而易见的。这类变动和修改可以在不背离所公开的方法的精神和范围且不减损其预期优 点的情况下进行。因此，所附权利要求覆盖了这类变动和修改。
[0211] 以下内容对应本申请母案的原始权利要求书
[0212] 1.治疗痉挛状态、僵硬或肌肉活动过度症状的方法，包括：a)从哺乳动物中分离 出至少一个神经干细胞；b)将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群；c)浓缩该扩增种群； 和d)将治疗有效量的所述扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域，其中至少20%的扩 增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。
[0213] 2.项1的方法，其中所述症状源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑损 伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢性 局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
[0214] 3.项1的方法，其中从选自中枢神经系统、外周神经系统、骨髓、周围血液、脐带血 和至少一个胚胎的来源中分离出神经干细胞。
[0215] 4.项3的方法，其中所述哺乳动物是发育中的哺乳动物。
[0216] 5.项4的方法，其中所述发育中的哺乳动物的胎龄为大约6. 5至大约20周。
[0217] 6.项4的方法，其中从人类胎儿脊髓中分离出神经干细胞。
[0218] 7.项1的方法，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干细 胞。
[0219] 8.项1的方法，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因子。
[0220] 9.项8的方法，其中生长因子选自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它们的组合。
[0221] 10.项1的方法，其中治疗有效量的扩增种群能够在体内生成至少1000个GABA能 神经元。
[0222] 11.项1的方法，其中治疗有效量的扩增种群能够在体内生成至少1000个甘氨酸 能神经元。
[0223] 12.项1的方法，其中至少40%的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。
[0224] 13.项1的方法，其中引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多个区域。
[0225] 14.项1的方法，其中至少30%的扩增种群能够在体外分化成神经元。
[0226] 15.能够治疗痉挛状态、僵硬和肌肉活动过度症状的神经干细胞，其中所述神经干 细胞分离自哺乳动物中并在体外扩增成扩增种群，其中将包括该神经干细胞的所述扩增种 群浓缩，且其中将治疗有效量的所述扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域，其中至少 20 %的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。
[0227] 16.治疗慢性疼痛的方法，包括：a)从哺乳动物中分离出至少一个神经干细胞；b) 将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群；c)浓缩扩增种群；和d)将治疗有效量的所述扩增 种群引入接受者脊髓的至少一个区域，其中至少20%的扩增种群能够在接受者脊髓中生成 神经元。
[0228] 17.项16的方法，其中慢性疼痛源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑 损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢 性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
[0229] 18.项16的方法，其中从选自中枢神经系统、外周神经系统、骨髓、周围血液、脐带 血、至少一个胚胎和它们的任意组合的来源中分离出神经干细胞。
[0230] 19.项18的方法，其中哺乳动物是发育中的哺乳动物。
[0231] 20.项19的方法，其中发育中的哺乳动物的胎龄为大约6. 5至大约20周。
[0232] 21.项19的方法，其中从人类胎儿脊髓中分离出神经干细胞。
[0233] 22.项16的方法，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干细 胞。
[0234] 23.项16的方法，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因 子。
[0235] 24.项23的方法，其中生长因子选自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它们的组合。
[0236] 25.项16的方法，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个GABA能神经 J Li 〇
[0237] 26.项16的方法，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个甘氨酸能神经 J Li 〇
[0238] 27.项16的方法，其中至少40%的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。
[0239] 28.项16的方法，其中引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多个区域。
[0240] 29.项28的方法，其中这些区域包括背角。
[0241] 30.项28的方法，其中这些区域包括鞘内空间。
[0242] 31.项16的方法，其中至少30%的扩增种群能够在体外分化成神经元。
[0243] 32.能够治疗慢性疼痛的神经干细胞，其中所述神经干细胞分离自哺乳动物中并 在体外扩增成扩增种群，其中将包括该神经干细胞的所述扩增种群浓缩，并将治疗有效量 的所述扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域，其中至少20%的扩增种群能够在接受者 脊髓中生成神经元。
