免疫原性多肽和单克隆抗体的制作方法

专利名称：：免疫原性多肽和单克隆抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及免疫学，更特别地涉及引发对细菌的免疫反应。背景肺炎链球菌(Str印tococcuspneumoniae)是相当普遍的人类病原体，其可以感染一些器官，包括肺、中枢神经系统(CNS)、中耳和鼻道。感染引起各种症状，例如支气管炎、肺炎、脑膜炎、鼻窦感染和败血症。肺炎链球菌是人类中细菌性脑膜炎的主要原因，尽管有抗生素治疗，与显著的死亡率和发病率相关(Quagliarelloetal.,(1992)N.Eng.J.Med.327:869_872)。存在着两种现用的肺炎球菌疫苗。一种是用于成年人由23种不同的荚膜多糖组成的疫苗，所述荚膜多糖在一起代表了引起肺炎球菌感染的约90%的菌株的荚膜类型。然而，这种疫苗在儿童中不是免疫原性的，儿童是对肺炎球菌感染有高度敏感性的年龄组。在成年人中，疫苗已经显示了对菌血症性肺炎是约60%有效的，但是它在由于年龄或潜在医学状况处于肺炎球菌感染的更高风险中的成年人中是不那么有效的(Fedson，andMusher.2004."PneumococcalPolysaccharideVaccine，，，pp.529-588.InVaccines.S.A.PlotkinandW.A.Orenstein(eds.),W.B.SaundersandCo.,Philadelphia,PA；Shapiroetal.，N.Engl.J.Med.325:1453-1460(1991))。这种疫苗没有显示对感染的最普通的形式、非菌血症性肺炎球菌肺炎的有效性。第二种现有的疫苗是7-价的缀合物疫苗，其在低于2岁的儿童中对菌血症性肺炎球菌感染是有效的。它还展现了对肺炎的效力(Blacketal.,Arch.Pediatr.11(7)485-489(2004))。由于需要产生7种不同的缀合物，这种疫苗的生产是复杂的，这导致了该疫苗是昂贵的(约$200/儿童)。而且，在非疫苗型肺炎链球菌非常常见的发展中世界，该疫苗对于覆盖感染做得不好(DiFabioetal.，Pediatr.Infect.Dis.J.20:959_967(2001)；Mulholland,Trop.Med.Int.Health10:497-500(2005))。该疫苗对抗中耳炎和定殖不象它对抗侵入性疾病那样好。还显示了，7-价的缀合物疫苗的使用导致具有不被疫苗中包括的7种多糖所代表的荚膜类型的菌株的定殖和疾病方面的提高(Bogaertetal.，LancetInfect.Dis.4144-154(2004)；Eskolaetal.,N.Engl.J.Med.344403-409(2001)；Mbelleetal.，J.Infect.Dis.1801171-1176(1999))。因而，仍然需要对肺炎链球菌的有效的治疗。概述描述了引发针对肺炎链球菌的免疫反应的组合物和方法。提供了免疫原性PhtD多肽、特别是其片段、衍生物和变体，以及编码它们的核酸。还提供了具有对这样的多肽、片段、衍生物或变体具有特异性的单克隆抗体(和产生它们的杂交瘤)。进一步提供的是制造和使用所述免疫原性多肽、衍生物、变体和单克隆抗体的方法。本发明提供了选自以下构成的组的分离的核酸a)编码具有与SEQIDN0:2至少90%同一性的肺炎链球菌多肽的核酸；b)与编码具有与SEQIDNO:2至少90%同一性的肺炎链球菌多肽的核酸完全互补的核酸；和c)(a)或(b)的RNA，其中U替代了T。根据本发明的优选的实施方式，所述序列同一性是至少85%、90%，更优选的95到100%。本发明还提供了包含具有与SEQID吣2至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列的分离的多肽，以及特异性结合具有与SEQID而2至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的多肽的单克隆抗体。根据本发明的另一个方面，提供了选自以下构成的组的分离的核酸a)编码具有与SEQIDNO:3至少80%同一性的肺炎链球菌多肽的核酸；b)与编码具有与SEQIDNO:3至少80%同一性的肺炎链球菌多肽的核酸完全互补的核酸；和c)(a)或(b)的RNA，其中U替代了T。根据本发明的优选的实施方式，所述序列同一性是至少85%、90%，更优选的95%到100%。本发明还提供了包含具有与SEQIDN0:3至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列的分离的多肽，以及特异性结合具有与SEQIDN0:3的至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的多肽的单克隆抗体。根据本发明的另一个方面，提供了选自以下构成的组的分离的核酸a)编码具有与SEQIDNO:4至少80%同一性的肺炎链球菌多肽的核酸；b)与编码具有与SEQIDNO:4至少80%同一性的肺炎链球菌多肽的核酸完全互补的核酸；和c)(a)或(b)的RNA，其中U替代了T。根据本发明的优选的实施方式，所述序列同一性是至少85%、90%，更优选的95%到100%。本发明还提供了包含具有与SEQID吣4至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列的分离的多肽，以及特异性结合具有与SEQIDN0:4的至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的多肽的单克隆抗体。根据本发明的进一步的方面，提供的是特异性结合具有SEQIDNO4中所列氨基酸序列的肽的抗原决定簇的单克隆抗体。根据本发明的优选的实施方式，所述单克隆抗体特异性结合的抗原决定簇位于具有SEQIDNO4所列氨基酸序列的肽中跨越氨基酸1和氨基酸101的区域中。本发明还提供了选自由SEQIDNO:2、SEQIDNO3和SEQIDNO4或其变体构成的组的免疫原性片段，所述变体选自由SEQIDNO15,SEQIDN0:16和SEQIDN0:17构成的组。根据本发明的另一个方面，还提供的是免疫宿主对抗链球菌属细菌感染的方法和治疗链球菌属细菌的感染的方法，包括向所述宿主施用选自由SEQIDN0:2、SEQIDNO3和SEQIDNO:4或其变体构成的组的至少一种PhtD多肽，所述变体选自由SEQIDNO:15、SEQIDN0:16和SEQIDN0:17构成的组。根据本发明的进一步的方面，提供的是单克隆抗体，其具有与ATCC编号XXXX的杂交瘤所产生的抗体相同的抗原结合特异性。在本发明的优选的实施方式中，所述单克隆抗体选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5、和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11构成的组。本发明还提供了在宿主中预防链球菌属细菌感染的方法和治疗链球菌属细菌感染的方法，包括向所述宿主施用选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11构成的组的至少一种单克隆抗体。在本发明的优选的实施方式中，至少两种单克隆抗体被施用来预防和/或治疗链球菌属细菌的感染。根据本发明的另一个方面，提供的是测定生物样品中蛋白质的数量的方法，包括使测试生物样品暴露于选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11或其衍生物构成的组的单克隆抗体，测量与所述样品结合的抗体或衍生物的数量，以及比较所述测试生物样品中结合的量与对照生物样品中观察到的结合的量，其中与所述对照生物样品相对的、所述测试生物样品中提高的结合表明其中所述蛋白质的存在。根据本发明的进一步的方面，提供的是检测生物样品中链球菌属细菌或其蛋白质的方法，所述方法包括步骤(a)使所述测试生物样品暴露于选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11或其衍生物构成的组的至少一种单克隆抗体，所述暴露在容许所述抗体与它具有特异性的所述样品中的成分的条件下进行；和(b)测定与所述测试生物样品的成分结合的抗体的数量；和，(c)比较与所述测试生物样品结合的抗体的数量和与对照样品结合的数量；其中与所述对照生物样品相比，显著更高数量的抗体与所述测试生物样品的成分的结合表明所述样品中链球菌属细菌或其蛋白质的存在。本发明还提供的是用于检测生物样品中链球菌属细菌或其蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包含选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11或其衍生物构成的组的至少一种单克隆抗体，和使用说明书。除了如上所述的示范性的方面和实施方式之外，参考以下详细说明的研究，进一步的方面和实施方式将变得明显。详细说明在此公开的是多肽和核酸，作为用于鉴定单克隆抗体的结合位点、从多克隆血清中吸出交叉反应性抗体、限定涵盖保护性表位的PhtD的区域、以比全长蛋白质所提供的更高的分辨率表征人类免疫反应(在临床试验中)的免疫学试剂或工具是有用的，并且可以提供生产期间的优势。作为测试试剂，这种截短的蛋白质的集合将容许表征PhtD对多价疫苗的单独的贡献。在一个实施方式中，组合物和方法对于治疗和/或预防与表达PhtD的生物体如链球菌属细菌的存在相关的状况是有用的，通过刺激针对PhtD的免疫反应，从而治疗所述生物体。免疫反应显示了在向宿主施用PhtD、其免疫原性片段，或其变体，或编码任何它们的核酸之后发生。在这种情况下，PhtD、其免疫原性片段，或其变体作为免疫原。如在此使用的，“免疫原”是各自来自PhtD的多肽、肽、片段，或其变体，其在已经施用了所述免疫原的宿主中产生免疫反应。所述免疫反应可以包括结合免疫原的至少一个表位的抗体的产生，和/或针对表达所述免疫原的表位的细胞的细胞免疫反应的产生。通过例如检测提高的抗体反应(即，抗体的数量，提高的亲和力/抗体亲抗原性)或提高的细胞反应(即，活化的T细胞的提高的数量，T细胞受体的提高的亲和力/抗体亲抗原性)，所述反应可以作为例如针对所述免疫原的现有免疫反应的增强来检测。免疫反应的其他测量是本领域已知的，可以用来测定宿主中免疫反应的存在。用于进行这些测定的标准的方法是本领域中可获得的。在某些实施方式中，所述免疫反应是可检测的，而不必然是保护性的。在这些情况下，包含所述免疫原的组合物可以被认为是免疫学组合物。在某些实施方式中，所述免疫反应是保护性的，意味着所述免疫反应能够预防表达PhtD的生物体(S卩，链球菌属物种)的生长、或从宿主中的消灭。在这种情况下，包含免疫原的组合物，虽然仍被认为是免疫学组合物，可以另外被称为疫苗。在某些实施方式中，在单个组合物中使用多种免疫原。PhtD的免疫原性片段(即，免疫原)在此与产生和使用片段的方法一起描述。此处描述的免疫原包括多肽，所述多肽包含全长PhtD(有或者没有信号序列)、其PhtD片段和其变体。优选的是所使用的氨基酸序列来自具有以下显示的氨基酸序列的肺炎链球菌PhtD(GenBank登录号AF318955；Adamou,etal.Infect.Immun.69(2)，949-958(2001))MKINKKYLAGSVAVLALSVCSYELGRHQAGQVKKESNRVSYID⑶QAGQKAENLTPDEVSKREGINAEQIVIKITDQGYVTSHGDHYHYYNGKVPYDAIISEELLMKDPNYQLKDSDIVNEIKGGYVIKVDGKYYVYLKDAAHADNIRTKEEIKRQKQEHSHNHGGGSNDQAVVAARAQGRYTTDDGYIFNASDIIEDTGDAYIVPH⑶HYHYIPKNELSASELAAAEAYWNGKQGSRPSSSSSYNANPAQPRLSENHNLTVTPTYHQNQGENISSLLRELYAKPLSERHVESDGLIFDPAQITSRTARGVAVPHGNHYHFIPYEQMSELEKRIARIIPLRYRSNHWVPDSRPEQPSPQSTPEPSPSPQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAVRKViiDGYVFEENGVSRYIPAKDLSAETAAGIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYDLLARIHQDLLDNKGRQVDFEALDNLLERLKDVPSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITYTDDEIQVAKLAGKYTTEDGYIFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKEKGLTPPSTDHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGSLIIPHYDHYHNIKFEffFDEGLYEAPKGYTLEDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.1)优选的免疫原性组合物包含例如具有SEQIDNO:2、3、4、15、16或17的氨基酸序列的一种或更多种多肽。这些多肽可以包括一个或更多个保守性氨基酸替换和/或信号序列和/或可检测的“标签”，例如His(SP，MGHHHHHH(SEQIDNO:18)，参见，例如，SEQIDNO:15-17)。示范性的，优选的免疫原性片段包括截短物1WVPDSRPEQPSPQSTPEPSPSPQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAVRKV⑶GYVFEENGVSRYIPAKDLSAETAAGIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYDLLARIHQDLLDNKGRQVDFEALDNLLERLKDVPSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITYTDDEIQVAKLAGKYTTEDGYIFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKEKGLTPPSTDHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGSLIIPHYDHYHNIKFEWFDEGLYEAPKGYTLEDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.2)；截短物2VKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.3)；和，截短物3HVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.4)。如上所述，在此提供的免疫原性多肽可以包括对免疫原性PhtD多肽(S卩，SEQIDNO:2、3和/或4)的一个或更多个保守性氨基酸替换。例如，在此提供的免疫原可以包含具有一个或更多个氨基酸序列修饰的天然存在的PhtD的C-末端部分，从而保持了与天然存在的PhtD的约60到约99%的序列同一性或相似性。