专利名称：白假丝酵母(甘露糖蛋白质复合体)菌毛株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新颖的微生物菌株。具体而言，本发明涉及一种白假丝酵母甘露 糖蛋白质复合体菌毛株。本发明也涉及该白假丝酵母菌毛株的培养、处理、用途和使用方 法。本发明还涉及利用该白假丝酵母菌毛株制备的医疗用产品。
背景技术：
白假丝酵母(Candida albicans)，又称白念珠菌或者白色念珠菌，是单细胞真菌。 圆形或卵圆形，革兰氏染色阳性。以出芽繁殖，称芽生孢子。孢子伸长成芽管，不与母体脱 离，形成较长的假菌丝。白假丝酵母是属于半知菌纲(Fungi Imperficti)的球壳目(Xylariaceae)假丝 酵母属(Candida)的单细胞酵母。白假丝酵母在普通的琼脂、血琼脂与沙保培养基上均生长良好，菌落呈类酵母型。 在玉米粉培养基上可长出厚膜孢子。白假丝酵母的假菌丝和厚膜孢子有助于鉴定。白假丝酵母属条件致病菌，通常存在于人体表与腔道中，当正常菌群失调或抵抗 力降低时，白假丝酵母则可侵犯人体许多部位，如皮肤、粘膜、肺、肠、肾和脑，引起皮肤粘膜 感染(常见鹅口疮、外阴炎及阴道炎)、内脏感染和中枢神经系统感染等，粘膜感染以鹅口 疮最多。白假丝酵母的微生物学检查(1)直接镜检脓、痰、离心沉淀后的脊液可直接涂片，革兰氏染色后镜检。患处皮 屑或甲屑用10% KOH消化后镜检。可见革兰氏阳性、圆形或卵圆形的菌体及芽生孢子，同时 可观察到假菌丝。(2)分离培养与鉴定将检材接种于沙保弱琼脂培养基，25°C孵育3 4天后，在 培养基表面形成乳白色类酵母菌落，镜检可见假菌丝及成群的卵圆形芽生孢子。在临床标本中如有大量菌丝，提示白假丝酵母为致病状态，对诊断具有重要意义。现有技术中记载的白假丝酵母是条件致病菌，不具有医疗应用价值；目前尚没有 将白假丝酵母用于制备疫苗的报道。关于细菌菌毛的基础研究较多，但是关于白假丝酵母的菌毛研究较少。细菌菌毛是菌体表面极其纤细的蛋白微丝，须用电镜观察。特点是细、短、 直、硬、多，一般认为菌毛与细菌运动无关，根据形态、结构和功能可分为普通菌毛和 性菌毛两类。前者与细菌粘附和侵染宿主有关，后者为中空管子，与传递遗传物质有 关。在 Sharon N, Eshdat Y, SilverblattF J, Ofek I, Bacterial adherence to cell surface sugars, ciba Found Symp. 1981 ；80 :119 141 中，说明 了大肠杆菌和沙门氏 菌的菌毛中存在与宿主细胞发生粘附的物质，并且该粘附会受到糖，例如D-甘露糖的抑 制；而且糖蛋白介导的粘附是普遍的广泛的。在Wim Gaastra and Frist K. de Graaf, Host-Specific Fimbrial Adhesions of Noninvasive EnterotoxigenicEscherichia coli Strains, Microbiological Reviews, June 1982, Vol. 46, No. 2, P. 129 161 巾if论了大肠杆菌的多种菌毛的性质也讨论了甘露糖敏感血细胞凝集(Marmose-sensitive hemagglutination，甘露糖敏感血凝)和甘露糖抗性血细胞凝集(MRHA)以及非血细胞凝集 (Non-HA) ο 在 Speert DP, Lon ΒΑ, Eftekbar F, Opsonin-independent phagocytosis of Pseudomonasaeruginosa, Antibiot Chemother. 985 ；36 88 94 中，提示了菌毛部分的介 导了人嗜中性粒细胞对假单胞菌的吞噬作用。关于菌毛的综合性论述，参见，牟希亚，细菌 菌毛及有关粘附素研究的新进展，微生物学杂志，第4卷，第3期，1984年11月，第14页到 第17页。