中间体的对映选择性酶还原的方法

专利名称：：中间体的对映选择性酶还原的方法中间体的对映选择性酶还原的方法本发明涉及在辅因子的存在下应用氧化还原酶将通式I酮化合物分别对映选择性(enantioselective)酶还原为式II(R，S-醇)和III(S，S-醇)化合物的方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中，R可以表示氨基官能的任何保护基团(叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基)且X=-Cl、-CN、-0H、Br、F，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>优选的式I化合物含有丁氧羰基或苄氧羰基作为氨基保护基团并且在X的位置是氯原子。通式II和III的手性醇是用于治疗HIV的蛋白酶抑制剂的生产中重要的中间体。此类蛋白酶抑制剂例如是利托那韦(Ritonavir)、安泼那韦(Amprenavir)、福沙那韦(Fosamprenavir)、Atazanavir或Darunavir0例如可通过式I相应酮化合物的对映选择性还原分别获得式II(R，S-醇)和III(S，S-醇)中间体，其中所述的对映选择性还原在当前的生产方法中通过化学方法进行。在做这些时，化学催化还原具有这样的缺陷一方面，其可能由于恶劣的反应条件而产生副产品，另一方面，分别产生不符合要求的对映体和非对映体过量，并且只有费很大的努力才能在技术上可行。因此，对映体富集形式的式II(R，S-醇)中间体比式III(S，S-醇)更难以化学获得。由于这一原因，在相当一些时间，已努力开发允许所述中间体对映选择性还原的生物催化方法。生物催化方法通常在温和的条件下操作，由于这一原因，可预期它们能够还原式I的酮化合物而不会形成其它的副产品。然而，到目前为止，还没有可能发现可利用来用分离的酶进行酶还原的合适生物催化剂。据我们所知，仅存在很少的这样的出版物，即在所述出版物中描述了在全细胞方法中应用红球菌属(Rhodococcus)或链霉菌属(Str印tomyces)菌株的式I酮的反应(TetrahedronAsymmetry14(2003)3105-3109,TetrahedronAsymmetry8(1997)p.2547)。然而，该反应因此分别只能用野生型菌株全细胞和溶胞产物才发生，并且因此已只在远低于2%的非常低的浓度下进行，并且没有辅酶的再生。目前为止，还没有可在工业规模上可应用的酶还原方法，并且参与该反应的酶也还既未被分离也未被鉴定。本发明的目的是提供能以高产量经济地分别产生对映体纯的对映体富集的通式II和III中间体，并且具有高对映体纯度而无任何副产品的方法。根据本发明，通过最初提到的方法类型完成所述目的，其特征在于用于生产式II化合物(R，S-醇)的氧化还原酶a)包含根据SEQIDNO=USEQIDNo2、SEQIDNo3或SEQIDNo4的氨基酸序列，b)包含这样的氨基酸序列，其中至少60%的所述氨基酸与氨基酸序列SEQIDN0USEQIDNo2或SEQIDNo3、SEQIDNo4的那些相同，或c)包含这样的氨基酸序列，其中至少70%的所述氨基酸与氨基酸序列SEQIDN0USEQIDNo2或SEQIDNo3、SEQIDNo4的那些相同，或d)由核酸序列SEQIDNO16,SEQIDNo17,SEQIDNo18,SEQIDNo19编码，或e)由在严格条件下与SEQIDNO16,SEQIDNo17,SEQIDNo18,SEQIDNo19杂交的核酸序列编码，f)具有220至260个氨基酸的长度，并且包含一个或若干个选自序列SEQIDNO31至SEQIDNO51的部分序列，并且优先将式I化合物还原为式II化合物。nalvtgasrgig(31)nalvtggsrgig(32),gysvt(33),gynvt(34),gygitl(35),gygvt(51)vlaklp(36),vkaklp(37)fkgaplpa(38)，frgaplpa(39)，lkgaplpa(40)，spialtk(41)，spvaltk(42)，sqialtq(43)，avysask(44)，avysatk(45)，gvysatk(46)，pikgwi(47),piegwi(48),piggwi(49)andpisgwi(50),此外，通过最初提到的方法类型完成所述目的，其特征在于用于生产式III化合物(S，S-醇)的氧化还原酶a)包含根据SEQIDNO:5、SEQIDNo6、SEQIDNo7、SEQIDNo8、SEQIDNo9、SEQIDNo10、SEQIDNo11、SEQIDNo12、SEQIDNo13、SEQIDNo14、SEQIDNo15的氨基酸序列；b)包含这样的氨基酸序列，其中至少60%的所述氨基酸与根据SEQIDNO5、SEQIDNo6、SEQIDNo7、SEQIDNo8、SEQIDNo9、SEQIDNo10、SEQIDNo11、SEQIDNo12、SEQIDNo13、SEQIDNo14、SEQIDNo15的氨基酸序列的那些相同，或c)由核酸序列SEQIDNO20、SEQIDNo21、SEQIDNo22、SEQIDNo23、SEQIDNo24、SEQIDNo25、SEQIDNo26、SEQIDNo27、SEQIDNo28、SEQIDNo29或SEQIDNo30编码，或d)由在严格条件下与SEQIDNO20、SEQIDNo21,SEQIDNo22、SEQIDNo23、SEQIDNo24、SEQIDNo25、SEQIDNo26、SEQIDNo27、SEQIDNo28、SEQIDNo29或SEQIDNo30杂交的核酸序列编码，e)具有220至260个氨基酸的长度，并且包含一个或若干个选自序列SEQIDNO31至SEQIDNO66的部分序列，并且优先将式I化合物还原为式III化合物。nalvtgasrgig(31)nalvtggsrgig(32),gysvt(33),gynvt(34),gygitl(35),gygvt(51)vlaklp(36)，vkaklp(37)fkgaplpa(38)，frgaplpa(39)，lkgaplpa(40)，fkaaplpa(52)，fkgsplpa(53)spialtk(41)，spvaltk(42)，sqialtq(43)，avysask(44)，avysatk(45)，gvysatk(46)，pikgwi(47),piegwi(48),piggwi(49)andpisgwi(50),gigrat(54),gigrasa(55),gigret(56),nnagig(57)，nnagieg(58)，irvvaiapg(59)，irvnaiapg(60)，irvnaicpg(61)，irvvgiapg(62)，peqiagav(63)，peaianav(64)，peevanav(65)，peaianav(66)。将式I化合物优先还原为式II化合物的多肽应被理解为这样的多肽，即其中在最佳的反应条件下可达到的R，S-醇的最大对映体过量总计至少50%。最佳反应条件由此被理解为这样的多肽反应条件，即在该条件下，多肽产生R，S-醇的最大对映体过量。已发现包含氨基酸序列SEQIDNO=USEQIDNo2,SEQIDNO:3禾口SEQIDNo4的多肽显示出氧化还原活性，并且可用于将式I化合物优先还原为式II化合物(R，s-化合物)。可达到的R，S-的醇的对映体过量总计>50%，优选>80%，并且尤其优选>95%。当应用SEQIDNO:1时，达到的对映体过量例如可达到最高>99%的R，S-化合物(式II)。类似地，已发现包含氨基酸序列SEQIDNO:5至SEQIDNo15的多肽显示出氧化还原活性，并且可用于将式I化合物优先还原为式III化合物(S，S-化合物)。