示范性的变体具有约60到约99%、约60到约65%、约65到约70%、约70到约75%、约80到约85%、约85到约90%、约90到约99%或约95到约99%相似于或相同于SEQIDNO:2、3、4、15、16和/或17的氨基酸序列，和/或其任何片段或衍生物。优选的利用在此教导的或本领域可获得的方法，针对它们作为免疫原起作用的能力来选择变体。适合的氨基酸序列修饰包括对在此讨论的任何PhtD多肽的氨基酸的替换、插入、删除或其他改变。替换、删除、插入或其任何组合可以被组合到单个变体中，只要所述变体是免疫原性的多肽。插入物包括氨基和/或羧基末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。插入物通常将是比氨基或羧基末端融合物的那些更小的插入物，例如，在一个到四个残基的级别。删除的特征在于从蛋白质序列中除去一个或更多个氨基酸残基。一般地，在蛋白质分子内的任一个位点删除不超过约2到6个残基。这些变体通常通过编码蛋白质的DNA中核苷酸的定点诱变，从而产生编码变体的DNA，此后在重组细胞培养物中表达所述DNA来制备。在具有已知序列的DNA中的预定位点产生替换突变的技术是公知的，包括但不限于，M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸替换一般是单个残基的，但可以一次在多个不同的位置发生。替换变体是其中至少一个残基被除去，在该位置插入不同的残基的那些变体。这样的替换一般根据以下的表1来制备，被称为保守性替换，一般对该位置处氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性有很少的或没有影响，特别是，不产生降低的免疫原性。然而，其它的是本领域技术人员公知的。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在此使用的变体还包括来自可选择的链球菌属菌株的天然存在的PhtD等位基因，其在同源的PhtD基因内的一个或更多个位点处展现了多态性。变体可以通过常规的分子生物学技术产生。在此相对于同天然存在的基因相比的序列相似性或同一性来描述变体。本领域技术人员容易地理解如何确定两个多肽或核酸的序列相似性和同一性。例如，序列相似性可以在比对两个序列使得同一性处于最高水平之后计算。比对在一定程度上取决于比对程序中特定算法的使用。这可以包括，例如，SmithandWatermanAdv.App1.Math.2482(1981)的局部同源性算法，Needlemanandffunsch,J.MoLBiol.48443(1970)的同源性比对算法，PearsonandLipman,PNASUSA85:2444(1988)的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实现(WisconsinGenetics软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison，WI)，以及BLAST和BLAST2·O以及Altschuletal.，NucleicAcidsRes.253389-3402,1977；Altschul,etal.,J.Mol.Biol.215403-410,1990；Zuker,Μ.Science244:48_52，1989Jaegereta1.PNASUSA86:7706-7710，1989和Jaegeretal.MethodsEnzymol.183:281_306，1989所描述的算法。多重序列比对方法的新近的综述由Nuinetal.，BMCBioinformatics7:471，2006所提供。这些参考文献的每一个通过引用来合并，至少对于与序列相似性的比对和计算有关的材料。要理解的是，一般可以使用测定序列相似性或同一性的任何方法，在某些情况下，这些不同方法的结果可能是不同的。当以例如95%来提供序列相似性时，则这种相似性必需是用至少一种公认的计算方法可检测的。此处描述的免疫原性多肽可以包括一个或更多个氨基酸类似物或非天然存在的立体异构体。通过用所选氨基酸填充tRNA分子和工程化遗传构建体，所述工程化利用例如琥珀密码子将类似物氨基酸以位点特异性方式插入到肽链中，这些氨基酸类似物和立体异构体可以容易地掺入多肽链中(Thorsonetal.，MethodsinMolec.Biol.7743-73(1991),Zoller,CurrentOpinioninBiotechnology,3348-354(1992)；Ibba,Biotechnology&GeneticEngineeringReviews13:197_216(1995),Cahilletal.,TIBS,14(10)400-403(1989)；Benner,TIBTech,12158-163(1994)；IbbaandHennecke,Bio/technology,12=678-682(1994)所有这些通过引用合并在此，至少对于与氨基酸类似物相关的材料)。可以产生相似于肽、但是不是经由天然的肽键连接的免疫原性片段。例如，氨基酸或氨基酸类似物的连键可以包括CH2NH—、-CH2S-,-CH2-CH2-,-CH=CH—(顺式和反式)、--COCH2--、-CH(OH)CH2-和一CHH2S0—(这些和其他的可以在Spatola,A.F."Peptidebackbonemodifications:Astructure-activityanalysisofpeptidescontainingamidebondsurrogates,conformationalconstraints,andrelatedbackbonemodifications."InChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins,pp.267-357.ffeinstein,B.editor,MarcelDekker,NewYork,N.Y.(1983)；Morley,TrendsinPharm.Sci.1(2)463-468(1980)；Hudson,etal.，IntJP印tProtRes14177-185(1979)(-CH2NH-,CH2CH2-)；Spatolaetal.LifeSci381243-1249(1986)(—CHH2--S)；Hann,JournaloftheChemicalSocietyPerkinTransactioins1pp.307-314(1982)(—CH—CH—,cisandtrans)；Almquistetal.，J.Med.Chem.231392-1398(1980)(-COCH2-)Jennings-Whiteetal.,TetrahedronLett23:2533(1982)(--COCH2--)；EuropeanPublicationNo.EP0045665toSzelke,etal.(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladayetal.,Tetrahedron.Lett24:4401-3404(1983)(—C(OH)CH2-)；和HrubyLifeSci31189-199(1982)(-CH2-S-)中找至Ij；其每一个通过引用合并在此，至少对于关于连键的材料)。氨基酸类似物和立体异构体常常具有增强的或期望的性质，例如，更为经济的生产、更高的化学稳定性、增强的药理学性质(半衰期、吸收、效价、效力，等等)、改变的特异性(例如，生物学活性的广谱性)、和其他的。例如，D-氨基酸可以用于产生更稳定的肽，因为D-氨基酸不被天然存在的肽酶识别。用相同类型的D-氨基酸(例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)系统性的替换共有序列的一个或更多个氨基酸可以用于产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可以用于环化或连接两个或更多个肽在一起。这对于将肽限制成特定的构象是有益的。(RizoandGieraschAnn.Rev.Biochem.61:387(1992)，通过引用合并在此)·其他变体包括其中一个或更多个免疫靶向序列(即，GYGRKKRRQRRR(TAT;SEQIDNO.19),RQIKIffFQNRRMKffKK(AntP；SEQIDN0.20),SRRHHCRSKAKRSRHH(PER1-1；SEQIDNO.:21)，或GRRHHRRSKAKRSR(PER1-2;SEQIDNO.:22))连接到免疫原性PhtD多肽的那些。因而可以产生免疫原性融合蛋白并在实践本发明中利用。在一个实施方式中，提供了编码PhtD多肽如SEQIDNO:2、3、或4或其变体的任一个的核酸(即，SEQIDN0:5-10)。还提供的是这些序列的变体，包括其简并变体。在某些实施方式中，编码所述肽序列的核酸分子可以被插入表达载体中，如下文更详细地讨论的。在这样的实施方式中，肽序列由与所述氨基酸序列相应的核苷酸编码。编码各种氨基酸的核苷酸的特定组合是本领域公知的，如本领域技术人员所使用的各种参考文献中描述的(例如Lewin，B.GenesV,OxfordUniversityPress，1994)，如下文表2中显示的。核酸变体可以使用编码目标多肽的任何核苷酸组合。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>编码SEQIDNO:2、3、4、15、16和17的多肽(即，有和没有His标签)的示范性的核酸如下所示截短物1(没有His标签)ATGTGGGTGCCCGACAGCAGACCCGAGCAGCCCAGCCCCCAGAGCACCCCCGAGCCCAGCCCCAGCCCCCAGCCCGCCCCCAACCCCCAGCCCGCCCCCAGCAACCCCATCGACGAGAAGCTGGTGAAGGAGGCCGTGAGAAAGGTGGGCGACGGCTACGTGTTCGAGGAGAACGGCGTGAGCAGATACATCCCCGCCAAGGACCTGAGCGCCGAGACCGCCGCCGGCATCGACAGCAAGCTGGCCAAGCAGGAGAGCCTGAGCCACAAGCTGGGCGCCAAGAAGACCGACCTGCCCAGCAGCGACAGAGAGTTCTACAACAAGGCCTACGACCTGCTGGCCAGAATCCACCAGGACCTGCTGGACAACAAGGGCAGACAGGTGGACTTCGAGGCCCTGGACAACCTGCTGGAGAGACTGAAGGACGTGCCCAGCGACAAGGTGAAGCTGGTGGACGACATCCTGGCCTTCCTGGCCCCCATCAGACACCCCGAGAGACTGGGCAAGCCCAACGCCCAGATCACCTACACCGACGACGAGATCCAGGTGGCCAAGCTGGCCGGCAAGTACACCACCGAGGACGGCTACATCTTCGACCCCAGAGACATCACCAGCGACGAGGGCGACGCCTACGTGACCCCCCACATGACCCACAGCCACTGGATCAAGAAGGACAGCCTGAGCGAGGCCGAGAGAGCCGCCGCCCAGGCCTACGCCAAGGAGAAGGGCCTGACCCCCCCCAGCACCGACCACCAGGACAGCGGCAACACCGAGGCCAAGGGCGCCGAGGCCATCTACAACAGAGTGAAGGCCGCCAAGAAGGTGCCCCTGGACAGAATGCCCTACAACCTGCAGTACACCGTGGAGGTGAAGAACGGCAGCCTGATCATCCCCCACTACGACCACTACCACAACATCAAGTTCGAGTGGTTCGACGAGGGCCTGTACGAGGCCCCCAAGGGCTACACCCTGGAGGACCTGCTGGCCACCGTGAAGTACTACGTGGAGCACCCCAACGAGAGACCCCACAGCGACAACGGCTTCGGCAACGCCAGCGACCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNo5)截短物1(带His标签的)ATGGGCCACCACCACCACCACCACTGGGTGCCCGACAGCAGACCCGAGCAGCCCAGCCCCCAGAGCACCCCCGAGCCCAGCCCCAGCCCCCAGCCCGCCCCCAACCCCCAGCCCGCCCCCAGCAACCCCATCGACGAGAAGCTGGTGAAGGAGGCCGTGAGAAAGGTGGGCGACGGCTACGTGTTCGAGGAGAACGGCGTGAGCAGATACATCCCCGCCAAGGACCTGAGCGCCGAGACCGCCGCCGGCATCGACAGCAAGCTGGCCAAGCAGGAGAGCCTGAGCCACAAGCTGGGCGCCAAGAAGACCGACCTGCCCAGCAGCGACAGAGAGTTCTACAACAAGGCCTACGACCTGCTGGCCAGAATCCACCAGGACCTGCTGGACAACAAGGGCAGACAGGTGGACTTCGAGGCCCTGGACAACCTGCTGGAGAGACTGAAGGACGTGCCCAGCGACAAGGTGAAGCTGGTGGACGACATCCTGGCCTTCCTGGCCCCCATCAGACACCCCGAGAGACTGGGCAAGCCCAACGCCCAGATCACCTACACCGACGACGAGATCCAGGTGGCCAAGCTGGCCGGCAAGTACACCACCGAGGACGGCTACATCTTCGACCCCAGAGACATCACCAGCGACGAGGGCGACGCCTACGTGACCCCCCACATGACCCACAGCCACTGGATCAAGAAGGACAGCCTGAGCGAGGCCGAGAGAGCCGCCGCCCAGGCCTACGCCAAGGAGAAGGGCCTGACCCCCCCCAGCACCGACCACCAGGACAGCGGCAACACCGAGGCCAAGGGCGCCGAGGCCATCTACAACAGAGTGAAGGCCGCCAAGAAGGTGCCCCTGGACAGAATGCCCTACAACCTGCAGTACACCGTGGAGGTGAAGAACGGCAGCCTGATCATCCCCCACTACGACCACTACCACAACATCAAGTTCGAGTGGTTCGACGAGGGCCTGTACGAGGCCCCCAAGGGCTACACCCTGGAGGACCTGCTGGCCACCGTGAAGTACTACGTGGAGCACCCCAACGAGAGACCCCACAGCGACAACGGCTTCGGCAACGCCAGCGACCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNo6)截短物2(没有His标签)ATGGTGAAGTACTACGTGGAGCACCCCAACGAGAGACCCCACAGCGACAACGGCTTCGGCAACGCCAGCGACCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNo7)截短物2(带His标签的)ATGGGCCACCACCACCACCACCACGTGAAGTACTACGTGGAGCACCCCAACGAGAGACCCCACAGCGACAACGGCTTCGGCAACGCCAGCGACCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNO.8)截短物3(没有His标签)ATGCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNO.9)截短物3(带His标签的)ATGGGCCACCACCACCACCACCACCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNO.10)还提供的是分离的核酸，其在高度严格条件下与杂交探针的任何部分杂交，所述杂交探针相应于编码SEQIDNO:2、3、4、15、16和/或17的任一个、或相应于SEQIDN0:5-10的任一个的核苷酸序列。