编码细胞壁甘露糖蛋白的基因及其用途的制作方法

专利名称：编码细胞壁甘露糖蛋白的基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码细胞壁甘露糖蛋白(mannoprotein)的基因及其用途，特别是涉及制造降低了混浊生成能力的酒类的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类及其制造方法等。更具体地说，本发明涉及通过提高编码酿造酵母的细胞壁甘露糖蛋白的Cwp2p的ScCWP2基因或特别是啤酒酵母中的特征性的nonScCwp2基因的表达量，可使产品中的混浊降低的酵母及使用该酵母的酒类制造方法等。
背景技术：
酒类中，有以糖类、淀粉质等为原料，由酵母等的作用，通过乙醇发酵制造的葡萄酒、啤酒、清酒等的酿造酒。
例如，啤酒是以麦芽为主原料通过糖化得到麦芽汁，用此麦芽汁和酵母进行主发酵，之后嫩啤酒进行后发酵(贮酒)过程，再经过过滤、灌装入瓶工序来制造。如此制造的啤酒等的酿造酒(特别是色泽浅的酒)，从制造出后到消费期间不产生混浊的所谓“混浊稳定性”在酿造酒的品质上是极为重要的项目。
例如啤酒混浊的原因大致区分为生物学混浊和非生物学混浊2类。生物学的混浊是由微生物的混入引起的。非生物学混浊是由于啤酒成分自身的变性所引起的混浊，例如，由蛋白质成分和多酚结合引起的总称为混浊蛋白的蛋白质成分的生成(K.Asano et al.，ASBC Journal 40147-154，1982；J.A.Delcour et al.，MBAA Technical Quarterly，2562-66，1988)。一般地，通常生成的混浊是非生物学混浊。非生物学混浊的原因物质、形成机理等虽未被详细解明，但近年来认为，来自酵母的细胞壁成分(甘露糖蛋白等)与来自麦芽、啤酒花的蛋白质成分、多酚等通过结合，会逐渐形成大的粒子。
近年来发现，从酵母上的甘露糖蛋白的分离程度与啤酒混浊的强度间有良好的相关性 (F.Omura et al.，30thEBC Congress SUMMARIESPRESENTATIONS，19，2005)。Cwp2p是构成细胞壁的主要甘露糖蛋白之一，具有细胞壁稳定化、低pH值时的抵抗性的作用(M，Skrzypek et al.，Curr Genet，38，191-201，2000)。

发明内容
如上所述，虽然非生物学混浊的原因物质、形成机理等还未被详细解明，但在酿造酒的品质管理上强烈需要降低此种非生物学混浊。
本发明者等为解决上述课题不断锐意研究的结果，从啤酒酵母中成功地鉴定·分离出了编码细胞壁甘露糖蛋白的的基因。且制备了将所得基因导入酵母并使其表达的转化酵母，确认了混浊生成量的减少，从而完成了本发明。
即本发明涉及啤酒酵母中的特征性存在的编码细胞壁甘露糖蛋白基因、该基因编码的蛋白质、调节了该基因表达的转化酵母、通过使用调节了该基因表达的酵母以控制产品中混浊的方法等。具体地说，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒类的制造方法等。
(1)从以下(a)～(f)组成的组中选择的多核苷酸(a)含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有编码由序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所组成的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有与序列号1中的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有与编码序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
(2)上述(1)中所述的多核苷酸，其从以下(g)～(i)组成的组中选择(g)含有编码由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列中1～10个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所组成的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有与序列号1的碱基序列组成的多核苷酸、或序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在十分严格条件下杂交，且编码作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。
(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
(5)上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。
(6)一种蛋白质，其由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码。
(7)一种载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。
(7a)上述(7)中所述的载体，其含有具有以下(x)～(z)组成要素的表达框架(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)上述(1)～(5)中所述的多核苷酸，其与该启动子以正向结合；以及(z)与RNA分子的转录终止及多腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号。
(8)一种载体，其含有从以下(j)～(1)组成的组中选择的多核苷酸。
(j)含有编码由序列号4的氨基酸序列或序列号4的氨基酸序列中1～10个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所组成的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；
(k)含有编码具有与序列号4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；及(1)含有与序列号3的碱基序列组成的多核苷酸、或序列号3的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在十分严格条件下杂交，且编码作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
(9)一种酵母，其中导入了上述(7)或(8)中所述的载体。
(10)上述(9)中所述的酵母，其通过导入上述(7)或(8)中所述的载体，降低了混浊的生成能力。
(11)上述(10)中所述的酵母，其通过使上述(6)中所述的蛋白质的表达量增加，降低了混浊的生成能力。