可达到的R，S-醇的对映体过量总计>80%，优选>90%，并且尤其优选>95%。当应用SEQIDN05、SEQIDNO:6、SEQIDNO9或SEQIDNO12时，达到的对映体过量可达到最高>99%的R，S-化合物(式II)。许多所提到的氧化还原酶诸如例如SEQIDNo1、3、4、5、6、7和15还具有其它的优点，即它们能够通过还原仲醇再生在还原过程中形成的氧化的辅因子。因此，所述氧化还原酶特别的经济优点还在于，与现有技术方法相反，不需要其它的酶用于辅因子再生。编码包含SEQIDNO:5的多肽的DNA序列SEQIDNO20例如可从生物RubrobacterxylanophilusDSM9941的基因组获得。编码包含SEQIDNO6的多肽的DNA序列SEQIDNO21例如可从生物GeobacillusthermodenitrificansDSM465白勺编码包含SEQIDNO7的多肽的DNA序列SEQIDNO22例如可从生物橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)DSM635的基因组获得。分别编码包含SEQIDNO8或SEQIDNO9的多肽的DNA序列SEQIDNO23或DNA序列SEQIDNO:24例如可从生物木兰假丝酵母(Candidamagnoliae)DSMZ70638获得。编码包含SEQIDNO11的多肽的DNA序列SEQIDNO:26例如可从生物木兰假丝酵母(Candidamagnoliae)DSMZ70639获得。编码包含SEQIDNO1的多肽的DNA序列SEQIDNO16例如可从生物木兰假丝酵母(Candidamagnoliae)CBS6396获得。此夕卜，SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:12、SEQIDNO13、SEQIDN0:14和SEQIDNO15的氧化还原酶例如可从菌株木兰假丝酵母(Candidamagnoliae)CBS5659、CBS7318、CBS2798、JCM9448，CandidageocharesMUCL29832，假丝酵母属物种MUCL40660，CandidagropengiesseriMUCL29836通过同源筛选获得。因此，本发明涉及将式I的酮化合物分别还原为通式II和III的化合物的方法，其特征在于明显过量地形成式II或III化合物之一，其应用包含氨基酸序列SEQIDN01至SEQIDNO15之一的多肽，或包含与氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDN0:15之一至少50%相同的氨基酸序列的多肽，即可通过替换、插入、缺失或添加至少一个氨基酸来源于序列SEQIDNO:1至SEQIDNO15的多肽，或应用由核酸序列SEQIDN0:16至SEQIDNO:30之一编码的多肽，或由在严格条件下与序列SEQIDN0:16至SEQIDNO:30之一杂交的核酸序列编码的多肽。例如在严格条件下与SEQIDN0:16杂交的核酸序列被理解为可通过菌落杂交法、噬菌斑杂交方法、DNA印迹杂交法或类似方法，应用SEQIDNO16作为DNA探针鉴定的多核苷酸。为这一目的，在60°C在0.7-1MNaCl溶液中使固定在滤器上的多核苷酸例如与SEQIDN0:16杂交。如例如在MolecularCloning,ALaboratoryManual,SecondEdition(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)或类似出版物上描述的那样进行杂交。随后，用0.1至2-倍SSC溶液在65°C洗涤滤器，其中1-倍SSC溶液被理解为由150mMNaCl和15mM柠檬酸钠组成的混合物。此外，本发明涉及氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDN0:4、SEQIDNO=IUSEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14禾口SEQIDNO:15的多肽，以及与氨基酸序列SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14禾口SEQIDNO:15之一至少55%，优选65%-75%，尤其优选超过75%相同的多肽，即涉及可通过替换、插入、缺失、或添加至少一个氨基酸来源于序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14禾口SEQIDNO:15的多肽。此外，本发明还涉及由核酸序列SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO26,SEQIDNO27,SEQIDNO28,SEQIDNO29或SEQIDNO:30编码，或由在严格条件下与序列SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29或SEQIDNO30之一杂交的核酸序列编码的多肽。在根据本发明的方法中，包含序列SEQIDNO1至SEQIDNO15的多肽和可来源于所述多肽的多肽分别可以以完全纯化的状态、部分纯化的状态或作为含有多肽SEQIDNO1至SEQIDNO15之一的细胞使用。由此可以以天然、透化的或裂解状态提供使用的细胞。优选地，使包含序列SEQIDNO:1至SEQIDNO15的多肽和可来源于其的衍生物分别在合适的宿主生物中过表达，所述宿主生物诸如例如大肠杆菌(Escherichiacoli)，并且将重组多肽用于还原通式I的羟基酮。根据本发明的酶还原在温和的条件下进行，因此可很大地避免不稳定的式I化合物的降解以及由此不期望的副产品的形成。取决于所使用的多肽，根据本发明的方法具有最高达99%的式II化合物(R，S-化合物)的对映体纯度，然而至少50%的R，S-化合物。对于式III化合物(S，S_化合物)，取决于所使用的多肽，根据本发明的方法具有最高达99%的式III化合物(S，S-化合物)的对映体纯度，然而至少80%的R，S-化合物。本发明优选的实施方案的特征在于在该方法中使用的辅因子被共底物持续地还原。优选地，应用NAD(P)H作为辅因子，其中在还原中形成的NAD(P)通过共底物还原回NAD(P)H0在根据本发明的方法中，优选持续地再生通过氧化还原酶/脱氢酶形成的氧化的辅因子NAD或NADP。根据本发明所有方法的优选实施方案，通过醇的氧化再生氧化的辅因子NAD或NADP。优选应用诸如2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、3-戊醇、4-甲基_2_戊醇、2_庚醇、2_辛醇或环己醇的仲醇作为共底物。根据特别优选的实施方案，将2-丙醇或4-甲基-2-戊醇用于辅酶再生。用于再生的共底物的量可以是总体积的5至95%体积。优选地，将通式RxRyCHOH的仲醇用于辅因子再生，其中Rx和Ry独立地是氢、支链或非支链C1-C8-烷基并且Cg彡3。根据本发明方法其它优选的实施方案，添加其它的氧化还原酶/脱氢酶用于辅因子再生。在其它优选的实施方案中，可还添加其它的醇脱氢酶用于辅因子的再生。合适的NADH-依赖性醇脱氢酶例如可从面包酵母，从近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis(CPCR))(US5,523,223禾口US5,763，236，EnzymeMicrob.Technol.,1993,15(11)950-8),Pichiacapsulata(DE10327454.4)，从红串红球菌(Rhodococcuserythropolis(RECR))(US5,523,223)、Norcardiafusca(Biosci.Biotechnol.Biochem.