杂交核酸的杂交部分长度一般是至少15个(例如，15、20、25、30、40或更多个)核苷酸。杂交部分至少65%、80%、90%、95%或99%相同于它所杂交的序列的部分。杂交的核酸作为，例如克隆探针、引物(例如，PCR引物)或诊断探针是有用的。核酸双螺旋或杂合体稳定性被表示为熔解温度或Tm，其是探针从目标DNA解离的温度。这种熔解温度被用于确定需要的严格条件。如果鉴定的序列相关于或基本上相同于探针，而不是相同的，则有用的是首先建立最低温度，在该温度下在特定的盐浓度下(例如，使用各种浓度的SSC或SSPE缓冲液)仅发生同源的杂交。假定的错配引起Tm上1°C的降低，则在杂交反应中最终洗涤的温度相应地降低(例如，如果具有超过95%的同一性的序列是寻求的，最后的洗涤温度降低5°C)。实际上，Tm的改变可以在每错配0.5和1.5°C之间。高度严格条件包括在68°C下在5XSSC/5XDenhardt，s溶液/1.0%SDS下杂交，在室温下在0.2XSSC/0.1%SDS中洗涤。“中度严格条件”包括在3XSSC中在42V洗浲。盐浓度和温度可以改变来实现探针和目标核酸之间最佳的同一性水平。关于这种严格条件的其他指导在本领域是容易获得的，例如，在MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEditionbySambrooketal.,ColdSpringHarborPress,2001中。表达载体在实践本发明中也是适用的。表达载体一般包含与编码多肽的异源核酸序列(“编码序列”)可操作连接的侧翼序列。在其他实施方式中，或与这些实施方式组合地，侧翼序列优选的能够实现编码序列的复制、转录和/或翻译，并与编码序列可操作地连接。“可操作地连接的”表明核酸序列被配置以便进行它们通常的功能。举例来说，启动子可操作地连接到编码序列，此时启动子能够指导编码序列的转录。侧翼序列不必与编码序列是邻接的，只要它们正确地起作用。因而，例如，插入的非翻译但转录的序列可以位于启动子和编码序列之间，启动子仍被认为是与编码序列可操作地连接的。侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即，来自宿主细胞物种或菌株之外的物种)、杂合的(即，来自超过一个来源的侧翼序列的组合)或合成的。侧翼序列还可以是正常地起作用来调节宿主的基因组中编码多肽的核苷酸序列的表达的序列。在某些实施方式中，优选的是，侧翼序列是驱动目标细胞中高水平基因表达的转录调节区域。转录调节区域可以包含，例如，启动子、增强子、沉默子、抑制元件或其组合。转录调节区域可以是组成型的或组织_或细胞_类型特异性的(即，所述区域驱动在一种类型的组织或细胞中相比其他类型的组织或细胞更高水平的转录)。因而，转录调节区域的来源可以是任何原核或真核的生物体、任何脊椎动物或无脊椎动物生物体、或任何植物，只要所述侧翼序列在宿主细胞机制下有功能，或可以被宿主细胞机制活化。各种各样的转录调节区域可以在实践本发明中使用。适合的转录调节区域包括，尤其是，CMV启动子(S卩，CMV即时早期启动子)；来自真核基因的启动子(即，雌激素可诱导的鸡卵清蛋白基因、干扰素基因、葡糖_类皮质激素-可诱导的酪氨酸转氨酶基因和胸苷激酶基因)；主要早期和晚期腺病毒基因启动子；SV40早期启动子区域(BernoistandChambon,1981,Nature290304-10)；劳氏肉瘤病毒(RSV)的3，长末端重复(LTR)中含有的启动子(Yamamoto,etal.，1980，Cell22787-97)；单纯性疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子(Wagneretal.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.781444-45)；金属硫蛋白基因的调节序列(Brinsteretal.，1982，Nature29639-42)；或在原核表达载体中发现的调节序列中，例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroffetal.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.，75:3727_31)；tac启动子(DeBoeretal.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80:21_25)，或T7RNA聚合酶启动子中的那些，PBAD阿拉伯糖启动子或pTrc启动子。组织和/或细胞类型特异性转录控制区域包括，例如，在胰腺的腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区域(Swiftetal.,1984，Cell38:639_46；Ornitzetal.，1986，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50399-409(1986)；MacDonald,1987,Hepatology7:425-515)；胰腺的beta细胞中有活性的胰岛素基因控制区域(Hanahan，1985，Nature315:115_22)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区域(Grosschedletal.，1984，Cell38647-58；Adamesetal.，1985,Nature318533-38；Alexanderetal.，1987，Mol.Cell.Biol.，71436-44)；在睾丸、乳、淋巴样和肥大细胞中的小鼠乳瘤病毒控制区域(Lederetal.,1986,Cell45:485-95)；肝脏中的白蛋白基因控制区域(Pinkertetal.，1987，GenesandDevel.1268-76)；肝脏中的甲胎蛋白质基因控制区域(Krumlaufetal.,1985,Mol.Cell.Biol.,51639-48；Hammeretal.，1987，Science235:53-58)；肝脏中的α1-抗胰蛋白酶基因控制区域(Kelseyetal.，1987，GenesandDevel.1:161_71)；髓样细胞中的β-珠蛋白基因控制区域(Mogrametal.，1985，Nature315:338_40；Kolliasetal.，1986，Cell4689-94)；脑中少突胶质细胞中的髓磷脂碱性蛋白基因控制区域(Readheadetal.，1987，Cell48703-12)；骨骼肌中的肌球蛋白轻链_2基因控制区域(Sani，1985，Nature314283-86)；和下丘脑中的促性腺释放激素基因控制区域(Masonetal.，1986，Science2341372-78)，和黑素瘤细胞中的酪氨酸酶启动子(Hart,I.SeminOncol1996Feb；23(1)154-8；Siders,etal.CancerGeneTher1998S印-Oct;5(5):281_91)。其他适合的启动子是本领域已知的。编码目标免疫原的核酸分子可以作为病毒或非病毒载体的部分施用。在一个实施方式中，利用DNA载体向患者递送编码目标免疫原和/或相关分子(例如，共同刺激分子、细胞因子或趋化因子)的核酸。这样做时，可以利用各种策略来改善这些机制的效率，包括，例如，利用自我复制的病毒复制子(Caley，etal.1999.Vaccine,17=3124-2135；Dubensky,etal.2000.Mol.Med.6723-732；Leitner,etal.2000.CancerRes.6051-55)，密码子优化(Liu,etal.2000.Mol.Ther.，1:497_500；Dubensky,上文；Huang,etal.2001.J.Virol.75:4947_4951)，体内电穿孔(ffidera,etal.2000.J.Immunol.1644635-3640)，掺入编码共同刺激分子、细胞因子和/或趋化因子的核酸(Xiang，etal.1995.Immunity,2129-135；Kim,etal.1998.Eur.J.Immunol.,281089-1103；Iwasaki,etal.1997.J.Immunol.158:4591_3601；Sheerlinck,etal.2001.Vaccine,192647-2656)，刺激基序例如CpG的掺入(Gurunathan，上文；Leitner，上文)，用于胞吞的或泛素加工途径的靶向的序列(Thomson,etal.1998.J.Virol.72:2246_2252；Velders,etal.2001.J.Immunol.166:5366_5373)，初次免疫-强化方法(Gurunathan，上文；Sullivan,etal.2000.Nature,408605-609；Hanke,etal.1998.Vaccine,16439-445；Amara,etal.2001.Science,292:69_74)，蛋白酶敏感裂解位点，以及利用粘膜递送载体如沙门氏菌属(Salmonella)(Darji,etal.1997.Cell,91765-775；Woo，etal.2001.Vaccine,192945-2954)。其他方法是本领域已知的，其中一些描述如下。已经成功地用于将核酸导入宿主的各种病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒，等等。本领域理解的是，许多这样的病毒载体是本领域中可获得的。本发明的载体可以利用本领域技术人员广泛可用的标准重组技术来构建。这样的技术可以在常用的分子生物学参考文献中找到，例如MolecularCloning=ALaboratoryManual(Sambrook,etal.,1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress)，GeneExpressionTechnology(MethodsinEnzymology,Vol.185,editedbyD.Goeddel,1991.AcademicPress，SanDiego,CA)，禾口PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis，etal.1990.AcademicPress，SanDiego，CA)0优选的逆转录病毒载体是慢病毒的衍生物以及鼠或禽类逆转录病毒的衍生物。适合的逆转录病毒载体的实例包括，例如，Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳肿瘤病毒(MuMTV)、SIV、BIV、HIV和劳氏肉瘤病毒(RSV)。许多逆转录病毒载体可以掺入多个外源的核酸序列。由于重组的逆转录病毒是有缺陷的，它们需要帮助以产生传染性载体颗粒。这种帮助可以由，例如，编码逆转录病毒结构基因的辅助细胞系来提供。适合的辅助细胞系包括Ψ2、ΡΑ317和PA12，等等。使用这样的细胞系产生的载体病毒粒然后可以用于感染组织细胞系，例如NIH3Τ3细胞，来产生大量的嵌合逆转录病毒病毒粒。逆转录病毒载体可以通过传统方法(例如，注射)或通过“生产细胞系”靠近目标细胞群体的植入(Culver，K.，etal.，1994，Hum.GeneTher.,5(3):343_79；Culver,K.，etal.,ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.,59:685_90)；Oldfield,Ε.,1993,Hum.GeneTher.，4(1):39_69)来施用。所述生产细胞系被工程化来产生病毒载体并在目标细胞附近释放病毒颗粒。释放的病毒颗粒的一部分接触目标细胞并感染这些细胞，因而将本发明的核酸递送到目标细胞。在目标细胞的感染之后，发生载体的核酸的表达。腺病毒载体已经被证实对于向真核细胞的基因转移(Rosenfeld，Μ.，etal.，1991，Science,252(5004)431-3；Crystal,R.，etal.，1994，Nat.Genet.，8(1)42-51)，真核基因表达的研究(Levrero，Μ.，etal.，1991，Gene,101(2)195-202)，疫苗开发(Graham，F.andPrevec,L.，1992，Biotechnology,20:363_90)，和动物模型(Stratford-Perricaudet,L.,etal.,1992,BoneMarrowTransplant.,9(Suppl.1)151-2；Rich,D.，etal.，1993，Hum.GeneTher.，4(4)461-76)是特别有用的。在体内向不同的组织施用重组Ad的实验性的途径包括气管内滴注(Rosenfeld，Μ.，etal.，1992，Cell,68(1)143-55)注射到肌肉中(Quantin,B.，etal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,89(7):2581-3)，外周的静脉内注射(Herz,J.，andGerard,R.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,90(7):2812_6)以及向脑部的趋实体(stereotactic)接种(LeGalLaSalle,G.,etal.，1993，Science，259(5097):988_90)，等等。腺伴随病毒(AAV)展现了高水平的传染性、广泛的宿主范围和在整合到宿主细胞基因组方面的特异性(Hermonat,P.，etal.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,81(20)6466-70)。单纯疱疹病毒1型(HSV-I)是又一个吸引人的载体系统，特别是对于由于它的亲神经性质在神经系统中的使用(Geller，Α.，etal.，1991，TrendsNeurosci.，14(10)428-32；Glorioso,etal.，1995，Mol.Biotechnol.，4(1)87~99；Glorioso,etal.，1995，Annu.Rev.Microbiol.，49:675_710)。