(12)一种酒类的制造方法，其使用上述(9)～(11)中任一项所述的酵母。
(13)上述(12)中所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是麦芽饮料。
(14)上述(12)中所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是葡萄酒。
(15)一种酒类，其用上述(12)～(14)中任一项所述的方法制造。
(16)一种评价方法，其是使用根据编码具有序列号1或序列号3碱基序列的细胞壁甘露糖蛋白的基因的碱基序列而设计的引物或探针，评价被检酵母的混浊生成能力的方法。
(16a)根据上述(16)中所述的方法，选别降低了混浊生成能力的酵母的方法。
(16b)使用通过上述(16a)中所述方法选别的酵母制造酒类(例如啤酒)的方法。
(17)一种评价方法，其为通过培养被检酵母，测定编码具有序列号1或序列号3碱基序列的细胞壁甘露糖蛋白的基因的表达量，评价被检酵母的混浊生成能力的方法。
(18)一种酵母的选择方法，其为培养被检酵母，对上述(6)中所述的蛋白质定量或测定编码具有序列号1或序列号3碱基序列的细胞壁甘露糖蛋白的基因的表达量，选择与目标混浊生成能力相应的前述蛋白质量或前述基因表达量的被检酵母。
(18a)酵母的选择方法，其为培养被检酵母，测定混浊生成能力，选择目标混浊生成能力的被检酵母。
(19)上述(18)中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，测定编码具有序列号1或序列号3碱基序列的细胞壁甘露糖蛋白的基因在各酵母中的表达量，选择该基因比标准酵母高表达的被检酵母。
(20)上述(18)中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，对各酵母中上述(6)中所述的蛋白质定量，选择该蛋白质量比标准酵母多的被检酵母。即上述(18)中所述的酵母的选择方法，其为培养多种酵母，对各酵母中上述(6)中所述的蛋白质定量，选择其中该蛋白质量多的被检酵母。
(21)一种酒类的制造方法，其特征在于，使用上述(9)～(11)中所述的酵母及通过上述(18)～(20)中所述的方法选择的酵母中的任一种酵母，进行用于酒类制造的发酵，调节混浊的生成量。
根据使用本发明的转化酵母的酒类制造法，因通过细胞壁甘露糖蛋白可使酵母的细胞壁结构稳定化，所以可制造将啤酒酿造及产品中的混浊量抑制到很低水平的酒类。


图1是表示实施例2的啤酒试验酿造中酵母增殖量的经时变化图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。
图2是表示实施例2的啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。
图3是表示实施例2的啤酒试验酿造中酵母的nonScCWP2基因表达变动图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。
图4是表示此实施例的啤酒试验酿造中酵母增殖量的经时变化图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。
图5是表示此实施例的啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。
图6是表示实施例6的啤酒试验酿造中酵母的ScCWP2基因表达变动图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。
图7是表示此实施例的啤酒试验酿造中酵母增殖量的经时变化图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。
图8是表示此实施例的啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。
具体实施例方式
本发明者等认为，通过使酵母的细胞壁甘露糖蛋白增大，可使酵母的细胞壁稳定化。基于此设想反复进行了研究，以用日本特开2004-283169号公报中公开的方法解读的啤酒酵母基因组信息为基础，分离·鉴定了编码啤酒酵母特有的细胞壁甘露糖蛋白的nonScCWP2基因。将该基因的碱基序列、及由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列，分别用序列号1或序列号2表示。另外，以用日本特开2004-283169号公报中公开的方法解读的啤酒酵母基因组信息为基础，分离·鉴定了编码啤酒酵母的细胞壁甘露糖蛋白的ScCWP2基因。该基因的碱基序列、及由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列，分别用序列号3或序列号4表示。另外，ScCWP2也可从S.cerevisiae基因组数据库(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)获得。
1.本发明的多核苷酸首先，本发明提供(a)含有由序列号1或序列号3的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；及(b)含有编码由序列号2或序列号4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。
作为本发明对象的多核苷酸，不只限于编码来自上述啤酒酵母的细胞壁甘露糖蛋白的多核苷酸，还包含编码与此蛋白质具同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能相同的蛋白质，例如，可例举为(c)由序列号2或序列号4的氨基酸序列中1个或多个的氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所组成的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质(构成细胞壁的甘露糖蛋白)。
此种蛋白质，在序列号2或序列号4的氨基酸序列中，例如，可为由1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个的氨基酸残基缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所组成的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质。上述氨基酸残基缺失、取代、插入及/或付加的数量，一般愈小愈好。此种蛋白质可例举为具有(d)与序列号2或序列号4的氨基酸序列有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的氨基酸序列，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质。上述同源性的数值一般愈大愈好。
另外，是否是作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质，例如可通过将样品用SDS-电泳按分子量分离，对其样品，利用刀豆蛋白A的植物凝集素识别甘露糖蛋白的甘露糖部分并与其结合的性质，使用affinoblotting(Faye Land Chrispeels MJ，Anal Biochem，1985)的手法进行检测。
另外，本发明也包含(e)含有与序列号1或序列号3碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有与编码由序列号2或序列号4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
此处的“在严格条件下杂交的多核苷酸”，是指以序列号1或序列号3的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸、或编码序列号2或序列号4的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。杂交方法，例如可利用Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons 1987-1997等中所述的方法。
本说明书中所述的“严格条件”可为低严格条件、中严格条件、十分严格条件中的任一种。“低严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“十分严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效地获得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影响杂交严格性的因素可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适宜选择这些因素，均可实现同样的严格条件。
还有，杂交中使用市售的试剂盒时，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，与标记了的探针进行一夜培养后，将膜在55℃的条件下，用含有0.1％(w/v)SDS的洗涤缓冲液1次洗涤之后，可检测杂交后的多核苷酸(例如DNA)。
此外，可杂交的多核苷酸，通过FASTA、BLAST等同源性搜索软件，使用默认值(default)计算时，可为与编码序列号2或序列号4的氨基酸序列的多核苷酸有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的多核苷酸。
还有，氨基酸序列、碱基序列的同一性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc NatlAcad Sci USA 905873，1993)决定。开发了基于BLAST算法、被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et alJ.Mol.Biol.215403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认值(default)参数。
2.本发明的蛋白质本发明也提供由上述多核苷酸(a)～(1)中任一种编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质，是由序列号2或序列号4中的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列组成的，且具有作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质(本说明书中有时仅称为“细胞壁甘露糖蛋白”)。
此种蛋白质可例举为由序列号2或序列号4的氨基酸序列中上述数量的氨基酸残基缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所组成的，且具有作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质。另外，此种蛋白质，可例举为含有与序列号2或序列号4的氨基酸序列具有如上述同源性的氨基酸序列，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质。此种蛋白质，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols in Molecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定点诱变法获得。
本发明的蛋白质氨基酸序列中1个以上的氨基酸残基被缺失、取代、插入及/或附加，是指在同一序列中任意的、且1个或多个氨基酸序列的位置上，有1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入及/或附加之意，缺失、取代、插入及附加中的2种以上也可同时发生。
以下，举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻-甲基丝氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、环己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosubericacid)；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组苯丙氨酸、酪氨酸。
本发明的蛋白质可通过Fmoc法(芴基甲氧基羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等的化学合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Farumashia公司制、Protein TechnologiesInstruments公司制、Synthecell-Vega公司制、Perceptive公司制、岛津制作所公司制等的肽合成机进行化学合成。
3.本发明的载体及导入了该载体的转化酵母其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(1)中任一项所述的多核苷酸(DNA)。本发明的载体通常由含有(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)与该启动子以正向或反向结合的、上述(a)～(1)中任一项所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)含有与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号作为构成因子的表达框架构成。