，63(10)，1999，第1721-1729页；Appl.Microbiol.Biotechnol，.2003,62(4)380-6；Epub2003，4月26日)或从赤红球菌(Rhodococcusruber)(J.Org.Chem.，2003，68(2)402-6)获得。用于这些醇脱氢酶的合适的共底物例如是已经提到的仲醇，诸如2-丙醇(异丙醇)、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-辛醇或环己醇。用于NADPH再生的合适的仲醇脱氢酶例如是上面描述并且分离自乳杆菌(Lactobacillale)目生物的那些，所述生物例如高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefir)(US5,200,335)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)(DE19610984Al;ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.2000Dec；56Pt12:1696-8)、稍小乳杆菌(Lactobacillusminor)(DE10119274)、肉色明串珠菌(Leuconostoccarnosum)(A1261/2005，Kl.C12N)，或如所描述的那样，来自Thermoanerobiumbrockii、Thermoanerobiumethanolicus或拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)白勺些。然而，原则上其它酶系统也可用于辅因子再生。例如，可应用NAD-或NADP-依赖性甲酸脱氢酶实现辅因子再生(Tishkov等，J.Biotechnol.Bioeng.[1999]64，187-193，Pilot-scaleproductionandisolationofrecombinantNADandNADPspecificformatedehydrogenase)。甲酸脱氢酶的合适共底物例如是甲酸盐，诸如甲酸铵、甲酸钠或甲酸钙。在根据本发明的方法中，反应批次中使用的通式I化合物的量优选为基于总体积的10g/l至500g/l，优选25g/l至300g/l，特别优选50g/l至200g/l。进行酶还原的反应混合物中水性部分优选含有缓冲剂，例如，磷酸钾、tris/HCl或三乙醇胺缓冲剂，其具有5-10的pH值，优选6-9的pH值。此外，该缓冲剂可以含有用于稳定或活化酶的离子，例如诸如，锌离子或镁离子。当实施根据本发明的方法时，温度合适地是约10°C至70°C，优选20°C至45°C。在根据本发明的方法的其它优选实施方案中，在有机溶剂的存在下进行酶反应，其中所述的有机溶剂不与水混溶或仅以非常小的程度与水混溶。所述溶剂例如是对称的或非对称的二(Ci-Q)烷基醚、直链或支链烷或环烷或不溶于水的仲醇，其同时作为共底物。优选的有机溶剂是二乙醚、叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸丁酯、庚烷、己烷、2-辛醇、2-庚醇、4-甲基-2-戊醇和环己醇。在这种情况下，该溶剂又可同时作为用于辅因子再生的共底物。如果分别使用不溶于水的溶剂和共底物，反应批次由水相和有机相组成。根据其溶解度，通式化合物分布在有机相和水相之间。一般而言，基于总反应体积，有机相具有5至95%的比例，优选10至90%。优选机械地混合物两个液态相，因此在它们之间产生大的表面面积。在这一实施方案中，例如，在酶还原期间形成的NAD(P)也可被诸如上面描述的共底物还原回NAD(P)H。在水相中辅因子(特别是NADH或NADPH)的浓度分别一般为0.OOlmM至10mM，特别是0.OlmM至ImM。在根据本发明的方法中达到的TTN(总转化数=还原的式I化合物mol/所使用的辅因子mol)通常为102至105，然而优选为彡103。在根据本发明的方法中，还可使用氧化还原酶/脱氢酶的稳定剂。合适的稳定剂例如是甘油、山梨醇、1，4-DL-二硫苏糖醇(DTT)或二甲基亚砜(DMS0)。根据本发明的方法例如在由玻璃或金属制成的封闭反应容器中进行。为这一目的，将成分单个地转移至该反应容器中，并且在例如氮气或空气气氛中搅拌。根据本发明另一可能的实施方案，可持续地移除氧化的共底物(例如丙酮)和/或可持续地新添加共底物(例如，2-丙醇)，以使得反应平衡偏向反应产物。在其它实施方案中，在反应过程中逐渐地添加根据SEQIDN0:1至SEQIDNol5的氧化还原酶和/或共底物。在反应完成后，处理反应混合物。为这一目的，例如任选地将水相从有机相中分离，并且过滤含有产物的有机相。任选地，还可萃取水相并如有机相那样进一步处理。随即从有机相中蒸发溶剂，并且作为粗产物获得通式II或III的产物。然后可进一步纯化粗产物，或将其直接用于结果产物的合成。11以下通过实施例的方式进一步阐明本发明。实施例1克降并提供来自RubrobacterxylanophilusDSM9941的氧化还原酶(SEQIDNo51A)RubrobacterxylanophilusDSM9941的培养在细菌摇床上以140rpm在50°C(pH7.2)的以下培养基中培养RubrobacterxylanophilusDSM9941细胞0·1%酵母提取物、0.1%胰蛋白胨、0.004%CaSO4X2Η20、0.02%MgCl2X6Η20、0·01%氨三乙酸、IOOml磷酸盐缓冲液[5.44g/lKH2PO4,43g/lNa2HPO4X12Η20]、500μ1/10.OlM柠檬酸铁、500μ1/1微量元素[500μ1/1H2SO4,2.28g/lMnSO4XH20、500mg/1ZnSO4X7H20、500mgH3B03、25mg/lCuS04x5H20、25mg/lNa2MoO4X2H20、45mg/lCoCl2X6H20]。在培养的第6天，通过离心从培养基中分离细胞，并且储存在_80°C。B)编码选择性氧化还原酶的基因的扩增根据描述于Manniatis&Sambrook的“MolecularCloning”中所描述的方法提取基因组DNA。将得到的核酸用作聚合酶链式反应(PCR)的模板，所述PCR包含来源于NCBI数据库中46106817号下公开的基因序列的特异性引物。为了完成这些，在引物的5’端位置分别提供了用于核酸内切酶NdeI和HindIII或SphI的限制性位点(SEQIDNO:67、SEQIDNO68,SEQIDNO:69)，用于随后克隆至表达载体中。在PCR缓冲液[IOmMTris-HCl(pH8.0)；50mMKCl；IOmMMgSO4；ImMdNTP混合液；在每种情况下20pMol引物和2.5UPlatinumPfxDNA聚合酶(Invitrogen)]中，用500ng基因组DNA，并在以下温度循环中进行扩增循环194°C，2min循环2X30:94°C，15秒，54°C，30秒，68°C，60秒，循环3:68°C，7min4°C,①在1%琼脂糖凝胶上纯化后，将所得到的具有约750bp大小的PCR产物分别在核酸内切酶NdeI和HindIII或SphI和HindIII的帮助下进行限制性切割，并且分别连接至pET21a载体(Novagen)或pQE70载体(Qiagen)的骨架中，其中所述的骨架已用相同的核酸内切酶处理过。在将2μ1连接批次转化至大肠杆菌Top10Γ细胞(Invitrogen)中后，通过分别用核酸内切酶NdeI和HindIII或SphI和HindIII进行限制性分析的方式测试氨苄青霉素耐性集落的质粒DNA中具有750bp大小的插入片段的存在。将制备自所述片段为阳性的克隆的质粒进行序列分析，并随后分别转化至大肠杆菌BL21Star(Invitrogen)和大肠杆菌RB791(geneticstock,Yale)中。