痘病毒是另一个有用的表达载体(Smith，etal.1983,Gene,25(1):21_8；Moss，etal,1992,Biotechnology,20:345_62；Moss,etal,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,15825-38；Moss，etal.1991.Science,2521662-1667)。被显示有用的痘病毒包括牛痘、NYVAC、禽痘病毒(avipox)、禽痘病毒(fowlpox)、金丝雀痘、ALVAC和ALVAC(2)，等等。通过删除编码已知或潜在的毒力因子的基因组的六个非关键区域，NYVAC(vP866)来自牛痘病毒的哥本哈根疫苗毒株(参见，例如，美国专利NO.5，364，773和5，494，807)。删除的基因座还作为用于外源基因的插入的接受者基因座被工程化。删除的区域是胸苷激酶基因(TKJ2R)vP410；出血性区域(U；B13R+B14R)vP553；A型包涵体区域(ATI；A26L)vP618；血球凝集素基因(HA;A56R)vP723；宿主范围基因区域(C7L-K1L)vP804；和，大亚基，核糖核苷酸还原酶(I4L)vP866。NYVAC是通过特异性删除编码与毒力和宿主范围相关的基因产物的十八个开放阅读框产生的遗传工程化的牛痘病毒毒株。NYVAC已经显示了对于表达TA是有用的(参见，例如，美国专利NO.6，265，189)。NYVAC(vP866)、vP994、vCP205、vCP1433、placZH6H4Lreverse、pMPC6H6K3E3和pC3H6FHVB也根据布达佩斯条约在ATCC保藏，登记号码分别是VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912和ATCC-97914。基于ALVAC的重组病毒(即，ALVAC-I和ALVAC-2)也适合于在本发明的实践中使用(参见，例如，美国专利NO.5，756，103)οALVAC(2)与ALVAC(I)相同，只是ALVAC(2)基因组包含处于牛痘启动子控制下的牛痘E3L和K3L基因(美国专利NO.6，130,066；Beattieetal.，1995a,1995b,1991；Changetal.，1992；Daviesetal.，1993)。ALVAC(1)^PALVAC(2)已经显示了在表达外源DNA序列，例如TA方面是有用的(Tartagliaetal.,1993a,b；美国专利NO.5，833，975)。ALVAC根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)，10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209，USA,ATCC登记号码VR-2547。另一个有用的痘病毒载体是TROVAC。TROVAC是指减毒的禽痘，其是来自许可用于1天龄小鸡的疫苗接种的禽痘病毒FP-I疫苗毒株的噬斑克隆的(plaque-cloned)分离物。TROVAC同样地根据布达佩斯条约在ATCC保藏，登记号码2553。“非病毒”质粒载体在某些实施方式中也是适合的。优选的质粒载体是与细菌、昆虫和/或哺乳动物宿主细胞相容的。这样的载体包括，例如，PCR-II,pCR3禾口pcDNA3.1(Invitrogen,SanDiego,CA)，pBSII(Stratagene，LaJolla,CA)、pET15(Novagen,Madison，WI)、pGEX(PharmaciaBiotech，Piscataway,NJ)、pEGFP-N2(ClontechiPaloAltoiCA)^pETL(BlueBacILInvitrogen)、pDSR_alpha(PCT公幵/S)号W090/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，GrandIsland,NY)以及Bluescript质粒衍生物(高拷贝数的基于COLEl的噬菌粒，StratageneCloningSystems,LaJolla，CA)，为克隆Taq扩增的PCR产物设计的PCR克隆质粒(例如，τοροTAcloningkit，PCR2.1,质粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)。细菌载体也可以用于当前的发明。这些载体包括，例如，志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、乳杆菌属(Lactobacillus)、卡介苗(Bacillecalmetteguerin)(BCG)和链球菌属(参见，例如，WO88/6626；WO90/0594；WO91/13157；WO92/1796和WO92/21376)。许多其他的非病毒质粒表达载体和系统是本领域已知，可以用于当前的发明。其他递送技术在实践本发明中也是合格的，包括，例如，DNA-配体复合物、腺病毒-配体-DNA复合物、DNA的直接注射、CaPO4沉淀、基因枪技术、电穿孔和胶态分散系统。胶态分散系统包括基于大分子复合物、纳米囊、微球体、珠子和脂质的系统，包括水包油乳化剂、微团、混合的微团和脂质体。本发明的优选的胶态系统是脂质体，其是作为体外和体内递送载体有用的人工的膜囊。RNA、DNA和完整的病毒粒可以包封在水性内部中，以生物学活性形式递送给细胞(Fraley，R.，etal.，1981，TrendsBiochem.Sci.，677)。脂质体的组成通常是磷脂、特别是高相转变温度的磷脂，通常与类固醇、特别是胆固醇的组合。也可以使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理性质取决于PH值、离子强度和二价阳离子的存在。在脂质体生产中有用的脂质的实例包括磷脂酰基化合物，例如，磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂类、脑苷脂类和神经节苷脂类。特别有用的是，二酰基磷脂酰甘油，其中脂质部分含有14-18个碳原子，特别是16-18个碳原子，并且是饱和的。例示性的磷脂包括蛋磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。还提供了包含载体的培养的细胞。培养的细胞可以是用载体转染的培养的细胞、或所述细胞的子代，其中所述细胞表达免疫原性多肽。适合的细胞系是技术人员已知的并且是商业上可获得的，例如，通过美国典型培养物保藏所(ATCC)。转染的细胞可以用于生产免疫原性多肽的方法中。所述方法包括在容许免疫原性多肽的表达的条件下、任选的在表达序列的控制下培养包含载体的细胞。免疫原性多肽可以使用标准的蛋白质纯化方法从细胞或培养基中分离。免疫原性多肽可以使用更大的多肽或蛋白质的标准酶裂解来制造，或通过蛋白质化学技术将两个或更多个肽或多肽连接在一起来产生。例如，肽或多肽可以使用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔-丁氧基羰基)化学作用的当前可用的实验室设备(AppliedBiosystems，Inc.,FosterCity,CA)来化学地合成。通过肽缩合反应、天然的化学物质连接、固相化学作用或酶连接，两个片段可以通过在它们的羧基和氨基末端的肽键共价连接在一起形成免疫原性PhtD多肽。(SyntheticPeptides=AUserGuide.，Grant,ed.,W.H.FreemanandCo.,NewYork,N.Y.(1992)；PrinciplesofPeptideSynthesis.,BodanskyandTrost,eds.Springer-VerlagInc.,NewYork,N.Y.(1993)；AbrahmsenLetal.，Biochemistry,30:4151(1991)；Dawsonetal.Science，266:776_779(1994);SolidPhasePeptideSynthesis,2ndEdition,Stewart,ed.，PierceChemicalCompany,Rockford,IL,(1984)，对于其中描述的方法，所有这些通过引用合并在此)。免疫原性多肽和包含一个或更多个多肽的组合物可以用来产生抗体。因而，在受试者中产生特异于PhtD的抗体的方法包括向所述受试者施用此处描述的免疫原性PhtD片段。在此还提供的是结合PhtD多肽的抗体(或其片段或衍生物)。抗体可以是多克隆或单克隆的，可以是完全人类的或人源化的，包括天然存在的抗体和单链抗体。抗体可以通过向受试者施用免疫原性PhtD多肽或其片段或衍生物来体内产生。体外抗体生产包括使用杂交瘤方法产生单克隆抗体。杂交瘤方法是本领域公知的，由KohlerandMilstein,Nature,256:495(1975)禾口HarlowandLane.Antibodies,ALaboratoryManual.ColdSpringHarborPublications,NewYork,(1988)描述，对于其中描述的方法，通过引用将它们完全地合并在此。生产单链抗体的方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，美国专利N0.5，359，046(对于这样的方法，通过完全引用合并在此)。单链抗体是通过利用短的肽接头将重链和轻链的可变域融合在一起，从而重建处于单个分子上的抗原结合位点来创造的。已经开发了其中一个可变域的C-末端通过15到25个氨基酸的肽或接头拴系到另一个可变域的N-末端的单链抗体可变片段(scFvs)，而不显著地破坏抗原结合或结合的特异性。选择接头以容许重链和轻链以它们适当的构象取向结合在一起。参见，例如，Huston，J.S.，etal.,MethodsinEnzym.203:46_121(1991)，对于有关接头的材料，通过引用将其合并在此。针对PhtD多肽的完全人类的和人源化抗体可以在此处描述的方法中使用。人源化的抗体包括人免疫球蛋白(接受者抗体)，在其中来自接受者的互补决定区(CDR)被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的、具有期望的特异性、亲合性和能力的CDR的残基替代。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替代。可以采用在免疫时能够产生人类抗体的完全集(即，完全人类抗体)的转基因动物(例如，小鼠)。在嵌合的和种系突变小鼠中对抗体重链连接区(J(H))基因的纯合删除导致了对内源性抗体生产的完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系突变小鼠中将导致在抗原攻击时产生人类抗体(参见，例如，Jakobovitsetal.,PNASUSA,90=2551-255(1993)；Jakobovitsetal.,Nature,362255~258(1993)；Bruggemannetal.,YearinImmuno.,7:33(1993))。人类抗体也可以在噬菌体展示文库中生产(Hoogenboometal.，J.Mol.Biol.，227:381(1991)；Marksetal.，J.Mol.Biol.，222:581(1991))。Cote等和Boerner等的技术也描述了制备人类单克隆抗体的方法(Cole，etal.,"TheEBV-hybridomatechniqueanditsapplicationtohumanlungcancer.，，In,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,Volume27,ReisfeldandSell,eds.,pp.77-96,AlanR.Liss,Inc.,NewYork,N.Y.,(1985)；Boerneretal.,J.Immunol.,147(1):86_95(1991))。对于其中描述的方法，这些参考文献通过引用将它们完全地合并在此。在此使用的抗体片段包括F(ab')2、Fab'和Fab片段，包括杂交片段。抗体的这些片段保持了结合特异性PhtD多肽的能力。一些方法可以用于构建(ab)表达文库(参见，例如Huse，etal.，1989Science246:1275_1281)来容许具有对PhtD多肽的期望特异性的单克隆F(ab)片段的快速和有效的鉴定。含有对多肽的独特型的抗体片段可以通过本领域已知的技术来产生，包括但不限于(i)通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab')2片段；(ii)通过还原F(ab')2片段的二硫键产生的Fab片段；(iii)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的F(ab)片段，和(iv)F(v)片段。在此描述了包含PhtD的免疫原性多肽和药学上可接受的载体的组合物。任选地，所述组合物进一步包含佐剂。包含免疫原性多肽的组合物可以含有其他免疫原性多肽的组合，包括，例如，免疫原性的链球菌属多肽，或PspA、NanA、PsaA、肺炎球菌溶血素、PspC的免疫原性片段，或其任何组合。任选地，此处描述的组合物适合于向粘膜表面施用。例如，组合物可以是鼻喷雾齐U、喷雾器溶液、气雾剂吸入物。因而，所述组合物可以存在于容器中，所述容器可以是鼻部喷雾器(sprayer)、喷雾器(nebulizer)或吸入器。药学上可接受的载体表示不是生物学上或其它方面不希望的材料，即，所述材料可以与PhtD的免疫原性片段一起施用给受试者，而不引起任何不希望的生物学作用，或以有害的方式与含有它的药物组合物中的任何其他成分相互作用。载体将自然地选择，来最小化活性成分的任何降解，或最小化受试者中的任何不良副作用，这对于本领域技术人员是公知的。在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,21stEdition，DavidB.Troy,ed.，LippicottWilliams&Wilkins(2005)中描述了适合的载体和它们的制剂。一般地，合适数量的药学上可接受的盐在制剂中使用来使得制剂是等渗的。药学上可接受的载体的实例包括，但不限于，无菌水、盐水、缓冲溶液如Ringer's溶液和葡萄糖溶液。溶液的PH值一般从约5到约8，或从约7到约7.5。其他载体包括持续释放制品，例如，含有免疫原性PhtD多肽的固体疏水性聚合物的半透性的基质。基质是处于有形物体的形式，例如，膜、脂质体或微粒。对本领域技术人员显而易见的是，取决于例如给药途径和施用的组合物的浓度，某些载体可能是更优选的。载体是适合于向人类或其他受试者施用PhtD免疫原性片段的那些。药物组合物除了所述免疫原性多肽之外可以包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、佐剂、免疫刺激剂。药物组合物还可以包括一种或更多种活性成分，例如，抗微生物剂、抗炎试剂和麻醉剂。还可以包括佐剂来刺激或增强对PhtD的免疫反应。