[0244] 33.治疗运动神经元变性的方法，包括：a)从哺乳动物中分离出至少一个神经干 细胞；b)将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群；c)浓缩扩增种群；和d)将治疗有效量的 所述扩增种群的至少一个神经干细胞引入接受者脊髓的一个区域，其中至少20%的扩增种 群能够在接受者脊髓中生成神经元。
[0245] 34.项33的方法，其中运动神经元变性源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外 伤性脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬 化症、慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
[0246] 35.项33的方法，其中从选自中枢神经系统、外周神经系统、骨髓、周围血液、脐带 血和至少一个胚胎的来源中分离出神经干细胞。
[0247] 36.项35的方法，其中哺乳动物是发育中的哺乳动物。
[0248] 37.项36的方法，其中发育中的哺乳动物的胎龄为大约6. 5至大约20周。
[0249] 38.项36的方法，其中从人类胎儿脊髓中分离出神经干细胞。
[0250] 39.项33的方法，包括从富含至少一种神经元亚型的区域中分离出神经干细胞， 其中所述神经元亚型产生能够有效改善运动缺陷的生长因子。
[0251] 40.项33的方法，其中扩增种群包括一定量的能够分化成足以分泌治疗有效量的 至少一种生长因子的神经元的神经干细胞。
[0252] 41.项33的方法，其包括从富含运动神经元的区域中分离出神经干细胞。
[0253] 42.项33的方法，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干细 胞。
[0254] 43.项33的方法，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因 子。
[0255] 44.项43的方法，其中生长因子选自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它们的组合。
[0256] 45.项33的方法，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个GABA能神经 J Li 〇
[0257] 46.项33的方法，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个甘氨酸能神经 J Li 〇
[0258] 47.项33的方法，其中至少40%的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。
[0259] 48.项33的方法，其中引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多个区域。
[0260] 49.项33的方法，其中至少30%的扩增种群能够在体外分化成神经元。
[0261] 50.能够治疗运动神经元变性的神经干细胞，其中所述神经干细胞分离自哺乳动 物并在体外扩增成扩增种群，其中将包括该神经干细胞的所述扩增种群浓缩，且其中将治 疗有效量的所述扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域，其中至少20%的扩增种群能够 在接受者脊髓中生成神经元。
[0262] 51.治疗脊髓空洞症的方法，包括：a)从哺乳动物中分离出至少一个神经干细胞； b)将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群；c)浓缩该扩增种群；和d)将治疗有效量的所 述扩增种群引入接受者脊髓的脊髓空洞，其中至少20%的扩增种群能够在接受者脊髓的脊 髓空洞中生成神经元。
[0263] 52.项51的方法，其中脊髓空洞症源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性 脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、 慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
[0264] 53.项51的方法，其中从选自中枢神经系统、外周神经系统、骨髓、周围血液、脐带 血、至少一个胚胎和它们的任意组合的来源中分离出神经干细胞。
[0265] 54.项53的方法，其中哺乳动物是发育中的哺乳动物。
[0266] 55.项54的方法，其中发育中的哺乳动物的胎龄为大约6. 5至大约20周。
[0267] 56.项54的方法，其中从人类胎儿脊髓中分离出神经干细胞。
[0268] 57.项51的方法，其包括从富含至少一种神经元亚型的区域中分离出神经干细 胞，其中所述神经元亚型产生能够有效改善脊髓空洞症的生长因子。
[0269] 58.项51的方法，其包括从富含运动神经元的区域中分离出神经干细胞。
[0270] 59.项51的方法，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干细 胞。
[0271] 60.项51的方法，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因 子。
[0272] 61.项60的方法，其中生长因子选自bFGF、EGF、TGF_a、aFGF和它们的组合。
[0273] 62.项51的方法，其中扩增种群包括一定量的能够分化成足以分泌治疗有效量的 至少一种生长因子的神经元的神经干细胞。
[0274] 63.项51的方法，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个神经元。
[0275] 64.项51的方法，其中至少40%的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。
[0276] 65.项51的方法，其中引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多个区域。
[0277] 66.项51的方法，其中至少30%的扩增种群能够在体外分化成神经元。
[0278] 67.项51的方法，其中将扩增种群的至少100, 000个神经干细胞引入接受者脊髓 的脊髓空洞中。
[0279] 68.能够治疗脊髓空洞症的神经干细胞，其中所述神经干细胞分离自哺乳动物中 并在体外扩增成扩增种群，其中将包括该神经干细胞的所述扩增种群浓缩，且其中将治疗 有效量的所述扩增种群引入接受者脊髓的脊髓空洞，其中至少20%的扩增种群能够在接受 者脊髓的脊髓空洞中生成神经元。