上述公开出版物提示具有甘露糖敏感血细胞凝集(甘露糖敏感血凝)性质的菌 毛可能存在于多种属细菌上，比如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的最常见的菌毛是I型 普通菌毛(即甘露糖敏感血凝菌毛)。为了预防和/或治疗与白假丝酵母菌感染及其他真菌或细菌感染等有关的疾病， 需要寻找和提供具有广谱的、高免疫原性的、低毒性的物质。本发明通过筛选从临床上获得 的白假丝酵母菌株，获得了一种甘露糖蛋白质复合体菌毛株，并发现用这种白假丝酵母甘 露糖蛋白质复合体菌毛株制备的裂解疫苗具有刺激机体免疫作用的用途。所以，本发明提 供了具有使用价值的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株，可以用于生产疫苗，这种疫 苗也可以对一些细菌提供保护作用，具有跨真菌和细菌的保护作用。
发明内容
发明概述第一方面，本发明提供了一种白假丝酵母菌毛株，命名为白假丝酵母(甘露糖 蛋白质复合体)菌毛株，拉丁名为”Candida albicans (Mannose-protein complex) pilus strain”。在分类学上，该菌株属于白假丝酵母的一种新型菌株。该菌株已经于2010年01月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(CGMCC)，地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 所。CGMCC是布达佩斯条约承认的生物材料样品国际保藏单位。该菌株的编号是CGMCC No. 3604，分类命名是白假丝酵母(Candida albicans)。本发明的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株的特征在于下列的一个或多 个a.在菌体周围有许多纤细而刚直的菌毛状的甘露糖蛋白质复合体，b.甘露糖敏感血凝试验呈现强阳性，c.平板菌落粘附红细胞试验强阳性。第二个方面，本发明提供了白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株的死菌体，菌 体裂解成分，菌体制备物，提取物，分离自菌体的物质，其各自可以作为疫苗或免疫调节剂 或其他医疗制品的活性成分。白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株的细胞包括细胞壁、 细胞质膜、细胞质和细胞器、细胞核等结构，细胞外周身的甘露糖蛋白质复合体。在一个实施方案中，以本发明的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株为基础， 经过培养和灭活，得到死菌体。死菌体可以作为动物体包括人体的机体免疫系统刺激物，获 得有益效果。优选的，死菌体可以从培养基或者培养液中纯化后使用。也可以在其中加入 其他试剂或者药剂、佐剂、辅剂等，获得更好的免疫刺激或调控效果。在一个实施方案中，以本发明的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株为基础，经过培养、提取、纯化等步骤可以得到上述结构或者上述物质中的某一种或者几种或者任 意组合，用作动物体包括人体的机体刺激物，获得有益的效果。关于本发明的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株的用途。本发明的白假丝酵 母甘露糖蛋白质复合体菌毛株毒性低，免疫作用强，而且具有广谱作用的特性。用该菌株制 备的菌苗或者免疫调节剂可以全面激活调控人体的细胞免疫和体液免疫系统，对多种细菌 及真菌产生抵抗作用。免疫调节活性和抗肿瘤作用均具明显效果。本发明的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株的菌苗特别适合免疫机体，用于 预防细菌感染和/或者真菌感染。尤其是肿瘤晚期病人，都具有真菌感染，以白色念珠菌感染为常见，本发明的白假 丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株的菌苗或者制品特别适用。