C)在大肠杆菌细胞中高效表达多肽SEQIDNO5为在大肠杆菌细胞中高效表达多肽SEQIDNO:5，在PCR反应中应用编码DNASEQIDNO:70作为模板，用于克隆至表达载体中。在第一个的区域，这一DNA序列在153个碱基与之前已知的DNA序列(SEQIDNO20)不同。这一修饰是保守的并且不会导致氨基酸序列中的改变。在PCR缓冲液[IOmMTris-HCl(pH8.0)；50mMKCl；IOmMMgSO4；ImMdNTP混合液；在每种情况下20pMol引物(SEQIDNO:71、SEQIDNO68)和2.5UPlatinumPfxDNA聚合酶(Invitrogen)]中，用50ngDNASEQIDNO:70作为模版，并在以下温度循环中进行扩增循环194°C，2min循环2X30:94°C，40秒，56°C，30秒，68°C，60秒，循环3:68°C，7min4°C,①在琼脂糖凝胶上纯化后，在核酸内切酶NdeI和HindIII的帮助下将所得到的具有约750bp大小的PCR产物连接至pET21a载体(Novagen)的骨架中，其中所述的骨架已用相同的核酸内切酶处理过。在将2μ1连接批次转化至大肠杆菌Top10Γ细胞(Invitrogen)中后，通过用核酸内切酶NdeI和HindIII进行限制性分析的方式测试氨苄青霉素耐性集落的质粒DNA中具有750bp大小的插入片段的存在。将制备自所述片段为阳性的克隆的质粒进行序列分析，并随后转化至大肠杆菌BL21Star(Invitrogen)中。D.)制备来自RubrobacterxylanophilusDSM9941的氧化还原酶在含有氨苄青霉素(50yg/ml)的培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl)中分别培养已用表达构建物转化的大肠杆菌菌株BL21Star(Invitrogen，Karlsruhe，德国)和RB791(大肠杆菌geneticstock，Yale，USA)，直到达到在550nm处测量的0.5的光密度。通过以0.ImM的浓度添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。在25°C和220rpm诱导16小时后，收集细胞并在_20°C保存。对于酶回收，将30g细胞悬浮于150ml三乙醇胺缓冲液(100mM，pH=7，2mMMgCl2,10%甘油)，并且应用高压勻化器破坏。随后，将酶溶液与150ml甘油混合并储存在-20°c。将这样获得的酶溶液用于化合物I的还原(实施例3)。与在实施例2中提到的方法类似，还可提供氧化还原酶SEQIDNO6和SEQIDNO7。实施例2通过分子筛选克隆并提供来自木兰假丝酵母(CandidamaRnoliae)的氧化还原酶(SEQIDNo1)A)氧化还原酶的分子筛选将分离自木兰假丝酵母CBS6396细胞的基因组DNA作为通过PCR分子筛选的模板。为做这些,在PCR缓冲液[16mM(MM)2SO4;67mMTris-HClρΗ8·3(在25°C)；1.5mMgCl2；0.01%Tween20；0.2mMdNTP混合物；在每种情况下30pMol引物(SEQIDNO:72、SEQIDNO73)和1.25UBioThermStar聚合酶(Genecraft)]中，用50ng分离自木兰假丝酵母(Candidamagnoliae)CBS6396细胞的基因组DNA作为模版，并用以下循环进行扩增循环195°C，7min循环2X28:94°C，40秒，从63°C开始每步温度下降0.5°C，30秒，68°C，60秒，X2094°C，40秒，53°C，40秒，70°C，60秒，循环3:70°C，7min4°C,①在琼脂糖凝胶上对整个PCR批次进行分级分离后，鉴定约400bp的条带，并且通过悬突腺苷部分克隆至Topo-TA载体(Invitrogen)，用于确定DNA序列。从该筛选反应得到的DNA条带展示出相应于137个氨基酸残基的氧化还原酶片段的开放阅读框。B)分离(总的及mRNA)将600mg新鲜细胞重悬浮于2.5ml冰冷的LETS缓冲液中。往所述细胞悬浮液中加入5ml(约20g)在硝酸中洗涤过并用3ml苯酚(pH7.0)平衡过的玻璃珠。然后通过30秒涡旋振荡和30秒在冰上冷冻交替处理整个批次，总共历时10分钟。随后，加入5ml冰冷的LETS缓冲液，并再次剧烈地涡旋振荡。在4°C用IlOOOg离心所述细胞悬浮液5分钟。回收水相并用等体积的苯酚氯仿异戊醇(24241)提取两次。随后立即用氯仿抽提。在最后抽提后，通过加入1/10体积的5MLiCl2使总RNA在_20°C沉淀4h。将Img如此获得的总RNA用于通过寡聚_dT纤维素(NEBBiolabs)富集mRNA分子。通过根据Manniatis&Sambrook的“MolecularCloning”中描述的方法，通过RACE(cDNA末端快速扩增)完成编码氧化还原酶的全序列的测定。编码氧化还原酶的基因序列包括720个碱基对，并且等于239个氨基酸残基长度。C)通过PCR合成编码来自木兰假丝酵母CBS6396的短链ADH的全长转录物构建特异引物用于随后将全长转录物克隆至合适的表达系统中。为此目的，修饰了具有NdeI识别序列的5’引物和具有HindIII识别序列的3，引物(SEQIDNO74、SEQIDNO:75)。将分离自木兰假丝酵母CBS6396细胞的基因组DNA作为聚合酶链式反应的模板。在PCR缓冲液[IOmMTris-HCKpH8.0)；50mMKCl；IOmMMgSO4；ImMdNTP混合液；在每种情况下20pMol引物和2.5UPlatinumPfxDNA聚合酶(Invitrogen)]中，用50ng模板，并在以下温度循环中进行扩增循环194°C，2min循环2X30:94°C，15秒，58°C，30秒，68°C，75秒，循环3:68°C，7min4°C,①在琼脂糖凝胶上纯化后，在核酸内切酶NdeI和HindIII的帮助下将所得到的PCR产物进行限制性切割，并连接至pET21a载体(Novagen)的骨架中，其中所述的骨架已用相同的核酸内切酶处理过。在将2μ1连接批次转化至大肠杆菌Top10Γ细胞(Invitrogen)中后，通过用核酸内切酶NdeI和Hind进行限制性分析的方式测试氨苄青霉素(或卡那霉素)耐性集落的质粒DNA中具有750bp大小的插入片段的存在。测序表达构建物PET21-MIX。来自木兰假丝酵母编码短链氧化还原酶的基因具有共720bp的开放阅读框(SEQIDNO16)，其相应于239个氨基酸的蛋白质(SEQIDNO:1)。D)在大肠杆菌细胞中表达重组氧化还原酶用编码该氧化还原酶的表达构建物PET21-MIX分别转化感受态大肠杆菌StarBL21(De3)细胞(Invitrogen)和RB791细胞(大肠杆菌geneticstock,Yale,USA)。然后在200ml含有50μg/ml氨苄青霉素或40μg/ml卡那霉素的LB培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl)中分别培养用表达构建物转化的大肠杆菌集落，直到达到在550nm处测量的0.5的光密度。通过以0.ImM的浓度添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。在25°C和220rpm诱导16小时后，收集细胞并在-20°C保存。为了活性测试，使IOmg细胞与500μIlOOmMTEA缓冲液ρΗ7.OUmMMgCl2和500μ1玻璃珠混合，并应用球磨机消化10分钟。然后以稀释状态将获得的裂解物用于各个测试。如下构成活性测试960μ1IOOmMTEA缓冲液ρΗ7.OUmMMgCl2,160μgNADPH、10μ1稀释的细胞裂解物。