佐剂的适合的类别的非限制性实例包括凝胶型的那些(即，氢氧化铝/磷酸盐(“白矾佐齐U”)、磷酸钙、微生物来源的(胞壁酰二肽(MDP))、细菌外毒素(霍乱毒素(CT)、天然霍乱毒素B亚基(CTB)、大肠杆菌不稳定毒素(LT)、白喉毒素(PT)、CpG寡核苷酸、BCG序列、破伤风类毒素、例如，大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌(salmonellamirmesota)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)或Shigellaexseri的单磷酰脂质A(MPL))、颗粒佐剂(生物可降解的，聚合物微球体)、免疫刺激性复合物(ISCOMs))、油-乳剂和基于表面活性剂的佐剂(Freund's不完全佐剂(FIA)、微流化乳剂(MF59，SAF)、皂角苷(QS-21))、合成的(胞壁酰肽衍生物(莫拉丁酯，苏氨酰(thre0ny)-MDP)、非离子嵌段共聚物(L121)、聚磷腈(PCCP)、合成的多核苷酸(polyA:U，polyI:C)、沙利度胺衍生物(CC-4407/ACTIMID))、RH3-配体或聚交酯乙交酯(PLGA)微球体，等等。任何这些毒素的片段、同源物、衍生物和融合物也是适合的，条件是它们保持了佐剂活性。例如在WO95/17211(Arg-7-LysCT突变体)、WO96/6627(Arg-192-GlyLT突变体)和WO95/34323(Arg-9-Lys和Glu_129_GlyPT突变体)中描述了佐剂的适合的突变体或变体。可以在本发明的方法和组合物中使用的另外的LT突变体包括，例如，Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-IIO-Asp和Glu-112-Asp突变体。金属盐佐剂例如白矾佐剂是本领域公知的，提供了具有佐剂活性的安全的赋形齐U。这些佐剂的作用机制被认为包括抗原贮藏库的形成，从而抗原可以保持在注射的位置直到施用后3周，以及更容易被抗原递呈细胞吸收的抗原/金属盐复合物的形成。除了铝之夕卜，其他金属盐类已经用于吸附抗原，包括锌、钙、铈、铬、铁和铍的盐。铝的氢氧化物和磷酸盐是最常见的。含有铝盐、抗原和另外的免疫刺激剂的制剂或组合物是本领域已知的。免疫刺激剂的实例有3-去-0-酰化的单磷酰脂质A(3D-MPL)。一种或更多种细胞因子也可能是本发明的实践中适合的共同刺激成分，作为本发明的组合物中含有的多肽、或为本发明组合物中含有的核酸所编码(Parmiani，etal.ImmunolLett2000Sep15；74(1)41-3；Berzofsky,etal.NatureImmunol.1209-219)。适合的细胞因子包括，例如，白细胞介素_2(IL-2)(Rosenberg，etal.NatureMed.4:32卜327(1998))、IL-4、IL-7、IL-12(Pardoll，1992；Harries,etal.J.GeneMed.2000Jul-Aug；2(4)243-9；Rao,etal.J.Immunol.156:3357_3365(1996)综述)、IL-15(Xin,etal.Vaccine,17:858_866，1999)、IL-16(Cruikshank,etal.J.LeukBiol.67(6):757-66，2000)、IL-18(J.CancerRes.Clin.Oncol.2001.127(12):718_726)、GM-CSF(CSF(Disis,etal.Blood，88:202_210(1996))、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或干扰素-Y(INF-Y)0其他的细胞因子也可能适合于实践本发明，这是本领域已知的。趋化因子还可以用于帮助免疫反应的诱导或增强。例如，包含融合到肿瘤自体抗原的CXCLlO(IP-IO)和CCL7(MCP-3)的融合蛋白已经显示了诱导抗肿瘤免疫(Biragyn，etal.NatureBiotech.1999，17:253_258)。趋化因子CCL3(ΜΙΡ-1α)和CCL5(RANTES)(Boyer,etal.Vaccine,1999,17(Supp.2):S53_S64)在实践本发明中也可能是有用的。其他适合的趋化因子是本领域已知的。在某些实施方式中，目标免疫原可以作为核酸分子来使用，单独的或作为递送载体例如病毒载体的部分。在这些情况下，可能有益的是在本发明的组合物中组合目标免疫原和一种或更多种共同刺激成分，例如细胞表面蛋白、细胞因子或趋化因子。例如，共同刺激成分可以作为多肽或作为编码多肽的核酸来包括在组合物中。适合的共同刺激分子包括，例如，结合CD28家族的成员(即CD28，ICOS；Hutloff,etal.Nature1999，397263-265；Peach,etal.JExpMed1994，180:2049_2058)的多肽，例如CD28结合^ΙB7.1(CD80；Schwartz,1992；Chenetal,1992；Ellis,etal.J.Immunol.,156(8)2700-9)和B7.2(CD86；Ellis,etal.J.Immunol.,156(8):2700_9)；结合整联蛋白家族的成员(即，LFA-I(CDlla/CD18)；Sedwick,etal.JImmunoll999,1621367-1375；ffulfing,etal.Science1998,282-.2266-2269；Lub,etal.ImmunolToday1995，16:479_483)，包括ICAM家族的成员(S卩，ICAM-I,-2或-3)，的多肽；结合⑶2家族成员(S卩，⑶2，信号传导淋巴细胞活化分子(CDw150或“51^^，，汸￥6『83，6{al.JImmunol1997，158:4036_4044)的多肽，例如CD58(LFA-3；CD2配体；Davis，etal.ImmunolToday1996，17177-187)或SLAM配体(Sayos，etal.Nature1998,395:462-469)；结合热稳定抗原(HSA或CD24；Zhou,etal.EurJImmunol1997,27:2524-2528)的多肽；结合TNF受体(TNFR)家族的成员(即，4_1BB(CD137；Vinay,etal.SeminImmunol1998，10:481_489)，0X40(CD134；Weinberg,etal.SeminImmunol1998,10:471_480；Higgins,etal.JImmunol1999,162486-493)，和CD27(Lens,etal.SeminImmunol1998，10:491_499))的多肽，例如4-lBBL(4-lBB配#；Vinay,etal.SeminImmunol1998,10481-48；DeBenedette,etal.JImmunol1997,158:551_559)，TNFR相关因子_1(TRAF-1；4-1BB配体；Saoulli,etal.JExpMed1998,1871849-1862,Arch,etal.MolCellBiol1998,18:558-565)、TRAF-2(4-lBB和0X40配体；Saoulli，etal.JExpMed1998,187:1849-1862；Oshima,etal.IntImmunol1998，10:517_526，Kawamata，etal.JBiolChem1998,273:5808-5814)、TRAF-3(4-1BB禾口0X40配体；Arch,etal.MolCellBiol1998，18:558_565Jang,etal.BiochemBiophysResCommun1998,242613-620；KawamataS,etal.JBiolChem1998，273:5808-5814)、0X40L(0X40配体；Gramaglia，etal.JImmunol1998,1616510-6517)、TRAF-5(0X40配体；Arch，etal.MolCellBiol1998,18558-565；Kawamata,etal.JBiolChem1998，273:5808_5814)和CD70(CD27配体；Couderc，etal.CancerGeneTher.,5(3):163_75)。CD154(CD40配体或“CD40L”;Gurunathan，etal.J.Immunol.,1998,1614563-4571；Sine,etal.Hum.GeneTher.,2001,121091-1102)也是适合的。除了共同刺激分子本身以外的刺激基序可以掺入到编码TA的核酸中，例如CpG基序(Gurunathan,etal.Ann.Rev.Immunol.，2000，18:927_974)。这些试剂和方法、以及本领域技术人员公知的其他的，可以在本发明的实践中使用。本发明的基本上无毒的、生物学活性的佐剂的其他实例包括激素、酶、生长因子或其生物学活性部分。这样的激素、酶、生长因子或其生物学活性部分可以是人类、牛、猪、羊、犬、猫、马或禽类来源的，例如，可以是肿瘤坏死因子(TNF)、催乳素、表皮生长因子(EGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、胰岛素样生长因子(IGF-I)、促生长素(somatotropin)(生长激素(growthfactor))或胰岛素，或其受体在免疫系统的细胞上表达的任何其他激素或生长因子。提供的是生产和使用此处描述的免疫原性多肽的方法，和在这些方法中有用的组合物。多肽可以使用标准的分子生物学技术和表达系统来产生。(参见，例如，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEditionbySambrooketal.，ColdSpringHarborPress,2001)0例如，编码免疫原性多肽的基因的片段可以被分离，编码免疫原性多肽的多核苷酸可以克隆到任何商业上可获得的表达载体(例如，PBR322和pUC载体(NewEnglandBiolabs，Inc.，Ipswich,MA))或表达/纯化载体(例如，GST融合物载体(Pfizer，Inc.，Piscataway,N.J.))中，然后在适合的原核、病毒或真核宿主中表达。然后，通过常规方法，或对于商售的表达/纯化系统来说根据厂家的说明书，可以实现纯化。提供了检测PhtD表达来区分肺炎球菌肺炎与其他形式的肺炎的方法。世界上肺炎球菌的主要储存地在于人类鼻部携带(nasalcarriage)。感染的获得一般是来自携带者，感染之前总是鼻部携带。鼻咽部的定殖被认为是肺炎球菌传播到下呼吸道、鼻窦和中耳的先决条件。为了测定肺炎球菌的疫苗的效力，必须的是知道哪些受试者带有肺炎球菌肺炎，哪些没有。诊断肺炎的标准方法是通过X射线或其他诊断，以及肺炎链球菌的阳性血液培养物。满足这些指标的受试者被认为患有肺炎球菌肺炎。令人遗憾的是，这种方法错过了患有肺炎球菌肺炎的百分之75到85的患者，因为估计仅15-25%的肺炎患者也具有菌血症(Fedson，etal.，Vaccine17:Suppl.1:S11_18(1999)；OstergaardandAndersen，Chest1041400-1407(1993))。解决这个问题的一种方法是使用抗原检测分析，其检测尿液中的细胞壁多糖。该分析是更为敏感的，但是令人遗憾的是在12%的成年人和高达60%的儿童中具有假阳性。这是因为，由于患者中肺炎球菌的鼻部定殖而在他们的肺或血液中没有肺炎球菌的疾病，分析目标有时存在于尿液中。因而，在此还提供的是检测受试者中的肺炎球菌肺炎的方法，包括在来自受试者的样品中检测PhtD的存在，其中PhtD的存在表明受试者中的肺炎球菌细菌。可以通过本领域技术人员已知的方法分析生物样品例如体液中的PhtD浓度。在所述方法中使用的适合的体液包括但不限于血液、血清、粘液和尿液。还在此描述的是在受试者中降低肺炎球菌感染的风险的方法，包括向所述受试者施用PhtD的免疫原性片段，或其衍生物或变体。肺炎球菌感染包括，例如，脑膜炎、中耳炎、肺炎、败血症或溶血性尿毒症。因而，这些感染的任何一种或更多种的风险可以通过此处描述的方法来降低。包含PhtD多肽的组合物可以口服地、胃肠外地(例如，静脉内地)、肌内地、腹膜内地、经皮地或局部地施用，包括鼻内施用或施用到呼吸系统的任何部分。如在此使用的，向呼吸系统施用意味着通过一个或两个鼻孔或通过口腔向鼻子和鼻道递送所述组合物，包括通过喷雾机制或液滴机制、通过气雾化或插管法的递送。所需的组合物和PhtD多肽的确切数量是受试者和受试者之间不同的，取决于受试者的物种、年龄、体重和一般状况，使用的肽、和其施用的方式。因而，对每种组合物不可能指定确切的数量。然而，合适的数量可以由本领域普通技术人员根据此处的描述来确定。此外，可以使用多剂量的PhtD多肽，例如，在初次免疫和强化方案中。术语“单种抗体(antibody)”或“复数种抗体(antibodies)”包括处于未纯化的或部分纯化的形式(即，杂交瘤上清液、腹腔积液、多克隆抗血清)或处于纯化形式的完整的或片段的抗体。“纯化的”抗体是从起初与之一起存在的至少约50%的蛋白质中分离出的抗体(即，作为杂交瘤上清液或腹腔积液制品的部分)。优选的，纯化的抗体是从起初与之一起存在的至少约60%、75%、90%或95%的蛋白质中分离的。适合的衍生物可以包括片段(即，Fab、Fab2或单链抗体(例如，Fv))，这是本领域已知的。抗体可以是任何适合的来源或形式，包括，例如，鼠(即，通过鼠杂交瘤细胞产生的)，或表达为人源化抗体、嵌合抗体、人类抗体，等等。制备和利用各种形式的抗体的方法是本领域技术人员公知的，在实践本发明中将是合适的(参见，例如，Harlow,etal.AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988；Harlow,etal.UsingAntibodies:ALaboratoryManual,PortableProtocolNo.1,1998；KohlerandMilstein,Nature,256495(1975)Jonesetal.Nature，321:522-525(1986)；Riechmannetal.Nature,332323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2593-596(1992)；Verhoeyenetal.,Science,2391534-1536(1988)；Hoogenboometal.,J.Mol.Biol.,227381(1991)；Marksetal.,J.Mol.Biol.,222581(1991)；Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985)；Boerneretal.,J.Immunol.,147(1):86_95(1991)；Marksetal.,Bio/Technology10，779-783(1992)；Lonbergetal.,Nature368856-859(1994);Morrison,Nature368812-13(1994)；Fishwildetal.，NatureBiotechnology14,845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology14,826(1996)；LonbergandHuszar,Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；以及美国专利Nos.4，816，567;5，545，807；5，545，806；5，569，825；5，625，126；5，633，425；和5，661，016)。