导入酵母时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，YEp型载体中的YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，AcademicPress，New York，83，1983)、YCp型载体中的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型载体中的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USP，76，1035，1979)均已为人所知，且易获得。
用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子，如能在酿造用酵母中起作用，同时又不受醪液中成分的影响，可任意组合。例如可利用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因已被克隆，例如可通过M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中详细记载的已知方法很容易地获得。
因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以，转化时使用的选择性标记可利用耐氨基糖苷类抗生素(Geneticin)基因(G418r)、耐铜基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、耐浅蓝菌素基因(fas2m，PDR4)(分别为猪腰淳嗣等，生化学，64，660，1992；Hussain etal.，gene，101，149，1991)等。
如上所述构建的载体被导入宿主酵母。宿主酵母，为可用于酿造的任意的酵母，例如可为啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，虽可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母，但在本发明中，可使用啤酒酵母例如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456等，酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且，可使用威士忌酵母，例如酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NCYC90等；还可使用例如协会葡萄酒用1号、同3号、同4号等的葡萄酒酵母；例如协会酵母、清酒用7号、同9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)。
酵母的转化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、醋酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methodsin yeast genetics，2000 EditionA Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法实施，但不限于此。
更具体地说，将宿主酵母置于标准酵母营养培养基(例如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养，使OD600nm的值为1～6。将此培养酵母离心分离后收集、洗涤，用浓度约为1～2M的碱金属离子、优选锂离子进行预处理。将此细胞在约30℃条件、静置约60分钟后，与导入的DNA(约1～20μg)同时在约30℃条件、静置约60分钟。加入聚乙二醇，优选加入约4,000道尔顿(Dalton)的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。在约30℃、静置约30分钟后，将此细胞在约42℃条件、加热处理约5分钟。优选将此细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤后，放入所定量的新鲜标准酵母营养培养基中，约30℃、静置约60分钟。之后，接种到含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基中，获得转化体。
其他有关一般性的克隆技术，可参照(《分子克隆》第3版)、“Methodsin Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本发明的酒类制造方法及根据其制法获得的酒类将上述本发明的载体导入适合酿造的需制造酒类的酵母中，并可通过使用其酵母，制造所需要的、且减少了混浊生成量的酒类。另外，通过下述本发明的酵母评价方法选择的酵母也可同样使用。作为制造对象的酒类并不限于此，例如可为啤酒、发泡酒等的啤酒味饮料，葡萄酒、清酒等。
制造上述酒类时，除使用本发明中所得到的酿造酵母代替亲株以外，可利用公知的手法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往完全相同，不会为制造减少了混浊生成量的酒类而增加成本。即根据本发明，可在使用已有设施、不增加成本的情况下，制造出混浊稳定性等优异的酒类。
5.本发明的酵母的评价方法本发明涉及使用根据编码具有序列号1或序列号3碱基序列的细胞壁甘露糖蛋白的基因碱基序列而设计的引物或探针，评价被检酵母的混浊生成能力的方法。此种评价方法的一般手法为公知，例如，如WO 01/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等的记载。以下，就此评价方法进行简单说明。
首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因组为对象，使用根据编码细胞壁甘露糖蛋白的基因的碱基序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，测定被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异性序列。引物或探针的设计可使用公知的手法进行。