本发明的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株的有关保藏信息如下保藏日期2010年1月22日；保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称CGMCC ；保藏编号CGMCCNo. 3604。图1是现有技术中的白假丝酵母的菌毛株照片，图中箭头所指为菌毛。图2是本发明提供的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株电子显微镜照片，显 示所描述的白假丝酵母的形态特征(周身具有甘露糖蛋白质复合体)。图3用白假丝酵母感染的动物的病理特征图3A.肾脏；图3B.肝脏；图3C.心脏。图4用本发明的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株所制造疫苗免疫动物的 免疫保护状况。其中，图4A是感染局部部位的比较，图4B是肾脏比较，图4C是组织化学比 较。发明详述1.定义和解释在本申请中，对下述术语和解释予以特别说明。“细菌”是一类单细胞原核生物。基因载体是由一束双链DNA纤维丝组成的，没有 任何膜的界限把它和细胞质分开。缺少细胞器。核蛋白体为70S。本申请中谈论的是“真 细菌(eubacteria) ”。真细菌可以划分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两种类型。“真菌”是一类真核生物，具有细胞核。“酵母”是一类单细胞的真菌。“白假丝酵母”是一类条件致病真菌。革兰氏染色显示阳性。“革兰氏染色法”是通过使用结晶紫溶液和碘液，依据真细菌的细胞壁结构不同， 对细菌进行区分的染色方法。该方法也适用于某些真菌，如酵母。“菌毛”是细菌表面的纤丝附属结构。菌毛由蛋白质构成。菌毛区分为普通菌毛和 性菌毛。白假丝酵母也有菌毛。“普通菌毛”与细菌体粘附有关。普通菌毛种类繁多，依据其在细菌粘附中的作用 的相对不同，可以分为非专一性粘附菌毛和专一性粘附菌毛。
“非专一性粘附菌毛”是指那些可以使细菌粘附到多种基质上的菌毛，比如多种 真核细胞上，例如多种动物的红细胞，白细胞，上皮细胞，和其他测试中的动物细胞、植物 细胞和真菌细胞。也就是这些菌毛对宿主没有严格的选择性，粘附具有广泛性，例如大 肠杆菌的1型菌毛(typel fimbriae) 0在使用不同动物来源的红细胞时，非专一性粘附 表现出相似模式的红细胞凝集活性；并且红细胞凝集作用(hemagglutination)对甘露 糖敏感(mannose-sensitive)。因此，甘露糖敏感红细胞凝集作用(mannose-sensitive hemagglutination，甘露糖敏感血凝)是非专一性粘附菌毛的一个特征。“专一性粘附菌毛”是指那些促使细菌粘附到特定基质上的菌毛。也就是这些菌毛 对宿主具有严格的选择性，粘附只能在细菌和特殊宿主之间发生，比如大肠杆菌菌毛K88。 红细胞凝集作用不表现甘露糖敏感性，即不被甘露糖抑制的血凝。“甘露糖敏感血凝菌毛”全称为“甘露糖敏感红细胞凝集作用菌毛”，是指促进细菌 粘附到多种基质上的非专一性的粘附菌毛，能够被甘露糖抑制。在本申请中，甘露糖敏感血 凝菌毛是一个广义概念。现有研究提示，在细菌，比如铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌 等，粘附到宿主细胞的过程中，糖介导粘附普遍存在。有些是甘露糖敏感，有些是L-岩藻糖 敏感，D-半乳糖敏感的。在此，“甘露糖敏感血凝菌毛”包括甘露糖敏感细胞凝集作用菌毛， 各种其他糖类调节的、与细菌和宿主的非专一性粘附相关的菌毛。“甘露糖蛋白质复合体”是指存在于本发明的白假丝酵母菌株表面的由甘露糖和 蛋白质构成的复合体。2.详细描述本发明的白假丝酵母菌毛株，表现出低毒性，具有周身甘露糖蛋白质复合体，是甘 露糖敏感结构。