在某些应用中，抗体可以包含在杂交瘤上清液或腹腔积液中，并这样直接地或在使用标准技术浓缩之后使用。在其他应用中，抗体可以使用例如盐分级分离和离子交换层析、或利用与固相支持物例如琼脂糖珠子共价连接的蛋白A、蛋白质G、蛋白A/G和/或蛋白L配体的亲和层析，或这些技术的组合来进一步纯化。抗体可以以任何适合的形式保存，包括，作为冷冻制品(即，-20°C或-70°C)、冻干的形式、或处于正常的冷藏条件下(即，4°C)。当以液体形式保存时，优选的是使用适合的缓冲液，例如Tris-缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。示范性的抗体包括单克隆抗体IB12，由根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定、保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manassas,VA20110-2209，U.S.Α.的、给予的专利保藏名称XXXXX的小鼠杂交瘤XXXXX产生；单克隆抗体4D5，由根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定、保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manassas,VA20110-2209，U.S.Α.的、给予的专利保藏名称XXXXX的小鼠杂交瘤XXXXX产生；和单克隆抗体9Ε11，由根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定、保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manassas,VA20110-2209,U.S.Α.的、给予的专利保藏名称χχχχχ的小鼠杂交瘤XXXXX产生。其他抗体，例如，包括含有这样的抗体的腹腔积液、多克隆抗血清或其他制品也是期待的。包括这样的抗体的制品可以包括在杂交瘤上清液或腹腔积液制品、部分地纯化的制品或纯化的制品中存在的未纯化的抗体。因而，在此提供的是含有纯化到约50%、60%、75%、90%或95%纯度的抗体的抗体制品。一般地，这样的制品包括缓冲剂，例如磷酸盐或Tris-缓冲盐水(分别，PBS或TBS)。还提供的是这样的抗体的衍生物，包括片段(Fab、Fab2或单链抗体(例如，Fv))、人源化抗体、嵌合抗体、人类抗体，等等。编码抗体的可变和高变片段的基因也可以从表达该抗体的杂交瘤中分离，克隆到表达载体来产生某些抗体制品(即，人源化抗体)。生产这样的制品的方法是本领域公知的。熟练的技术人员拥有使用此处描述的抗体的许多适合的技术来鉴定含有抗体结合的蛋白质的生物样品。例如，使用例如免疫沉淀或其他捕获型的分析，可以利用抗体来分离PhtD蛋白。这种公知的技术通过将抗体附着到固相支持物或层析材料(即，包被有蛋白A、蛋白G和/或蛋白L的珠子)上来进行。结合的抗体然后导入含有或被认为含有PhtD蛋白质的溶液中。PhtD蛋白质然后结合于抗体，未结合的材料在一定条件下洗去，在所述条件中PhtD蛋白质保持与抗体结合。结合蛋白质然后可以从抗体中分离，按照需要来分析。利用抗体分离蛋白质的类似的方法是本领域公知的。还可以利用抗体来检测生物样品内的PhtD蛋白质。例如，可以在如流式细胞计分析、ELISA、免疫印迹(S卩，Western印迹)、原位检测、免疫细胞化学和/或免疫组织化学的分析中使用抗体。进行这些分析的方法是本领域公知的。为了帮助熟练的技术人员使用所述抗体，它们可以以试剂盒形式来提供。提供了包括1B12、4D5和/或9E11，任选地包括使用所述抗体来检测表达PhtD的细胞所需的其他成分的试剂盒。试剂盒的抗体可以以任何适合的形式提供，包括冷冻、冻干，或在药学上可接受的缓冲剂例如TBS或PBS中。试剂盒还可以包括在体外或体内利用所述抗体所需的其他试剂，例如缓冲剂(即，TBS、PBS)、封闭试剂(包括脱脂奶粉、正常血清、Tween-20洗涤齐U、BSA或酪蛋白的溶液)和/或检测试剂(即，山羊抗小鼠IgG生物素、链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物、别藻蓝蛋白、B-藻红素、R-藻红素、过氧化物酶、荧光剂(即，DyLight、Cy3、Cy5、FITC、HiLyteFluor555、HiLyteFluor647)和/或染色试剂盒(即，ABCStainingKit，PierCe))。试剂盒还可以包括其他试剂和/或在如上所述通常利用的分析中使用所述抗体的说明书，所述分析例如，流式细胞术分析、ELISA、免疫印迹(即，Western印迹)、原位检测、免疫细胞化学、免疫组织化学。在一个实施方式中，所述试剂盒提供了纯化形式的抗体。在另一个实施方式中，抗体以生物素化的形式单独地、或与抗生物素蛋白-缀合的检测试剂(即，抗体)一起地提供。在另一个实施方式中，所述试剂盒包括荧光标记的抗体，其可以用于直接检测PhtD蛋白质。使用任何这些系统所需的缓冲剂等等是本领域公知的，可以由最终用户制备或作为试剂盒的部分来提供。所述试剂盒还可以包括含有阳性_和阴性_对照蛋白质和/或组织样品的固相支持物。例如，用于进行斑点或Western印迹型分析的试剂盒可以包括对照细胞或组织溶胞产物，用于含有预先固定的对照样品、含有实验样品的另外的空间的SDS-PAGE或尼龙或其他膜中。用于在载玻片上的细胞中PhtD的可视化的试剂盒可以包括含有对照细胞或组织样品、具有实验样品的另外的空间的预制的载玻片。抗体和/或其衍生物还可以掺入本发明的组合物中，用于体内或体外使用。抗体或其衍生物还可以缀合到功能性部分，例如细胞毒素药物或毒素，或其活性片段，例如白喉毒素A链、外毒素A链、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素、伊诺霉素等等。功能性部分还可以包括放射化学物质。还可能的是使用此处描述的抗体作为药物筛选分析中的试剂。例如，所述试剂可以用于确定药物候选物对患者的生物样品中链球菌属细菌的存在的影响。表达型分析技术可以与高通量筛选技术组合来容许有用的化合物的快速鉴定和监视药物候选物的治疗有效性(参见，例如，Zlokarnik,etal.，Science279,84-8(1998))。药物候选物可以是化合物、核酸、蛋白质、抗体或其衍生物，无论是天然存在的还是合成衍生的。由此鉴定的药物候选物可以用作药物组合物用于向患者施用或用于进一步的筛选分析，等等。此处描述的抗体可以制备为可注射的制品，例如，在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的悬浮液中。可以利用的适合的载体和溶剂包括水、Ringer's溶液，和等渗氯化钠溶液、TBS和PBS，等等。在某些应用中，所述抗体适合于体外使用。在其他应用中，所述抗体适合于体内使用。在两种情况都适用的制品是本领域公知的，将取决于特定的应用而变化。要注意的是，如在本说明书和附随的权利要求中使用的，单数形式一(“a”、“an”)和该(“the”)包括复数的对象，除非上下文明显地相反指示。因而，例如，提及抗原性片段包括抗原性片段的混合物，提及药物载体或佐剂包括两种或更多种这样的载体或佐剂的混合物。如在此使用的，受试者或宿主是指个体。所述受试者可以包括驯养的动物，例如，猫和狗，家畜(例如，牛、马、猪、绵羊和山羊)、实验动物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠)和鸟类。在一个方面，所述受试者是哺乳动物，例如灵长类或人类。任选的或任选地是指随后描述的事件或状况可以或可以不发生，该描述包括了当事件或状况发生的情况和它不发生的情况。例如，用语任选地所述组合物可以包含组合，意思是该组合物可以包含不同分子的组合，或可以不包括组合，从而该描述包括了组合和不存在组合(即，组合的各个成员)两者。范围可以在此表示为从约一个特定值，和/或到约另一个特定值。当表述这样的范围时，另一个方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当值通过使用前面的约表示为近似值时，要理解的是该特定值形成了另一个方面。要进一步理解的是，每个范围的终点在与另一个终点相关，和独立于另一个终点时都是重要的(significant)。当术语预防在此与给定的治疗一起使用用于给定的状况(例如，预防链球菌属的感染)，这意味着表示治疗的患者完全不发生临床上可见水平的状况，或比他/她没有治疗时更缓慢地发生、和/或在更低的程度上发生。无论如何，这些术语不仅仅限于患者没有经历状况的方面的情况。例如，如果治疗在患者对刺激的暴露期间给予，所述刺激预计将产生所述状况的给定的显现，导致患者经历与否则预期的相比更少的或更轻微的症状，治疗被称为已经预防所述状况。通过使患者仅展示感染的轻微表现的症状，治疗可以“预防”感染；这不意味着必需没有任何细胞被感染微生物穿透。类似地，在此使用的降低与给定治疗和感染风险一起使用(例如，降低肺炎球菌感染的风险)是指，与不存在治疗(例如，施用免疫原性多肽)时发生感染的对照或基础水平相比，受试者发生更慢的或更低程度的感染。感染风险的降低可以导致患者仅显示感染的轻微表现的症状或延迟的感染症状；这不意味着必需没有任何细胞被感染微生物穿透。本发明的进一步的实施方式和特征在以下非限制性实例中提供。实施例上述公开一般地描述了本发明。参考以下具体实施例可以获得更完整的理解。仅仅为了例示的目的而不是限制本发明的范围而描述这些实施例。形式上的改变和等效物的替换是预期的，因为环境可以暗示或导致适宜。虽然在此已经采用了特定的术语，这种术语意图是描述性的意义，而不是为了限制的目的。在本发明的一个实施方式中，在此提供的是分离的截短的PhtD多肽，来自1997年6月27日作为ATCC55987保藏的肺炎链球菌血清型6菌株14453，和/或具有SEQIDNO1所列的序列。在本发明中描述的PhtD截短物涵盖类似于或不类似于PhtB中的区域的蛋白质的区域，因而分别含有潜在的交叉反应性和独特的表位。截短的蛋白质在大肠杆菌中作为重组的带His标签的衍生物表达以便于纯化，随后使用Ni2+-NTA亲和层析来纯化。实施例1重组PhtD截短的蛋白质的克隆和生产该实施例描述了phtD的截短的版本从肺炎链球菌血清型6菌株14453克隆到质粒pET28a(+)中，从而表达产物具有N-末端6XHis标签。PhtD的截短的形式也可以如SEQIDNO:2、3和4(蛋白质)以及SEQIDNO:5、7和9(DNA)中说明的没有N-末端6XHis标签地表达。在扩增此处描述的序列中使用的引物在表3中示出^t3PCR引物引物名称/编号序列5’一3’，限制性位点是下划线的Spn0215CTAGCCATGGGACATCATCATCATCATCACTGGGTACCAGATTCAAGACCAG(SEQIDNO.11)Spn0216CTAGCCATGGGACATCATCATCATCATCACGTCAAGTACTATGTCGAACATCC(SEQIDNO.12)Spn0217CTAGCCATGGGACATCATCATCATCATCACCATGTTCGTAAAAATAAGGTAGAC(SEQIDNO.13)SpnO176TGGCCTCGAGTTACTACTGTATAGGAGCCGGTT(SEQIDNO.14)截短物#1简短而言，使用HighFidelityAdvantage2聚合酶(BD)从肺炎链球菌血清型6菌株14453基因组PCR扩增phtDTl基因。PCR引物Spn0215和SpnO176分别将NcoI禾口XhoI限制性位点导入5’和3’末端(参见表3)。5’引物Spn0215还导入N-末端His标签。PCR产物使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，随后在琼脂糖凝胶上跑动用于利用QIAEX凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。PCR产物和pET28a(+)载体(Novagen)都用NcoI和XhoI消化，随后利用QIAEX凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化。消化的载体和基因然后使用T4DNA连接酶(Invitrogen)连接在一起。连接混合物转化到化学感受态的大肠杆菌DH5α中，通过在含有50μg/ml卡那霉素的Luria琼脂上平铺来选择阳性克隆。每个构建体选择四个集落，使用QIApr印SpinMinipr印试剂盒(Qiagen)分离质粒DNA。进行Ncol/Xhol消化来确定哪些克隆具有正确大小的片段。根据限制性分析，所有四个克隆是正确的，然后使用QIAfilterPlasmidMidi试剂盒(Qiagen)从一个阳性克隆(#1)分离Midipr印DNA，DNA测序来确保没有引入克隆假象。这个克隆称为pBAC30。PhtDTl以高水平在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，如在SDS-PAGE凝胶中大约56.IkDa的正确大小的强烈条带所看出的。蛋白质表达用ImMIPTG诱导2小时。截短物#2还使用HighFidelityAdvantage2聚合酶(BD)从肺炎链球菌血清型6菌株14453基因组PCR扩增phtDT2基因。PCR引物Spn0216和SpnO176分别将NcoI和XhoI限制性位点导入5’和3’末端(参见表3)。5’引物Spn0216还导入N-末端His标签。PCR产物使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，随后在琼脂糖凝胶上跑动用于利用QIAEX凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。PCR产物和pET28a(+)载体(Novagen)都用NcoI和XhoI消化，随后利用QIAEX凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化。消化的载体和基因然后使用T4DNA连接酶(Invitrogen)连接在一起。连接混合物转化到化学感受态的大肠杆菌DH5ci中，通过在含有50μg/ml卡那霉素的Luria琼脂上平铺来选择阳性克隆。使用QIApr印SpinMinipr印试剂盒(Qiagen)从选定的克隆分离质粒DNA。进行Ncol/Xhol消化来确定哪些克隆具有正确大小的片段。然后使用QIAfilterPlasmidMidi试剂盒(Qiagen)从一个阳性克隆分离MidiprepDNA，测序来确保没有引入克隆假象。这个克隆称为PBAC31。PhtDT2蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)中以高水平表达，如在SDS-PAGE凝胶中大约19.3kDa的强烈条带所看出的。蛋白质表达用ImMIPTG诱导2小时。截短物#3还使用HighFidelityAdvantage2聚合酶(BD)从肺炎链球菌血清型6菌株14453基因组PCR扩增phtDT3基因。