[0280] 69.将至少一个神经干细胞扩增成神经干细胞的扩增种群的方法，其中每次神经 干细胞扩增在不分化的情况下超过30次细胞倍增，所述方法包括：从中枢神经系统组织中 离解神经干细胞；向培养皿提供至少一种细胞外蛋白质，其中该细胞外蛋白质包括至少大 约10微克/毫升的聚-D-赖氨酸和大约1毫克/毫升纤连蛋白；在所述培养皿中在不存在 血清的情况下培养离解的神经干细胞；在培养皿中添加至少一种选自bFGF、EGF、TGF-α、 aFGF和它们的组合的生长因子；和使培养的细胞在汇合之前传代。
[0281] 70.项69的方法，其中扩增的神经干细胞能够分化成神经元。
[0282] 71.项69的方法，其中将所述神经干细胞扩增包括将纤连蛋白作为可溶因子添加 到培养基中。
[0283] 72.项69的方法，其中离解细胞并使细胞传代包括酶促离解。
[0284] 73.项72的方法，其中酶促离解包括用胰蛋白酶处理细胞。
[0285] 74.项69的方法，其中将治疗有效量的所述扩增种群引入接受者神经系统的至少 一个区域中以治疗神经变性症状。
【权利要求】
1. 分离自哺乳动物的至少一个神经干细胞在制备用于治疗痉挛状态、僵硬或肌肉活动 过度症状的药物中的用途，其中： a) 将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群； b) 浓缩该扩增种群；和 c) 治疗有效量的所述扩增种群用于引入接受者脊髓的至少一个区域，其中至少20% 的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。
2. 权利要求1的用途，其中所述症状源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑 损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢 性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
3. 权利要求1的用途，其中所述神经干细胞分离自选自中枢神经系统、外周神经系统、 骨髓、周围血液、脐带血和至少一个胚胎的来源。
4. 权利要求3的用途，其中所述哺乳动物是发育中的哺乳动物。
5. 权利要求4的用途，其中所述发育中的哺乳动物的胎龄为大约6. 5至大约20周。
6. 权利要求4的用途，其中所述神经干细胞分离自人类胎儿脊髓。
7. 权利要求1的用途，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干细 胞。
8. 权利要求1的用途，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因 子。
9. 权利要求8的用途，其中生长因子选自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它们的组合。
10. 权利要求1的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够在体内生成至少1000个GABA 能神经元。
11. 权利要求1的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够在体内生成至少1000个甘氨 酸能神经元。
12. 权利要求1的用途，其中至少40%的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。
13. 权利要求1的用途，其中引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多个区域。
14. 权利要求1的用途，其中至少30%的扩增种群能够在体外分化成神经元。
15. 分离自哺乳动物的至少一个神经干细胞在制备用于治疗慢性疼痛的药物中的用 途，其中： a) 将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群； b) 浓缩扩增种群；和 c) 治疗有效量的所述扩增种群用于引入接受者脊髓的至少一个区域，其中至少20% 的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。
16. 权利要求15的用途，其中慢性疼痛源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性 脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、 慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
17. 权利要求15的用途，其中所述神经干细胞分离自选自中枢神经系统、外周神经系 统、骨髓、周围血液、脐带血、至少一个胚胎和它们的任意组合的来源。
18. 权利要求17的用途，其中哺乳动物是发育中的哺乳动物。
19. 权利要求18的用途，其中发育中的哺乳动物的胎龄为大约6. 5至大约20周。
20. 权利要求18的用途，其中所述神经干细胞分离自人类胎儿脊髓。
21. 权利要求15的用途，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干 细胞。
22. 权利要求15的用途，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因 子。
23. 权利要求22的用途，其中生长因子选自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它们的组合。
24. 权利要求15的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个GABA能神 经元。
25. 权利要求15的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个甘氨酸能神 经元。
26. 权利要求15的用途，其中至少40%的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。
27. 权利要求15的用途，其中引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多个区域。
28. 权利要求27的用途，其中这些区域包括背角。
29. 权利要求27的用途，其中这些区域包括鞘内空间。