本发明将该菌株命名为白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株，并于2010 年1月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.3604。本发明提供的白假丝酵母全称为白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株，它是一 种具有周身菌毛性甘露糖敏感血凝(Mannose SensitiveHemagglutination)菌毛的白假丝 酵母，该菌毛株具有跨菌属的广谱免疫原性。如背景技术部分所述，鉴于白假丝酵母是致病菌，没有人利用白假丝酵母菌体或 其中的物质进行疾病预防和治疗。本发明的发明人注意到了菌毛在细菌和宿主作用中的重要性，注意到甘露糖敏感 血凝菌毛在细菌和宿主作用中的普遍性；力争发现一株具有低毒性、广谱免疫原性的白假 丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株，并利用菌体中的物质，特别是甘露糖蛋白质复合体菌 毛进行免疫刺激和调理。本发明人通过对临床获得的多株白假丝酵母的筛选以及在小鼠中的实验，确定了 这株白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株。该菌株的产品在疾病的预防和治疗上表现出 有益效果，可以刺激免疫系统。白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株获得之后，一直保持性质稳定。由白假丝 酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株制备的菌苗也在抗感染、抗肿瘤治疗和免疫失调方面均有 良好效果。本发明的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株的主要特征如下
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1.形态培养特性和生化检验符合白假丝酵母检验指标。2.菌毛形态和性质(1)图2是本发明的菌株的电子显微镜照片，可以看到本菌株的菌体具有的周生 菌毛。(2)部分菌毛为甘露糖蛋白质复合体菌毛。甘露糖敏感血凝和血凝抑制试验，均为 强阳性，参见图2。其中有关进行甘露糖敏感血凝试验的方法，参见大连医学院学报，1985， 7(1) :1-3。(3)图1是现有技术的白假丝酵母菌照片，其上有菌毛，但是很短，不具有本发明 中的甘露糖蛋白质复合体的结构和性质特征。
具体实施例方式实施例1.白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株的来源和鉴定本发明人通过对从临床标本中分离出的多株白假丝酵母菌株，参考(牟希亚，绿 脓杆菌甘露糖敏感血凝菌毛株的建立，微生物学报，26 (2) 176-179，1986)中的方法，进行 筛选和选育，获得一株白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株。主要鉴定特征如下(1)直接镜检革兰氏阳性、卵圆形的菌体、芽生孢子、可观察到假菌丝。(2)分离培养与鉴定将检材接种于沙保弱琼脂培养基，25°C孵育3 4天后，在 培养基表面形成乳白色类酵母菌落，镜检可见假菌丝及成群的卵圆形芽生孢子。对本菌毛株进行了电子显微照相，如图2所示，显示有周生甘露糖蛋白质复合体。 甘露糖敏感血凝和血凝抑制试验，均为强阳性。其中甘露糖敏感血凝和血凝抑制试验的 方法为本领域普通技术人员所公知并熟练掌握以及容易判断，参见例如大连医学院学报， 1985,7(1) :1-3。实施例2.菌苗制备将本发明的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株在沙氏固体培养基上于37°C 培养24小时，收集培养物，并以甲醛溶液杀菌，反复洗涤制成死菌苗，稀释用无菌生理盐 水，加入苯甲醇作为防腐剂，制备菌苗。实施例3.菌苗的动物实验第一部分模型动物的病理研究家兔10只，体重2 3公斤，雄性。经兔耳皮下注射5X 107ml的白色念珠菌，攻 击家兔，观察感染后家兔的内脏器官变化。获得了肾脏、肝脏和心脏的照片，提供在图3中， 分别是图3A.肾脏；图3B.肝脏；图3C.心脏。结果显示肾脏有大量脓肿灶，同时肝脏和心脏发现肉眼可见的病灶(白点为脓 肿)。说明白假丝酵母感染剂量增加时，会造成感染动物的多个脏器的病变。第二部分免疫研究本实验研究了本发明的白假丝酵母菌苗阻断酿酒酵母菌感染、白假丝酵母感染的 效果。1.材料与方法1. 1 材料