Spn0217和Spn0176分别将NcoI和XhoI限制性位点导入5'和3'末端(参见表3)。5’引物Spn0217还导入N-末端6XHis标签。PCR产物使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，随后在琼脂糖凝胶上跑动用于利用QIAEX凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。PCR产物和pET28a(+)载体(Novagen)都用NcoI和XhoI消化，随后利用QIAEX凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化。消化的载体和基因然后使用T4DNA连接酶(Invitrogen)连接在一起。连接混合物转化到化学感受态的大肠杆菌DH5ci中，通过在含有50yg/ml卡那霉素的Luria琼脂上平铺来选择阳性克隆。选择菌落，使用QIApr印SpinMinipr印试剂盒(Qiagen)分离质粒DNA。进行Ncol/Xhol消化来测定哪些克隆具有正确大小的片段。然后使用QIAfilterPlasmidMidi试剂盒(Qiagen)从一个阳性克隆分离Midipr印DNA，测序来确保没有引入克隆假象。这个克隆称为pBAC32。PhtDT3蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)中以高水平表达，如在SDS-PAGE凝胶中大约16.7kDa的强烈条带所看出的。蛋白质表达用ImMIPTG诱导2小时。截短的多肽的氨基酸序列显示如下从DBAC30表汰的包括His标签(下划线的)的PhtD截短物1MGHHHHHHWVPDSRPEQPSPQSTPEPSPSPQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAVRKV⑶GYVFEENGVSRYIPAKDLSAETAAGIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYDLLARIHQDLLDNKGRQVDFEALDNLLERLKDVPSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITYTDDEIQVAKLAGKYTTEDGYIFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKEKGLTPPSTDHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGSLIIPHYDHYHNIKFEWFDEGLYEAPKGYTLEDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.15)从DBAC31表汰的包括His标签(下划线的)的PhtD截短物2MGHHHHHHVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.16)从PBAC32表汰的句,括His标签(下划线的)的PhtD截短物3MGHHHHHHHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.17)PhtD截短物的结构表征和与全长PhtD的比较纯化的PhtD截短物1、2和3各自通过生物化学和生物物理学手段来表征，获得的结果与全长PhtD蛋白质(缺乏信号序列)组(lots)的分析所获的特征数据比较。进行以下分析圆二色(CD)光谱法、内在荧光光谱法、分析性超速离心(AUC)、伴有多角度光散射检测的大小排阻层折(SEC-MALS)和差示扫描量热术(DSC)。这些分析的结果在以下的表4中概述。表4=PhtD和PhtD截短物的表征结果的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>*在280nm和295nm的激发频率下Tm，热转变中点根据表4中概述的表征结果，PhtD截短物1具有与全长PhtD类似的、但不相同的总体溶液结构，而PhtD截短物2和3的结构是不同的。在PhtD的DSC分析中观察到的多个热转变是存在多个(即，三个)结构域的暗示。PhtD截短物1的DSC结果显示了2个转变，表明截短物除去了这些结构域之一。PhtD截短物2和3具有相似的总体结构，DSC结果显示了高度热稳定的单个结构域的存在。这些结果显示了截短物处于折叠构象中。实施例2单克隆抗体使用标准方法由ImmunoPrecise(Victoria，BC，Canada)产生针对多种Pht蛋白质(即，PhtD、PhtA、PhtB、PhtE)的单克隆抗体。为了产生单克隆抗体，小鼠用各种蛋白质免疫，使用标准方法分离分泌具有特异性的抗体的杂交瘤。对PhtD、PhtA,PhtB和PhtE的每一种产生多个杂交瘤克隆。对于PhtD，小鼠用重组产生的PhtD全长蛋白质(带His标签并缺乏信号序列)免疫。重组产生的PhtD蛋白质来自肺炎链球菌菌株TIGR4(保藏在美国典型培养物保藏所，ATCCBAA-334)。用于免疫小鼠的PhtD蛋白质的氨基酸序列SEQIDNO:24在下文中列出，相应的核苷酸序列是SEQIDN0:23。重组PhtD蛋白质序列MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSSYELGRHQAGQVKKESNRVSYID⑶QAGQKAENLTPDEVSKREGINAEQIVIKITDQGYVTSHGDHYHYYNGKVPYDAIISEELLMKDPNYQLKDSDIVNEIKGGYVIKVDGKYYVYLKDAAHADNIRTKEEIKRQKQEHSHNHGGGSNDQAVVAARAQGRYTTDDGYIFNASDIIEDTGDAYIVPHGDHYHYIPKNELSASELAAAEAYWNGKQGSRPSSSSSYNANPAQPRLSENHNLTVTPTYHQNQGENISSLLRELYAKPLSERHVESDGLIFDPAQITSRTARGVAVPHGNHYHFIPYEQMSELEKRIARIIPLRYRSNHWVPDSRPEQPSPQSTPEPSPSPQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAVRKV⑶GYVFEENGVSRYIPAKDLSAETAAGIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYDLLARIHQDLLDNKGRQVDFEALDNLLERLKDVPSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITYTDDEIQVAKLAGKYTTEDGYIFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKEKGLTPPSTDHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGSLIIPHYDHYHNIKFEffFDEGLYEAPKGYTLEDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO24)a.交叉反应性对不同的Pht蛋白质产生的每种单克隆抗体的交叉反应性使用来自杂交瘤的上清液通过ELISA来评估。ELISA的结果以下在表5中列出。产生的单克隆抗体的每一个(例如，PhtD)在ELISA中筛选对引发它的特定Pht蛋白质(如在表4中鉴定的为“自身”)的反应性，和对Pht蛋白质的组合(例如，PhtA和PhtE，在表5中鉴定为“A，E”)的反应性。对每个Pht蛋白质产生的杂交瘤克隆的总数在表5中在“免疫蛋白”列的应用的Pht蛋白的格中注明(例如，对PhtD产生14个杂交瘤克隆)。筛选中使用的Pht蛋白质是重组的完整蛋白质。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>在来自交叉反应性筛选(通过ELISA)的结果的基础上，选择了许多抗体用于进一步的分析，包括杂交瘤克隆9E11、4D5和IB12。虽然克隆9E11、4D5和IB12的每一个是针对PhtD产生的，克隆9E11在交叉反应性筛选中被测定仅具有对PhtD的特异性，而克隆4D5和IB12各自被发现具有对PhtA、B和D的特异性。b.表位作图使用变性SDS-PAGE/Western印迹进行表位作图。确定的是，克隆4D5和9E11各自产生结合PhtD的截短物3片段的线性表位的mAbs。在Western印迹之前PhtD的截短物3片段的蛋白水解消化显示了，mAb9E11所识别的线性表位处于与截短物3片段(以及全长PhtD蛋白质的相应氨基酸序列)的氨基酸1到101(SEQIDNO26)相应的序列之内。使用PhtD的截短物1、2和3通过ELISA进一步测试每个克隆(S卩，克隆9E11、4D5和IB12)的mAbs证实了通过Western印迹对每个克隆确定的特异性，以及鉴定的mAb克隆(1B12)具有对T3截短物的特异性。c.被动保护在本发明的进一步的实施方式中，评估了克隆9E11、4D5和IB12的每一个产生的mAb的保护动物对抗肺炎链球菌攻击的能力。进行初步的实验来测试在兔中各自针对全长PspA、PhtB或PhtD产生的抗体提供对抗肺炎链球菌感染的被动保护的能力。在这项研究中，在50cfu的肺炎链球菌菌株A66.1的静脉内施用前1小时，CBA/n小鼠的组用兔抗PspA、抗PhtB、或抗PhtD血清(110稀释)的腹膜内剂量预先处理。对于用抗体(即，PspA、PhtB或PhtD)预先处理的每个组，100%的动物存活。相反，用预出血的(prebleed)兔PspA血清预处理的动物的1/20存活，用预出血的兔PhtB血清预处理的动物的0/10存活，用预出血的兔PhtD血清预处理的1/25的动物存活。进行的被动保护研究使用了早先开发的被动保护模型。所述模型利用CBA/CaHN-Btkxid/J小鼠，已知其对肺炎链球菌的感染是高度敏感的，涉及在50cfu的肺炎链球菌菌株A66.1的静脉内施用之前1小时、被研究抗体的腹膜内的施用。施用的攻击剂量在攻击之前和之后验证。监视死亡率14天，来自幸存小鼠的血液平铺来确认细菌清除。在实验中，克隆4D5和9E11产生的mAbs使用被动免疫模型各自测试。使用了5只小鼠的组。三个组腹膜内施用400μg的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4D5mAb，或PBS中的9EllmAb，或PBS(即，阴性对照组)。阳性对照组施用兔抗PhtD。每个组施用50cfu的肺炎链球菌菌株A66.1的攻击剂量。用克隆4D5产生的mAb免疫的百分之八十的动物存活于攻击剂量，用mAb9E11免疫的百分之百的动物存活于攻击剂量。在用PBS“免疫”后没有动物存活，而用兔抗PhtD免疫的动物的百分之百存活于攻击剂量。在独立的实验中，使用被动免疫模型测试了mAbIB12。PBS中的^OyglB12mAb经由腹膜内途径施用，随后施用50cfu的肺炎链球菌菌株A66.1的攻击剂量。对于已经用mAbIB12免疫的组，通过(through)第3天百分之百的动物存活于攻击剂量，通过第14天(即，测试的极限)百分之八十的动物存活于攻击剂量。用PBS“免疫”的组中的动物都没有存活过第1天，而在阳性对照组(即，用兔抗PhtD血清免疫的)中的每个动物通过第14天存活于攻击剂量。还进行了剂量研究。使用同样的攻击模型，在50cfu的肺炎链球菌菌株A66.1的攻击剂量施用之前一小时，动物用？83中的40(^8、20(^8、10(^8或5(^8mAb9E11免疫。阴性对照组在攻击之前施用PBS，阳性对照组在攻击之前施用兔抗PhtD血清(110稀释度)。在14天后，在400μg剂量后60%的小鼠存活；在200μg剂量后20%存活；在100μg或50μg剂量后没有动物存活。对于施用400μg剂量的组，存活率在第6天跌至80%，到第9天跌至60%。对于施用200μg剂量的组，存活率在第3天跌至60%，到第5天跌至20%。对于施用IOOyg剂量的组，存活率在第2天跌至20%，到第3天跌至0%。因而，对于施用400μg剂量的组(60%存活率)和施用200μg剂量的组(20%存活率)，观察到14天存活率的提高。使用mAb4D5进行了类似的剂量研究。在50cfu的肺炎链球菌菌株A66.1的攻击剂量施用之前一小时，动物用PBS中的400μg、200yg、100yg或50μgmAb4D5免疫。14天后，在400yg剂量后100%的小鼠存活，更低剂量或对照(PBS)的没有存活。在200μg剂量后到第2天百分之百的动物存活；到第2天存活60%，到第3天20%存活。因而，在施用400μg剂量的组(100%存活率)和施用200μg剂量的组(到第3天20%存活率)，观察到14天存活率的提高。d.mAbs的协同效应进行研究来测试mAbs协同地作用的能力。使用同早先的研究中相同的被动保护模型。使用八组小鼠(每组5只)，在攻击剂量之前施用100μg4D5mAbs、200yg4D5mAbs、IOOyg9EllmAbs、200yg9EllmAbs、200μg的由9E11禾口4D5的每一种100μg构成的库、PBS(即阴性对照)、兔抗PspA血清(即阳性对照)或400yg的IB12mAbs。发现的是，含有4D5和9E11抗体每种100μg的200μg总剂量提供了100%的保护到14天(即，测试的极限)。相比之下，单独的200μgmAbs4D5或9E11分别提供了在第14天时仅20%和40%的存活率。4D5的100μg剂量提供了通过第1天的100%存活率(如PBS)，和通过第2天的60%存活率，其在第3天跌至20%存活率(这维持通过第14天)。mAb9E11的IOOyg剂量提供了通过第1天的100%存活率(如PBS的)，通过第2天的80%存活率，通过第3天的60%存活率，和第4-6天的20%存活率，其然后跌至零。随后的实验确认了这种协同效应，其数据在下文的表6中示出。在这项研究中，动物组施用了改变浓度的mAb库(即，等量的9E11和4D5mAbs的库)的剂量。表炉<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>天Γ~2Γ~3Γ15Γ~678910ΓΓ1213~|14~PBSIOO-O000000000000~PspA100~100100100~100~100~100~100100100100~100100~100200Ρ100~100100100~100~100~100~100100100100~100100~100~~00Ρ100~100100806060606060606060606050Ρ100~1008060402000000000~25Ρ100602000000000000~*PBS磷酸盐缓冲盐水；PspA抗全长PspA；200P:4D5和9E11的200μg库；100P4D5和9E11的100μg库；50P:4D5和9E11的50μg库；25P:4D5和9E11的25μg库。如表6中所示，对每种剂量观察到协同效应。虽然早先没有测试25yg剂量，25yg的组合的剂量提供了到第3天的20%存活率。在早先的实验中，mAb4D5或9E11的50μg的剂量具有与PBS剂量(即阴性对照)的基本上相同的结果。