通过添加10μIlOOmM底物溶液至该反应混合物中开始反应。对于酶的大量回收，将30g细胞重悬浮于150ml三乙醇胺缓冲液(100mM，pH=7，2mMMgCl2,10%甘油)，并且应用高压勻化器消化。随后，将该酶溶液与150ml甘油混合并储存在_20°C。与在实施例2中提到的方法类似，还可提供氧化还原酶SEQIDN0:2、3、4、8、9、10、11、12、13、14、15。实施例3氧化还原酶SEQIDNO^gSEQIDNO15就它们还原式I化合物的特性而言的表征如下就式I化合物的转化检测序列SEQIDNO1至SEQIDNO15的氧化还原酶。反应批次A(无辅酶再生)160μ1缓冲液(三乙醇胺IOOmMρΗ=7，ImMMgCl2,10%甘油)150μ1NAD(P)H(40mg/ml)=6mg20μ12-丙醇2mg式I化合物50μ1根据实施例ID的酶溶液反应批次B(有辅酶再生)400μ1缓冲液(三乙醇胺IOOmMρΗ=7，ImMMgCl2,10%甘油)0.05mgNAD(P)H50μ12-丙醇IOmg式I化合物50μ1根据实施例ID的酶溶液在温育样本A和B24h后，在每种情况下往完成的反应批次中加入Iml乙腈，离心反应批次，并转移至HPLC分析容器(lmg/ml)。通过HPLC(Nucleodur1005C18ec，125mm，直径4mm，Macherey-Nagel)分析反应批次。应用了Iml/分钟的流速和乙腈⑶及水㈧的溶剂系统。用从40%至80%递增线性梯度的乙腈可在10分钟内分离式I、II和III的化合物。保持的时间是(酮式I)10.0分钟，(R，S-化合物式11)9.3分钟，以及(S，S-化合物式111)8.5分钟。结果_批次A_批次B_<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例4通过氧化还原酶SEQIDNO1将式I化合物转化为式II化合物(R,S-化合物)为将式I化合物转化为式II化合物(R，S-化合物)，在每种情况下将2.25mlSEQIDNo1的酶悬浮液(参见实施例1D)和75单位(=2ml)过表达的来自Thermoanerobiumbrockii的醇脱氢酶加入到3ml缓冲液(IOOmMΤΕΑ,ρΗ=8，10%甘油)、1.5g式I化合物、0.3mgNADP和7ml4-甲基-2-戊醇的混合物中。在室温中在恒定完全的混合下温育该反应混合物。48h后，超过95%的所使用的式I化合物被还原为式II化合物。对映体过量总计>98%。实施例5通过氧化还原酶SEQIDNO5将式I化合物转化为式III化合物(S,S-化合物)为进一步将式I化合物转化为式III化合物(S，S-化合物)，在Eppendorf反应容器中温育600μ1缓冲液(IOOmMΤΕΑ,ρΗ=9)、200μ12-丙醇、50mg式I化合物、0.ImgNAD和200μ1SEQIDNO5的酶悬浮液(参见实施例1D)的混合物。在室温中在恒定完全的混合下温育该反应混合物。48h后，超过90%的所使用的式I化合物被还原为式III化合物(S，S)。对映体过量总计>98%。序列表氨基酸序列SEQIDNo1木兰假丝酵母CBS6396蛋白质序列羰基还原酶1mnalvtggsrgigeaiatklaedgysvtiasrgidqlnkvkaklpvvregqthhvwqldl61sdaeaassfkgaplpassydvlvnnagvtdpspiakqsdseihklfsvnllspvaltkty121vqavtgkpretpahiifissgvairgypnvavysatksgldgfmrslarelgpegvhvnt181vspgltktemasgvslddfppspiggwiqpeaiadavrylvksknitgtilsvdngitvSEQIDNo2木兰假丝酵母JOLMM蛋白质序列羰基还原酶1mpstlnalvtggsrgigeatavklaeegygitlaardikklndvkaklptikqgqehhvw61qldladvqaalelkgaplpaskydllvanagvsahvptaehddahwqnvitinlssqial121tqalvraigersdeapfhivyvssiaalrgnpmsavysaskagldgfarsisrelgpkgi181hvntvhpgltktdmtvrmrpaedqpikgwvlpdaiadavvflaksknitgtnivvdngrv241νSEQIDNo3CandidageocharesMUCL29832蛋白质序列羰基还原酶1mssvpassssssptlnalvtgasrgigeataiqlasqgysvtlasrgleqlkavkaklpl61vrqgqthhvwqldladvaaagsfkgaplpassydvlvsnagvalfspigdqadedwqrml121avnltspialtkalvkaiadkprenpahiifvssavslrgyplvgvysatkagldgftrs181lahelgpkrihvn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61acgaaggccctcttgaaggatgtctccgaaaggcctgtggacaagccactgcagattatc421tacatttcgtcggtggccggcttgcatggcgccgcgcaggtcgccgtgtacagtgcatct481aaggccggtcttgatggttttatgcgctccgtcgcccgtgaggtgggcccgaagggcatc541catgtgaactccatcaaccccggatacacgaagactgaaatgaccgcgggcattgaagcc601cttcctgatttgcctatcaaggggtggatcgagcccgaggcaattgctgacgcggttctg661tttctggcaaagtccaagaatatcaccggcacaaacattgtggtcgacaatggcttgatt721gcttaaSEQIDNo25木兰假丝酵母ATCC12573蛋白质序列羰基还原酶1atgtcttatcaaatgtcttcttctgctccatcctccacctccctgaatgcgcttgtcacg61ggcggcagccgcggcattggcgaagccactgccattaagctcgccgaggagggctacagc121gtcacgattgcgtctcgcggccttaagcagctcgaggctgtgaaggccaaactacccatt181gtgaagcagggacaggttcaccacgtgtggcagcttgatctcagtgatgtcgacgctgcg241gccgccttcaaagggtcgccgctacctgccagccgctacgacgtgctcgtcagcaatgct301ggcgtggcccagtttagcccgttcatcgagcatgcgaagcaggactggtcgcagatgctt361gccatcaatctggcggcacccattgcgctggcccagacatttgctaaggccattggcgac421aagccgcgcaacacaccggcccacattgtgtttgtctcgtcgaacgtctcgttgcgaggc481ttcccgaacatcggcgtctacacggccacgaaagccggcattgacggcttcatgcgctcg541gtcgcacgcgaactggggcccagcggcattaacgtgaactccgtgaaccccgggcccacg601cggacggagatgacgaagggcattgacgtcggcacgatcgatatgccgatcaagggctgg661atcgagcccgaggcgattgcggatgccgtgctcttcgtggtcaagtcgaagaacattacg721ggcacgaccgttgttgtcgacaacggctcctccgcttgaSEQIDNo26木3假丝酵母DSM70639蛋白质序列羰某还原酶1atgaccacctcctccacctcctcctccacctcctcccgctctctaaacgctcttgtcacc61ggcgctagccgcggcattggcgaggccactgcaatcaagctagcatctgagggatacagc121gttacgcttgcatctcgtagcctcgagcagctcaaggctttgaaggagaagttgcccgtt181gtgaagcagggccagacgcaccacgtctggcagctcgacttgagcgacgtcgacgccgct241gccacgttcaagggctcccccttgccggccagcagctacgacgccgtcatcagcaatgcc301ggtgttgctcagttctctccgttgtcggaacacgccagggaggactggtctcagatgctg361acgatcaacctcgcggctcccattgccctcgcgcaggcgtttgtgaaggccattggcgac421aagaagcgcgacatcccggcccaaattgtctttgtttcgtcgaatgtcgtgatgcgtggc481ctcccttacctcggcatctacacggcttcgaaggctggtatcgatggcttcatgcgctcg541gccgcccgcgagctgggacccaagggtatcaacgtgaactcagtaaacccgggcgccacg601cagaccgagatgacgaagggcgttgatgtcaacgccctcgacctgccgatcaagggatgg661attcagctcgaggctgtcgcggacgccgtgctcttcgtggtccagtcgaagaacattacc721ggcacgacgattgttgtcgacaacggctccgtcgcttgaSEQIDNo27木兰假丝酵母CBS2798蛋白质序列羰基还原酶1atgaatgccttagttactggtgcgagccgcgggatcggcgaagcaattgcggtgaagctg61gccgaggacgggtacagcgtgacactggcctcgcgctctcttgaaaagctggagtcgctc121aagaaagggctgccggtcgtgaaggacggccaagcacatcatgtatgggagcttgatctc181ggtgatgttgatgccgcgtcatccttcaagggggcgcctctgcctgccgaggcctatgac241gtgttcgtcagtaacgctggaatggccaaatccaccttgatggtagaccatcccattgac301gagctgcaggacatgattaacgtgaatcttgtgtcgccaattgcactcacacagggcctt361gtcaaggctctgacagaatctaagcgagacaagcctgcgcatatcgtgttcatgtcgtcc421atccgctcgttcaggggcattccgaatggcgcggtgtacagcgccacaaagagtggtctt481gacggattcatgcgatccattgcgcgagagctgggccctcagggcatccacgtcaactct541gtgtgccccggattcgtgcaaacggaaatgacgcgcaaggttgatatggagtcgaagaaa601gaccagctacccatcgccggctggatccagcccgacgcgattgctgacaccgttctgttt661tttgtgaaatcgaagaacatcacgggccaggcaattgtcgttgacaatggcatcactgtc721tgaSEQIDNo28CandidagropengoesseriMUCL29836蛋白质序列羰基还原酶1atgccctctggactcaatgctcttgtcactggcggcagccgcggaatcggcgctgccgct61gctaccaagctcgccgctgcaggatacaacgtcacggttgcgtcccgcggggtcgaggct121ctgaataaggtcaaggcctccttgcctgttgtcaaggagggccagcagcaccatgtctgg181cagctcgacgtaagcgatctcgcagcggtgtctggcttcaagggatctccgctgccggct241aagagctacgatgttgttgttgttaacgccggcgtcgcgaacctgagcccgctggctgcc301caggacgacgacgtcattcagaacattgtgaccgtgaacctgctgtcgccgattgcgctg361gtgaagtcgctgatcaaggcgtacggcgagggtcctcgcgcgacaccggcccacattgtg421tttgtgtcgtcggtggccgcgatccgtgggttccccaacggcgccgtctatagctcgacg481aagagtgcgctcgacgggctgacgcggtcgctggcgaaggagctggggccccagaacatc541cgggtcaactccgtgaaccccggcttcacgaggaccgagctggccagcggcgtcgacatt601gacgccgtgacgcagagctctccgatcaaggggtgggttgagccggaggcgattggcgat661gcgattttgtttctcgcgacgtcgaaccacatcacgggcacgatcaccgtcatcgacaac721ggcactagcgcgtagSEQIDNo29假丝酵母属物种MUCL40660蛋白质序列羰基还原酶1atgtcctcctcttcctcctcgactcctctcaacgctctcgtcaccggtgccagccgcggc61atcggtgaggtcatctctctccagctcgccaacgagggctacaatgttaccctcgcagcc121cgcagtcttgacgacctcaatgcggtgaaggctaagctccctatcgtaagggatgcccag181aagcactctgtctggccgctcgacattagcgatatcgacgccgtgacgaacttcaaggga241tcgcccctgccggccgagaagtacgatctgttcgtcagcaacgccggcgtggtcgacttc301gctccgcttgtccaccagagccccgagagcatcagcagcctgttcaatgtgaacctaatc361gcgcctgttgccttgacaaaagctcttcttaaggcgttcggtgacagccctcgcaagact421acgactcactttatctacgtttcgtccgttgttgccctccgcggcttccccaatgttgcg481gtttacagctcctccaagagcggcctcgacgggtttgtgcgctcccttgccgccgaggtt541gctccgctcaacatccgcgtcaactccattaacccaggccctaccaagactgagatgacc601gcttccctggatgttgaggcgtttactgcgggcaaccccatcaagggttggatttacccc661gatgctattgctgatggagtggtgtacctggcgaagtcgaagaacattactggtatcacc721ctccaagtcgacaacggcgccggcatctaaSEQIDNo30