30. 权利要求15的用途，其中至少30%的扩增种群能够在体外分化成神经元。
31. 分离自哺乳动物的至少一个神经干细胞在制备用于治疗运动神经元变性的药物中 的用途，其中： a) 将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群； b) 浓缩扩增种群；和 c) 治疗有效量的所述扩增种群的至少一个神经干细胞用于引入接受者脊髓的一个区 域，其中至少20%的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。
32. 权利要求31的用途，其中运动神经元变性源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、 夕卜伤性脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻搏、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索 硬化症、慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
33. 权利要求31的用途，其中所述神经干细胞分离自选自中枢神经系统、外周神经系 统、骨髓、周围血液、脐带血和至少一个胚胎的来源。
34. 权利要求33的用途，其中哺乳动物是发育中的哺乳动物。
35. 权利要求34的用途，其中发育中的哺乳动物的胎龄为大约6. 5至大约20周。
36. 权利要求34的用途，其中所述神经干细胞分离自人类胎儿脊髓。
37. 权利要求31的用途，其中所述神经干细胞分离自富含至少一种神经元亚型的区域 中，其中所述神经元亚型产生能够有效改善运动缺陷的生长因子。
38. 权利要求31的用途，其中扩增种群包括一定量的能够分化成足以分泌治疗有效量 的至少一种生长因子的神经元的神经干细胞。
39. 权利要求31的用途，其中所述神经干细胞分离自富含运动神经元的区域。
40. 权利要求31的用途，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干 细胞。
41. 权利要求31的用途，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因 子。
42. 权利要求41的用途，其中生长因子选自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它们的组合。
43. 权利要求31的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个GABA能神 经元。
44. 权利要求31的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个甘氨酸能神 经元。
45. 权利要求31的用途，其中至少40%的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。
46. 权利要求31的用途，其中引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多个区域。
47. 权利要求31的用途，其中至少30%的扩增种群能够在体外分化成神经元。
48. 分离自哺乳动物的至少一个神经干细胞在制备用于治疗脊髓空洞症的药物中的用 途，其中： a) 将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群； b) 浓缩该扩增种群；和 c) 治疗有效量的所述扩增种群用于引入接受者脊髓的脊髓空洞，其中至少20%的扩 增种群能够在接受者脊髓的脊髓空洞中生成神经元。
49. 权利要求48的用途，其中脊髓空洞症源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤 性脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化 症、慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。
50. 权利要求48的用途，其中所述神经干细胞分离自选自中枢神经系统、外周神经系 统、骨髓、周围血液、脐带血、至少一个胚胎和它们的任意组合的来源。
51. 权利要求50的用途，其中哺乳动物是发育中的哺乳动物。
52. 权利要求51的用途，其中发育中的哺乳动物的胎龄为大约6. 5至大约20周。
53. 权利要求51的用途，其中所述神经干细胞分离自人类胎儿脊髓。
54. 权利要求48的用途，其中所述神经干细胞分离自富含至少一种神经元亚型的区 域，其中所述神经元亚型产生能够有效改善脊髓空洞症的生长因子。
55. 权利要求48的用途，其中所述神经干细胞分离自富含运动神经元的区域。
56. 权利要求48的用途，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干 细胞。
57. 权利要求48的用途，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因 子。
58. 权利要求57的用途，其中生长因子选自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它们的组合。
59. 权利要求48的用途，其中扩增种群包括一定量的能够分化成足以分泌治疗有效量 的至少一种生长因子的神经元的神经干细胞。
60. 权利要求48的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个神经元。
61. 权利要求48的用途，其中至少40%的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。
62. 权利要求48的用途，其中引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多个区域。
63. 权利要求48的用途，其中至少30%的扩增种群能够在体外分化成神经元。
64.权利要求48的用途，其中扩增种群的至少100, 000个神经干细胞用于引入接受者 脊髓的脊髓空洞中。
【文档编号】A61P25/02GK104042629SQ201410240718
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2005年11月17日 优先权日:2004年11月17日
【发明者】M·马莎拉, K·K·乔, T·G·黑兹尔, 垣花修, V·科利亚索斯, 阎军, P·J·赖尔, M·J·维拉多 申请人:神经干公司