基因或特异性序列的检测，可使用公知的手法进行。例如，将含有包含特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一种引物使用，另一种引物使用含有包含此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸，通过PCR法扩增酵母的核酸，并测定扩增物的有无、扩增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的碱基数通常为10bp以上，优选为15～25bp。另外，夹在两引物间的碱基数，通常300～2000bp较为适当。
PCR法的反应条件无特别限定，例如，可使用变性温度90～95℃、退火温度40～60℃、延伸温度60～75℃、循环数10次以上等的条件。所得到的反应生成物可使用琼脂糖凝胶等的电泳法等分离，测定扩增产物的分子量。根据此方法，通过扩增产物的分子量是否含有特异部分的DNA分子的大小，来预测·评价其酵母的混浊生成能力。另外，通过分析扩增物的碱基序列，可进一步更正确地预测·评价上述性能。
本发明中，可通过培养被检酵母，测定编码具有序列号1或序列号3碱基序列的细胞壁甘露糖蛋白的基因的表达量，评价被检酵母的混浊生成能力。还有，基因表达量的测定，可通过培养被检酵母，对编码细胞壁甘露糖蛋白的基因的产物mRNA或蛋白质进行定量来进行。mRNA或蛋白质的定量，可使用公知的手法。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量的RT-PCR等，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。通过测定培养被检酵母时所得到的发酵液中的混浊量，也可预测该被检酵母中的上述基因的表达量。
而且，通过培养被检酵母，测定具有序列号1或3碱基序列的本发明的基因表达量，选择与目标混浊生成能力相应的基因表达量的酵母，可选择适合酿造所需酒类的酵母。另外，培养标准酵母及被检酵母，测定各酵母中前述基因的表达量，比较标准酵母和被检酵母的前述基因表达量，以选择所需的酵母。具体地说，例如，可通过培养标准酵母及被检酵母，测定编码具有序列号1或序列号3碱基序列的细胞壁甘露糖蛋白的基因在各酵母中的表达量，选择该基因比标准酵母高表达的被检酵母，来选择适合所需酒类酿造的酵母。
或者可通过培养被检酵母，选择混浊生成能力低的酵母，以选择适合所需酒类酿造的被检酵母。
此时，被检酵母或标准酵母，例如可使用上述导入了本发明载体的酵母、上述本发明的多核苷酸(DNA)表达增加了的酵母、上述本发明的蛋白质表达增加了的酵母、实施了突变处理的酵母、自发突变的酵母等。混浊的定量，例如可使用(P.W.Gales等J.Am.Soc.Brew.Chem.58，101-107(2000))中所述的方法进行。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等的物理方法，通过甲磺酸乙酯(EMSEthylmethanesulfonate)、N-甲基-N-亚硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等药剂处理的化学方法等的任何方法进行(例如，参照大岛泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等)。
还有，可作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可例举为酿造时可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母例如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456等，酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且还可使用例如酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NCYC90等的威士忌酵母；例如协会葡萄酒用1号、同3号、同4号等的葡萄酒酵母；例如协会酵母 清酒用7号、同9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准酵母、被检酵母可从上述酵母中以任意组合选择。
实施例以下，通过实施例详细叙述本发明，但本发明不限于以下实施例。
实施例1编码细胞壁甘露糖蛋白的基因(nonScCWP2)的克隆使用日本特开2004-283169号公报中记载的比较数据库检索的结果，发现了啤酒酵母中特有的新型编码细胞壁甘露糖蛋白的基因nonScCWP2(序列号1)。以所得到的碱基序列的信息为基础，设计用于扩增nonScCWP2全长基因的引物nonScCWP2_for(序列号5)/nonScCWP2_rv(序列号6)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70株(可简写为“W34/70株”)的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有nonScCWP2全长基因的DNA片段(约0.3kb)。
将如上所述得到的nonScCWP2基因片段通过TA克隆插入到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制)。将nonScCWP2基因的碱基序列用双脱氧测序法(Sanger方法)(F.Sanger，Science，214，1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。
实施例2啤酒试验酿造中nonScCWP2基因表达分析使用啤酒酵母巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70株进行啤酒试验酿造，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列检测。
麦汁浸出物浓度12.69％麦汁容量 70L麦汁溶解氧浓度8.6ppm发酵温度 15℃酵母投入量12.8×106cells/mL对发酵液经时抽样，观察酵母增殖量(图1)、表观浸出物浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体抽样，对制备后的mRNA进行生物素标记，使其在啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，AFFYMETRIX公司制)进行。nonScCWP2基因表达模式如图3所示。由此结果，可确认通常的啤酒发酵中nonScCWP2基因进行了表达。