这些实验展现了4D5和9E1ImAbs可以各自用于提供对肺炎链球菌感染的保护。这些实验还展现了由mAbs4D5和9E11的组合给药引起的令人惊讶的协同效应，其超过了组合单独抗体的预想的叠加效应。此处描述的单克隆抗体可以单独地或组合地使用。虽然已经就优选的实施方式描述了本发明，要理解的是，本领域技术人员将想到变体和修改。因而，希望的是，附随的权利要求覆盖了所有这些等价的变体，其被包括在要求权利的本发明的范围之内。参考文献AdamouJE,HeinrichsJH,ErwinAL,WalshW,GayleT,DormitzerM,DaganR,BrewahYA,BarrenP,LathigraR,LangermannS,KoenigS,JohnsonS.2001."IdentificationandCharacterizationofaNovelFamilyofPneumococcalProteinsThatAreProtectiveagainstSepsis.“InfectImmun.69:949-958.HamelJ,CharlandN,PineauI,OuelletC,RiouxS,MartinD,BrodeurBR.2004."PreventionofPneumococcalDiseaseinMiceImmunizedwithConservedSurface-AccessibleProteins·，，InfectImmun.722659-2670.`OgunniyiAD,GrabowiczΜ,BrilesDE,CookJ,PatonJC.2007."DevelopmentofavaccineagainstinvasivepneumococcaldiseasebasedoncombinationsofvirulenceproteinsofStreptococcuspneumoniae·，，InfectImmun.75:350-357.ZhangY，MasiAW,BarniakV，MountzourosK，HostetterMK,GreenBA.2001.“RecombinantPhpAprotein，auniquehistidinemotif-containingproteinfromStreptococcuspneumoniae，protectsmiceagainstintranasalpneumococcaldisease.，，InfectImmun.69:3827_3836·GuiImi,etal.NewapproachestowardstheidentificationofantibioticandvaccinetargetsinStreptococcuspneumoniae.EMBOreports3，8，728-734(2002)UnitedStatesPatent7，122，194.Johnson，et.al.October17,2006.TitleVaccinecompositionscomprisingStreptococcuspneumoniaepolypeptideshavingselectedstructuralmotifsUnitedStatesPatent6，582，706.Johnson，etal.June24,2003.TitleVaccinecompositionscomprisingStreptococcuspneumoniaepolypeptideshavingselectedstructuralmotifsUnitedStatesPatentApplication20050214329Laferriere,CraigAnthonyJoseph；etal.September29，2005Title:VaccineUnitedStatesPatentApplication20040081662Hermand,Philippe；etal.April29，2004Title:Vaccine权利要求一种分离的核酸，编码与SEQIDNO2具有至少90％同一性的肺炎链球菌多肽。2.一种重组表达载体，包含与转录调节元件可操作连接的权利要求1的核酸。3.一种细胞，包含权利要求2的重组表达载体。4.权利要求1的分离的核酸，其中所述肺炎链球菌多肽引发免疫反应。5.一种分离的核酸，选自由以下构成的组a)编码与SEQIDNO2具有至少90%同一性的肺炎链球菌多肽的核酸；b)与编码与SEQIDNO:2具有至少90%的同一性的肺炎链球菌多肽的核酸完全互补的核酸；和c)(a)或(b)的RNA，其中U替代了T06.一种重组表达载体，包含与转录调节元件可操作连接的权利要求5的核酸。7.一种细胞，包含权利要求6的重组表达载体。8.权利要求5的分离的核酸，其中所述肺炎链球菌多肽引发免疫反应。9.一种分离的多肽，包含与SEQIDNO:2具有至少90%的同一性的氨基酸序列。10.一种单克隆抗体，其特异性地结合与SEQIDNO:2具有至少90%的同一性的多肽。11.一种分离的核酸，编码与SEQIDNO:3具有至少90%的同一性的肺炎链球菌多肽。12.—种重组表达载体，包含与转录调节元件可操作连接的权利要求11的核酸。13.一种细胞，包含权利要求12的重组表达载体。14.权利要求11的分离的核酸，其中所述肺炎链球菌多肽引发免疫反应。15.一种分离的核酸，选自由以下构成的组a)编码与SEQIDNO3具有至少90%同一性的肺炎链球菌多肽的核酸；b)与编码与SEQIDNO:3具有至少90%的同一性的肺炎链球菌多肽的核酸完全互补的核酸；和c)(a)或(b)的RNA，其中U替代了T016.一种重组表达载体，包含与转录调节元件可操作连接的权利要求15的核酸。17.一种细胞，包含权利要求16的重组表达载体。18.权利要求15的分离的核酸，其中所述肺炎链球菌多肽引发免疫反应。19.一种分离的多肽，包含与SEQIDNO:3具有至少90%的同一性的氨基酸序列。20.一种单克隆抗体，其特异性地结合与SEQIDNO:3具有至少90%的同一性的多肽。21.一种分离的核酸，编码与SEQIDNO:4具有至少90%的同一性的肺炎链球菌多肽。22.—种重组表达载体，包含与转录调节元件可操作连接的权利要求21的核酸。23.一种细胞，包含权利要求22的重组表达载体。24.权利要求21的分离的核酸，其中所述肺炎链球菌多肽引发免疫反应。25.一种分离的核酸，选自由以下构成的组a)编码与SEQIDNO4具有至少90%同一性的肺炎链球菌多肽的核酸；b)与编码与SEQIDNO:4具有至少90%的同一性的肺炎链球菌多肽的核酸完全互补的核酸；和c)(a)或(b)的RNA，其中U替代了T026.—种重组表达载体，包含与转录调节元件可操作连接的权利要求25的核酸。27.一种细胞，包含权利要求26的重组表达载体。28.权利要求25的分离的核酸，其中所述肺炎链球菌多肽引发免疫反应。29.—种分离的多肽，包含与SEQIDNO:4具有至少90%的同一性的氨基酸序列。30.一种单克隆抗体，其特异性地结合与SEQIDNO:4具有至少90%的同一性的多肽。31.一种单克隆抗体，其特异性结合位于具有SEQIDNO:4所列氨基酸序列的肽中跨越氨基酸1和氨基酸101的区域中的抗原决定簇。32.—种抑制宿主中链球菌属物种感染的方法，包括向所述宿主施用包含权利要求30的抗体的组合物。33.一种免疫原性片段，选自由SEQIDN0:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4或其变体构成的组，所述变体选自由SEQIDNO15,SEQIDN0:16和SEQIDNO:17构成的组。34.一种组合物，包含至少一种权利要求33的免疫原性片段和药学上可接受的载体。35.权利要求33的组合物，进一步包含佐剂。36.权利要求33的组合物，进一步包含至少一种其他的免疫原性链球菌蛋白质或其片段。37.权利要求33的组合物，其中所述组合物适合于向粘膜表面施用。38.权利要求37的组合物，其中所述组合物是鼻喷雾剂。39.权利要求37的组合物，其中所述组合物是喷雾器溶液。40.权利要求37的组合物，其中所述组合物是气雾剂吸入物。41.一种在受试者中产生特异于PhtD的抗体的方法，包括向所述受试者施用权利要求33到40的任一项的免疫原性片段或组合物。42.一种在受试者中降低肺炎球菌的鼻部携带的方法，包括向所述受试者施用权利要求33到40的任一项的免疫原性片段或组合物。43.一种在受试者中降低肺炎球菌感染的风险的方法，包括向所述受试者施用权利要求33到40的任一项的免疫原性片段或组合物。44.权利要求43的方法，其中所述肺炎球菌感染是脑膜炎。45.权利要求43的方法，其中所述肺炎球菌感染是中耳炎。46.权利要求43的方法，其中所述肺炎球菌感染是肺炎。47.权利要求43的方法，其中所述肺炎球菌感染是溶血性尿毒症。48.权利要求43的方法，其中所述免疫原性片段的施用不消除肺炎球菌的鼻部携带。49.一种免疫宿主对抗链球菌属细菌感染的方法，包括向所述宿主施用选自由SEQIDN0:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4或其变体构成的组的至少一种PhtD片段，所述变体选自由SEQIDNO:15、SEQIDNO16和SEQIDNO17构成的组。50.权利要求49的方法，其中超过一种片段被施用给所述宿主。51.一种在宿主中治疗链球菌属细菌的感染的方法，包括向所述宿主施用组合物，所述组合物包含选自由SEQIDN0:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4或其变体构成的组的至少一种多肽，所述变体选自由SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17构成的组。52.权利要求51的方法，其中超过一种多肽被施用给所述宿主。53.一种单克隆抗体，选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11构成的组。54.权利要求53的单克隆抗体，进一步包含与之可固定连接的可检测标记。55.权利要求53的单克隆抗体的衍生物。56.权利要求55的衍生物，进一步包含与之可固定连接的可检测标记。57.一种单克隆抗体，其具有与ATCC编号XXXX的杂交瘤产生的抗体相同的抗原结合特异性。58.权利要求57的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体特异性地结合具有SEQIDNO4所列氨基酸序列的多肽。59.权利要求57的单克隆抗体的衍生物。60.权利要求59的单克隆抗体的衍生物，进一步包含与之可固定连接的可检测标记。61.一种包含权利要求53到60的任一项的单克隆抗体的组合物。62.权利要求61的组合物，其中所述抗体被纯化到至少约60%、75%、90%或95%的纯度。63.一种在宿主中预防链球菌属细菌的感染的方法，包括向所述宿主施用选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11构成的组的至少一种单克隆抗体。64.权利要求63的方法，其中超过一种单克隆抗体被施用给所述宿主。65.一种在宿主中治疗链球菌属细菌的感染的方法，包括向所述宿主施用选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11构成的组的至少一种单克隆抗体。66.权利要求65的方法，其中超过一种单克隆抗体被施用给所述宿主。67.一种测定生物样品中蛋白质的数量的方法，包括使测试生物样品暴露于选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11或其衍生物构成的组的单克隆抗体，测量与所述样品结合的抗体或衍生物的数量，以及比较所述测试生物样品中结合的量与对照生物样品中观察到的结合的量，其中与所述对照生物样品相对的、所述测试生物样品中提高的结合表明其中所述蛋白质的存在。68.权利要求67的方法，其中所述测试生物样品是哺乳动物组织。69.权利要求68的方法，其中所述组织是血液。70.一种测定生物样品中蛋白质的存在或不存在的方法，包括检测所述样品中与选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11或其衍生物构成的组的单克隆抗体反应的蛋白质。71.—种检测生物样品中链球菌属细菌或其蛋白质的方法，所述方法包括步骤(a)使所述测试生物样品暴露于选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11或其衍生物构成的组的至少一种单克隆抗体，所述暴露在容许所述抗体与它具有特异性的所述样品中的成分的条件下进行；和(b)测定与所述测试生物样品的成分结合的抗体的数量；和，(c)比较与所述测试生物样品结合的抗体的数量和与对照样品结合的数量；其中与所述对照生物样品相比，显著更高数量的抗体与所述测试生物样品的成分的结合表明所述样品中链球菌属细菌或其蛋白质的存在。72.权利要求71的方法，其中所述测试生物样品是哺乳动物组织。73.权利要求72的方法，其中所述生物样品是哺乳动物血液。74.权利要求73的方法，其中所述生物样品是人类血液。75.一种用于检测生物样品中链球菌属细菌或其蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包含选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11或其衍生物构成的组的至少一种单克隆抗体，和使用说明书。76.权利要求75的试剂盒，其中所述单克隆抗体是冻干的形式。77.一种在宿主中预防链球菌属细菌的感染的方法，包括向所述宿主施用选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11构成的组的至少两种单克隆抗体。78.权利要求77的方法，其中所述单克隆抗体是4D5和9E11。79.一种在宿主中治疗链球菌属细菌的感染的方法，包括向所述宿主施用选自由ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的1B12、ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的4D5和ATCC编号XXXX的小鼠杂交瘤产生的9E11构成的组的至少两种单克隆抗体。80.权利要求79的方法，其中所述单克隆抗体是4D5和9E11。81.一种单克隆抗体，其特异性地结合与SEQIDNO:24具有至少90%的同一性的多肽。82.权利要求81的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体特异性结合由SEQIDNO:26组成的肽。83.一种单克隆抗体，其特异性地结合与SEQIDNO:26具有至少90%的同一性的肽。全文摘要在此提供的是用于引发针对肺炎链球菌的免疫反应的组合物和方法。更特别地，所述组合物和方法涉及免疫原性多肽，包括PhtD的片段和其变体，以及编码或表达所述多肽的核酸、载体和转染的细胞。还描述了产生和利用所述免疫原性多肽的方法。文档编号C12P21/08GK101802198SQ200880108203公开日2010年8月11日申请日期2008年7月23日优先权日2007年7月23日发明者J·耶雄,M·奥赫斯,R·夏尔博瓦,R·布鲁克斯申请人:圣诺菲·帕斯图尔有限公司