CandidavacciniiCBS7318蛋白质序列羰基还原酶1atgaggtcgacacctaacgcccttgtgactggcggcagccgcggcattggcgcggccgct61gcaattaaactcgccgaggcaggctacagcgtgacgctcgcgtcgcgcggtctcgacaag121ctcaacgaggtgaaggccaagcttcctgtcgtgaagcagggccaggagcaccatgtatgg181cagcttgatctcagcgacgtgcaggccgcgctcgagttcaagggcgcaccgctgcccgcg241agtaagtacgatttgtttgtctcgaacgccggcgtggctactttctcgccaacggctgag301catgacgacaaggactggcagaacattattgccgtgaacttgacatcgcccattgccatt361acgaaggcgctcgttaaggccgttggcgagcgctcaaacgataacccgtttcagatcgcg421ttcctgtcatcggcggccgccctgcgcggtgtgccgcagaccgctgtttacagcgctacg481aaggccggcctcgacggcttcacgcgctcgctcgccaaggagctcggcccaaagggcatc541catgtgaacatcgtacaccctggatggacgcagaccgagatgactgcgggtgtagatgag601cctagggatacgcccatcccgggctggatccagccggaagccatcgccgaggccattgtg661tatctcgcgaagtcaaagaacatcacgggaacgaacatcgttgtcgacaacggcctgact721atttaaSEQIDNo31氨基酸序列部分nalvtgasrgigSEQIDNo32氨基酸序列部分nalvtggsrgigSEQIDNo33氨基酸序列部分gysvtSEQIDNo34氨基酸序列部分gynvtSEQIDNo35氨基酸序列部分gygitlSEQIDNo51氨基酸序列部分gygvtSEQIDNo36氨基酸序列部分vlaklpSEQIDNo37氨基酸序列部分vkaklpSEQIDNo38氨基酸序列部分fkgaplpaSEQIDNo39氨基酸序列部分frgaplpaSEQIDNo40氨基酸序列部分IkgaplpaSEQIDNo41氨基酸序列部分spialtkSEQIDNo42氨基酸序列部分spvaltkSEQIDNo43氨基酸序列部分sqialtqSEQIDNo44氨基酸序列部分avysaskSEQIDNo45氨基酸序列部分avysatkSEQIDNo46氨基酸序列部分gvysatkSEQIDNo47氨基酸序列部分pikgwiSEQIDNo48氨基酸序列部分piegwiSEQIDNo49氨基酸序列部分piggwiSEQIDNo50氨基酸序列部分pisgwiSEQIDNo52氨基酸序列部分fkaaplpaSEQIDNo53氨基酸序列部分fkgsplpaSEQIDNo54氨基酸序列部分gigratSEQIDNo55氨基酸序列部分gigrasaSEQIDNo56氨基酸序列部分gigretSEQIDNo57氨基酸序列部分nnagigSEQIDNo58氨基酸序列部分nnagiegSEQIDNo59氨基酸序列部分irvvaiapgSEQIDNo60氨基酸序列部分irvnaiapgSEQIDNo61氨基酸序列部分irvnaicpgSEQIDNo62氨基酸序列部分irvvgiapgSEQIDNo63氨基酸序列部分peqiagavSEQIDNo64氨基酸序列部分peaianavSEQIDNo65氨基酸序列部分peevanav.SEQIDNo66氨基酸序列部分peaianavSEQIDNo67GGGAATTCCATATGATGCTCGAGGGGAAGGTCGSEQIDNo68CACATGCATGCGAATGCTCGAGGGGAAGGTCSEQIDNo69CCCAAGCTTATTACTTGAACTCCGCGTAGCCGTCSEQIDNo70RubrobacterxylanophilusDSM9941核酸序列羰基还原酶半合成latgctggaaggtaaagtggcagtcatcaccggtgcaggcagcggcattgggcgtgccact6lgcgctgcgttttgcgcgtgaaggcgctcgcgtcgttgtggccgagctggatgaacgtcgc12lggtgaggaagttgtacgtgagattctggaatctggcggggaggccgtcttcgtgaggacg18lgacgtctcggagttcgagcaggttgaggccgccgtcgagcgcgccgtcgaggagtacggg241acgctggacgtcatgttcaacaacgccggcatcgggcactacgcccccctgctggagcac30lgacccggagcactacgaccgggtggtccgggtgaaccagtacggcgtctactacgggata36lctcgccgccggcaggaagatggccgagctggagaaccccggcgtgatcatCaaCaCCgCC42ltcggtctacgctttcctggcctcccccggtgtgatcggctatcacgcttccaagggggcg]48lgtgaagatgatgacccaggccgcagccctggagctcgccccccacggcatacgggtcgtc541gccatcgccccgggcggggtggacaccccgatcatccagggctacaaggacatgggcctc601ggtgagcggctggcccgcggccagatgcgtcgcaggctccagacccccgagcagatcgcc66lggcgccgtcgtcctgctcgccaccgaggaggcagacgccataaacggctcggtggtgatg72laccgacgacggctacgcggagttcaagtaaSEQIDNo7lCCTAGCTAGCATGCTGGAAGGTAAAGTGGCSEQIDNo72CCTTTRCCTGCIuGCAGC／AYGSEQIDNo73GGCTGGATCCAGCCCTTRA／SGGSEQIDNo74GGAATTCCATATGATGAACGCTCTAGTGACCGGTGGTAGSEQIDNo75CCCAAGCTTATTAAACCGTGATTCCGTTGTCAACTGAC权利要求将通式I酮化合物对映选择性酶还原为通式II羟基化合物(R，S-化合物)的方法，其中，R可以表示氨基官能的任何保护基团(叔丁氧羰基(BOC)、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基)且X＝-Cl、-CN、-OH、Br、F，其中R和X具有与式I相同的含义，所述的酮化合物在辅因子的存在下被氧化还原酶还原，其特征在于通过氧化通式RXRYCHOH的仲醇持续地再生形成的氧化的辅因子NAD或NADP，其中RX，RY独立地表示氢、支链或非支链C1-C8-烷基并且C总≥3。FPA00001064678700011.tif,FPA00001064678700012.tif2.