实施例3nonScCWP2基因高表达株的制备将实施例1中所述的nonScCWP2/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI酶切，制备包含蛋白质编码区域全长的DNA片段。使此片段与用限制性内切酶SacI及NotI処理的pYCGPYNot连接，构建了nonScCWP2高表达载体nonScCWP2/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子高表达。酵母中的选择性标记包含耐氨基糖苷类抗生素(Geneticin)基因G418r，大肠杆菌中的选择性标记包含氨苄青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制备的nonScCWP2高表达载体，用日本特开平07-303475中所述的方法转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephan34/70株。用含有氨基糖苷类抗生素300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物、2％多蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)选择转化体。
实施例4啤酒试验酿造中混浊生成量的解析使用亲株及用实施例3得到的nonScCWP2高表达株，通过以下条件进行了发酵试验。
麦汁浸出物浓度11.85％麦汁容量 2L麦汁溶解氧浓度约8ppm发酵温度 15℃一定酵母投入量10g湿酵母菌体/2L麦汁对发酵醪液经时抽样，观察酵母增殖量(OD660)、浸出物消耗量的经时变化。对醪液中混浊的定量，通过将醪液用5,000rpm、进行10分钟离心，使悬浮酵母沉淀，回收离心上清液，将此样品用于硅藻土过滤及混浊测定。上述样品使用在孔径为50μm的金属网上的硅藻土过滤。过滤后，为营造易产生混浊的环境，在冰水中(0℃)保持24小时。将样品的混浊用浊度计(Sigrist公司制、Sigrist光电计KTL30)测定，将此值作为T-haze(总混浊量)。将28℃下的冷凝固体物增溶溶解后测定的值作为P-Haze(永久混浊量)、将T-Haze和P-Haze的差值作为冷凝固体物引起的Haze值、C-Haze(冷凝固体物混浊量)。单位可使用Helm表示(1Helm＝0.1FTU(Formazin TurbidityUnit))(文献；P.W.Gales等J.Am.Soc.Brew.Chem.58，101-107(2000))。所得结果如表1所示。
表1

根据表1所示，T-Haze生成量对于亲株的64Helm，nonScCWP2高表达株为41Helm。另外，P-Haze量对于亲株的46Helm，nonScCWP2高表达株为31Helm，C-Haze量对于亲株的18Helm，nonScCWP2高表达株为10Helm。上述结果表明，由于nonScCWP2高表达，Haze量约减少34％-45％。且此时，亲株与破坏株之间，增殖速度及浸出物消耗速度基本无差异。
该实施例得出的结果如图4及图5表示。图4是表示此实施例的啤酒试验酿造中酵母增殖量的经时变化图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。图5是表示此实施例的啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。
实施例5编码细胞壁甘露糖蛋白的基因(ScCWP2)的克隆设计用于扩增ScCWP2全长基因的引物ScCWP2_for(序列号7)/ScCWP2_rv(序列号8)，以S.cerevisiae X2180-1A的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有ScCWP2全长基因的DNA片段(约0.3kb)。
将如上所述得到的ScCWP2基因片段分别通过TA克隆插入到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制)。将ScCWP2基因的碱基序列用双脱氧测序法(Sanger方法)(F.Sanger，Science，214，1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。
实施例6啤酒试验酿造中ScCWP2基因表达分析使用啤酒酵母巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70株进行啤酒试验酿造，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列检测。
麦汁浸出物浓度12.69％麦汁容量 70L麦汁溶解氧浓度8.6ppm发酵温度 15℃酵母投入量12.8×106cells/mL对发酵液经时抽样，观察酵母增殖量(图4)、表观浸出物浓度(图5)的经时变化。与此同时，对酵母菌体抽样，对制备后的mRNA进行生物素标记，使其在啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用GeneChip OperatingSystem(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，AFFYMETRIX公司制)进行。ScCWP2基因表达模式如图6所示。由此结果，可确认通常的啤酒发酵中ScCWP2基因进行了表达。
实施例7ScCWP2基因高表达株的制备从实施例5所述的质粒TOPO/ScCWP2中，制备含有用限制性内切酶XhoI及BamHI处理的ScCWP2基因的约0.7kb的DNA片段。使此片段与用限制性内切酶XhoI及BamHI处理的pUP3GLP2连接，构建了ScCWP2高表达载体pUP-ScCWP2。酵母表达载体pUP3GLP2是作为同源重组位点含有乳清苷-5-磷酸脱羧酶基因URA3的YIp型(染色体整合型)载体，导入的基因通过3-磷酸甘油醛脱氢酶基因TDH3的启动子/终止子高表达。酵母中的选择性标记，在半乳糖激酶基因GAL1的启动子/终止子控制下整合抗药性基因YAP1，并在含有半乳糖的培养基上诱导表达。另外，大肠杆菌中的选择性标记，包含氨苄青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制备的nonScCWP2高表达载体，用日本特开平07-303475中所述的方法，转化Weihenstephan Nr.164株。用含有浅蓝菌素1.0mg/L的YPGal平板培养基(1％酵母浸出物、2％多蛋白胨、2％半乳糖、2％琼脂)选择浅蓝菌素抗性株。
实施例8啤酒试验酿造中混浊生成量的解析使用亲株及用实施例7得到的ScCWP2高表达株，通过以下条件进行了发酵试验。
麦汁浸出物浓度11.85％麦汁容量 2L麦汁溶解氧浓度约8ppm发酵温度 15℃一定酵母投入量10g湿酵母菌体/2L麦汁对发酵醪液经时抽样，观察酵母增殖量(OD660)、浸出物消耗量的经时变化。对醪液中混浊的定量，通过将醪液用5,000rpm、进行10分钟离心，使悬浮酵母沉淀，回收离心上清液，将此样品用于硅藻土过滤及混浊测定。上述样品使用置于孔径为50μm的金属网上的硅藻土过滤。过滤后，为营造易产生混浊的环境，在冰水中(0℃)保持24小时。将样品的混浊用浊度计(Iigrist公司制、Sigrist光电计KTL30)测定，将此值作为T-haze(总混浊量)。将28℃下的冷凝固体物增溶溶解后测定的值作为P-Haze(永久混浊量)、将T-Haze和P-Haze的差值作为冷凝固体物引起的Haze值、C-Haze(冷凝固体物混浊量)。单位可使用Helm表示(1Helm＝0.1FTU(FormazinTurbidity Unit))(文献；P.W.Gales等J.Am.Soc.Brew.Chem.58，101-107(2000))。所得结果如表2所示。
表2

根据表2所示，T-Haze生成量对于亲株的33Helm，ScCWP2高表达株为24Helm。另外，P-Haze量对于亲株的23Helm，ScCWP2高表达株为18Helm，C-Haze量对于亲株的10Helm，ScCWP2高表达株为7Helm。上述结果表明，由于ScCWP2高表达，Haze量约减少22％～23％。此时，亲株与破坏株之间，增殖速度及浸出物消耗速度基本无差异。
该实施例中得出的结果如图7及图8所示。图7是表示此实施例的啤酒试验酿造中酵母增殖量的经时变化图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。图8是表示此实施例的啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。
因根据本发明的酒类制造法可将啤酒酿造及产品中的混浊量抑制到很低的程度，所以，可制造出减少了混浊量的酒类。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利株式会社(Suntory Limited)<120>编码细胞壁甘露糖蛋白的基因及其用途(Gene encoding cell wallmannoprotein and use thereof)<130>PCT05-0092<150>JP2005-276423<151>2005-09-22<150>JP2005-375016<151>2005-12-27<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>300<212>DNA<213>酵母(Yeast)<400>1atgcaattct ctactgtcgt ttccgtcgct ttcgtcgcct tggccaactt tgttgccgct 60gaatctgctg ccgccatctc tcaaattact gatggtcaaa tccaagctac cactgctacc 120accactgctc catccaccac tgccgctcca tccaccactg ctgctccatc ttcttcccac 180gttgaaaccg tttctgcttc cagcactgaa accatttctc aacaaactga aaatggtgct 240gctaaggccg ctgtcggtat gggtgccggt gctctagctg ccgctgctat gttgttgtaa 300
<210>2<211>99<212>PRT<213>酵母(Yeast)<400>2Met Gln Phe Ser Thr Val Val Ser Val Ala Phe Val Ala Leu Ala Asn1 5 10 15Phe Val Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ala Ile Ser Gln Ile Thr Asp Gly20 25 30Gln Ile Gln Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Thr Thr Ala35 40 45Ala Pro Ser Thr Thr Ala Ala Pro Ser Ser Ser His Val Glu Thr Val50 55 60Ser Ala Ser Ser Thr Glu Thr Ile Ser Gln Gln Thr Glu Asn Gly Ala65 70 75 80Ala Lys Ala Ala Val Gly Met Gly Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ala85 90 95Met Leu Leu<210>3
<211>279<212>DNA<213>酵母(Yeast)<400>3atgcaattct ctactgtcgc ttccgttgct ttcgtcgctt tggctaactt tgttgccgct 60gaatccgctg ccgccatttc tcaaatcact gacggtcaaa tccaagctac taccactgct 120accaccgaag ctaccaccac tgctgcccca tcttccaccg ttgaaactgt ttctccatcc 180agcaccgaaa ctatctctca acaaactgaa aatggtgctg ctaaggccgc tgtcggtatg 240ggtgccggtg ctctagctgc tgctgctatg ttgttataa 279<210>4<211>92<212>PRT<213>酵母(Yeast)<400>4Met Gln Phe Ser Thr Val Ala Ser Val Ala Phe Val Ala Leu Ala Asn1 5 10 15Phe Val Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ala Ile Ser Gln Ile Thr Asp Gly20 25 30Gln Ile Gln Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Glu Ala Thr Thr Thr Ala35 40 45Ala Pro Ser Ser Thr Val Glu Thr Val Ser Pro Ser Ser Thr Glu Thr50 55 60
Ile Ser Gln Gln Thr Glu Asn Gly Ala Ala Lys Ala Ala Val Gly Met65 70 75 80Gly Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ala Met Leu Leu85 90<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>5gagctcatag cggccatgca attctctact gtcgtttccg 40<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>6ggatcctatg cggccgcagg taaaaaggaa tcaaacactt ac 42<210>7<211>36