将通式I酮化合物对映选择性酶还原为通式II羟基化合物(R，S-化合物)的方法，<image>imageseeoriginaldocumentpage2</image>(I)其中，R可以表示氨基官能的任何保护基团(叔丁氧羰基(BOC)、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基)且X=-Cl、-CN、-0H、Br、F，<image>imageseeoriginaldocumentpage2</image>(II)其中R和X具有与式I相同的含义，所述的酮化合物在辅因子的存在下被氧化还原酶还原，其特征在于所述氧化还原酶a)包含根据SEQIDNO1,SEQIDNo2，SEQIDNo3或SEQIDNo4的氨基酸序列，或b)包含这样的氨基酸序列，其中至少65%的所述氨基酸与氨基酸序列SEQIDNO:1，SEQIDNo2或SEQIDNo3,SEQIDNo4的那些相同，或c)包含这样的氨基酸序列，其中至少72%的所述氨基酸与氨基酸序列SEQIDNO:1，SEQIDNo2或SEQIDNo3,SEQIDNo4的那些相同，或d)由核酸序列SEQIDNO16,SEQIDNo17，SEQIDNo18，SEQIDNo19编码，或e)由在严格条件下与SEQIDNO16,SEQIDNo17，SEQIDNo18，SEQIDNo19杂交的核酸序列编码，或f)具有220至260个氨基酸的长度，并且包含一个或若干个选自序列SEQIDN0:31至SEQIDNO51的部分序列，并且优先将式I化合物还原为式II化合物。3.将通式I酮化合物对映选择性酶还原为通式III羟基化合物(S，S-化合物)的方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中，R可以表示氨基官能的任何保护基团(叔丁氧羰基(BOC)、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基)且X=-Cl、-CN、-0H、Br、F，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R和X具有与式I相同的含义，所述的酮化合物在辅因子的存在下被氧化还原酶还原，其特征在于通过氧化通式RxRyCHOH的仲醇持续地再生形成的氧化的辅因子NAD或NADP，其中Rx，Ry独立地表示氢、支链或非支链C1-C8-烷基并且彡3。4.将通式I酮化合物对映选择性酶还原为通式III羟基化合物(S，S-化合物)的方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中，R可以表示氨基官能的任何保护基团(叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基)且X=-Cl、-CN、-0H、Br、F，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R和X具有与式I相同的含义，所述的酮化合物在辅因子的存在下被氧化还原酶还原，其特征在于所述氧化还原酶a)包含根据SEQIDNO:5，SEQIDNo6，SEQIDNo7,SEQIDNo8，SEQIDNo9,SEQIDNolO,SEQIDNoll,SEQIDNol2,SEQIDNol3,SEQIDNol4,SEQIDNol5的氨基酸序列；或b)包含这样的氨基酸序列，其中至少65%的所述氨基酸与根据SEQIDNO:5，SEQIDNo6，SEQIDNo7,SEQIDNo8，SEQIDNo9,SEQIDNo10,SEQIDNoll,SEQIDNol2,SEQIDNol3,SEQIDNol4,SEQIDNol5的氨基酸序列的那些相同，或c)由核酸序列SEQIDNO:20，SEQIDNo21，SEQIDNo22,SEQIDNo23，SEQIDNo24，SEQIDNo25,SEQIDNo26,SEQIDNo27,SEQIDNo28,SEQIDNo29或SEQIDNo30编码，或d)由在严格条件下与SEQIDNO20,SEQIDNo21，SEQIDNo22，SEQIDNo23，SEQIDNo24,SEQIDNo25,SEQIDNo26,SEQIDNo27,SEQIDNo28,SEQIDNo29或SEQIDNo30杂交的核酸序列编码；或e)具有220至260个氨基酸的长度，并且包含一个或若干个选自序列SEQIDN0:31至SEQIDNO66的部分序列，并且优先将式I化合物还原为式III化合物。5.权利要求2或4任一项的方法，其特征在于持续地再生形成的氧化的辅因子NAD或NADP。6.权利要求2、4或5任一项的方法，其特征在于通过氧化通式RxRyCHOH的仲醇持续地再生形成的氧化的辅因子NAD或NADP。7.权利要求1-6任一项的方法，其特征在于将2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇或2-辛醇分别用作共底物或仲醇。8.权利要求1-7任一项的方法，其特征在于添加附加的氧化还原酶/脱氢酶用于辅因子的再生。9.权利要求1-8任一项的方法，其特征在于式I化合物以>20g/l，优选>50g/l且特别优选>100g/l的浓度存在于反应批次中。10.权利要求1-9任一项的方法，其特征在于TTN(总转化数=还原的式I化合物mol/所使用的辅因子mol)彡IO3011.权利要求1-10任一项的方法，其特征在于其在水有机两相系统中进行。12.权利要求1-11任一项的方法，其特征在于还应用了有机溶剂，例如，诸如二乙醚、叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷或环己烷。13.权利要求1-11任一项的方法，其特征在于应用式IV的特定化合物作为酮化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>14.氨基酸序列SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO11，SEQIDN0:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14禾口SEQIDNO:15的多月太。15.与氨基酸序列SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO11，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14禾口SEQIDNO15之一至少65%、优选70%以及特别优选超过75%相同的多肽。16.可通过替换、插入、缺失或添加至少一个氨基酸来源于序列SEQIDNO1,SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO14和SEQIDNO15的多肽。17.由核酸序列SEQIDNO16,SEQIDNO17,SEQIDNO18,SEQIDNO19,SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28，SEQIDNO29或SEQIDNO30编码的多肽。18.由在严格条件下与序列SEQIDNO:16，SEQIDNO:17，SEQIDNO:18，SEQIDNO19，SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28，SEQIDNO29或SEQIDNO30之一杂交的核酸序列编码的多肽。19.具有220至260个氨基酸的长度，包含一个或若干个选自序列SEQIDN0:31至SEQIDNO51的部分序列，并且优先将式I化合物还原为式II化合物的多肽。全文摘要对映选择性酶还原通式I酮化合物的方法，其中，R可以表示氨基官能的任何保护基团(叔丁氧羰基(BOC)、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基)且X＝-Cl、-CN、-OH、Br、F。文档编号C12P7/04GK101809158SQ200880108175公开日2010年8月18日申请日期2008年9月22日优先权日2007年9月27日发明者A·古普塔,A·申茨彻尔,M·博布科瓦申请人:Iep有限责任公司