<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>7gagctcatgc aattctctac tgtcgcttcc gttgct 36<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>8ggatcccatt cgaagagaaa tcacaggaac atcgtt 3权利要求
1.从以下(a)～(f)组成的组中选择的多核苷酸(a)含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有编码由序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所组成的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有与序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有与编码序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在严格条件下杂交，且编码作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
2.按照权利要求1中所述的多核苷酸，其从以下(g)～(i)组成的组中选择(g)含有编码由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列中1～10个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所组成的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有与序列号1的碱基序列组成的多核苷酸、或序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在十分严格条件下杂交，且编码作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
3.按照权利要求1中所述的多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。
4.按照权利要求1中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
5.按照权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。
6.一种蛋白质，其由权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸编码。
7.一种载体，其含有权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸。
8.一种载体，其含有从以下(j)～(1)组成的群中选择的多核苷酸。(j)含有编码由序列号4的氨基酸序列或序列号4的氨基酸序列中1～10个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所组成的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(k)含有编码具有与序列号4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列的，且作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；及(1)含有与序列号3的碱基序列组成的多核苷酸、或序列号3的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸，在十分严格条件下杂交，且编码作为细胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
9.一种酵母，其中导入了权利要求7或8中所述的载体。
10.按照权利要求9中所述的酵母，其通过导入权利要求7或8中所述的载体，降低混浊的生成能力。
11.按照权利要求10中所述的酵母，其通过使权利要求6中所述的蛋白质的表达量增加，降低混浊的生成能力。
12.一种酒类的制造方法，其使用权利要求9～11中任一项所述的酵母。
13.按照权利要求12中所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是麦芽饮料。
14.按照权利要求12中所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是葡萄酒。
15.一种酒类，其用权利要求12～14中任一项所述的方法制造。
16.一种评价方法，其使用根据编码具有序列号1或序列号3碱基序列的细胞壁甘露糖蛋白的基因的碱基序列而设计的引物或探针，评价被检酵母的混浊生成能力。
17.一种评价方法，其通过培养被检酵母，测定编码具有序列号1或序列号3碱基序列的细胞壁甘露糖蛋白的基因的表达量，评价被检酵母的混浊生成能力。
18.一种酵母的选择方法，其为培养被检酵母，对权利要求6中所述的蛋白质定量或测定编码具有序列号1或序列号3碱基序列的细胞壁甘露糖蛋白的基因的表达量，选择与目标混浊生成能力相应的前述蛋白质的生成量或前述基因表达量的被检酵母。
19.按照权利要求18中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，测定编码具有序列号1或序列号3碱基序列的细胞壁甘露糖蛋白的基因在各酵母中的表达量，选择该基因比标准酵母高表达的被检酵母。
20.按照权利要求18中所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母及被检酵母，对各酵母中权利要求6中所述的蛋白质定量，选择该蛋白质量比标准酵母多的被检酵母。
21.一种酒类的制造方法，其特征在于，使用权利要求9～11中所述的酵母及通过权利要求18～20中所述方法选择的酵母中的任一个酵母，进行用于酒类制造的发酵，调节混浊的生成量。
全文摘要
本发明提供一种制造降低了混浊生成能力的酒类酿造酵母、使用该酵母制造的酒类及其制造方法等。更具体地说，本发明涉及通过编码酿造酵母的细胞壁甘露糖蛋白Cwp2p的ScCWP2基因或特别是提高啤酒酵母中的特征性的nonScCwp2基因的表达量，从而使产品中的混浊减少了的酵母、使用该酵母的酒类制造方法等。
文档编号C07K14/39GK1936006SQ200610138878
公开日2007年3月28日 申请日期2006年9月21日 优先权日2005年9月22日
发明者中尾嘉宏, 儿玉由纪子, 下永朋子, 大村文彦 申请人:三得利株式会社