1. 1. 1实验菌种酿酒酵母菌、白假丝酵母菌。1. 1. 2培养基沙氏培养基1.1. 3 动物家兔10只，体重2 3公斤，雄性；小鼠20只，体重20 25克，雄性。1. 1.4主要试剂40%福尔马林溶液，无菌生理盐水，Hank’ s液，混合了台盼蓝的可溶性淀粉肉汤， Giemsa染液等。1. 1. 5主要仪器及器材(1) BH-2型摄影生物显微镜0LYMPUS ；(2)D4-2A离心机北京医用离心机厂；(3)尼康数码相机尼康中国有限公司；(4)吸液器(100 μ 1)上海医械专机厂。1. 2 方法1. 2. 1白假丝酵母菌悬液的制备白假丝酵母菌接种至新鲜的沙氏固体培养基，37°C培养24h，收集菌细胞，用生理 盐水反复洗涤3次，用血细胞记数板调整其浓度至5. OX 106/L。1. 2. 2酿酒酵母菌菌悬液的制备酿酒酵母菌接种至新鲜的沙氏固体培养基，37°C培养24h，收集菌细胞，用生理盐 水反复洗涤3次，用血细胞记数板调整其浓度至5. OX 106/L。1. 2. 3家兔分组攻击实验(1)免疫组(5只家兔)用Iml本发明的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌株死 菌苗经家兔腹腔注射，免疫家兔。每两天免疫一次，共免疫3次。距最后一次免疫2天后， 兔耳缘静脉抽血测抗体效价；后用Iml白色念珠菌经家兔耳皮下注射，攻击家兔，观察感染 后家兔状况。(2)对照组(5只家兔)直接用Iml白假丝酵母菌经兔耳皮下注射，攻击家兔，观 察感染后家兔状况。(3)取兔肾脏，观察二组肾脏的状态，并固定于福尔马林溶液中以做HE染色光镜 下病理观察。1. 2. 4家兔抗体效价的测定采用试管凝集法测定抗白假丝酵母抗体效价。1. 2. 5小白鼠巨噬细胞功能测定一体内吞噬法测定小白鼠对白假丝酵母的吞噬百 分率和吞噬指数。1.2. 6统计学处理对实验结果用X士 S表示，吞噬百分率使用四格表资料的X2检验，吞噬指数使用近 似t检验与对照组比较，P <0.01者为有显著性差异。2.结果2. 1白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌苗免疫对白假丝酵母感染的影响2. 1.1动物一般状况对照组受到白假丝酵母攻击后表现为颤栗、局部及全身体温增高，全身体温达到 40-42 V，兔耳有脓肿，经过三次攻击后，兔耳有明显脓肿，精神萎靡，食欲下降，直至死亡。
免疫组受到白假丝酵母攻击后表现为局部及全身体温正常或略高，兔耳有轻微 脓肿，经过三次攻击后，兔耳脓肿轻微，精神良好，食欲基本正常。2. 1. 2注射区局部感染状况图4A是注射区局部感染状况。家兔注射区局部比较白假丝酵母甘露糖蛋白质复 合体菌苗免疫组红肿范围明显小于对照组。2. 1. 3实验结束时两组肾脏比较实验结束时两组肾脏比较左侧白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌苗免疫组比右 侧对照组肾脏充血程度、肿胀程度明显轻，同时，对照组肾脏出现肉眼可见的脓肿灶。图4B是实验结束时两组肾脏比较，表明左侧免疫组比右侧对照组肾脏充血程 度、肿胀程度明显轻，同时，对照组肾脏出现肉眼可见的脓肿灶。2. 1. 4两组动物肾脏的HE染色光镜下病理观察病理切片显示白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌苗免疫组感染仅累及肾小球， 肾小球体积增大，细胞数增多，炎性细胞浸润；对照组病变除累及肾小球外，还波及肾间质、 肾小管。肾小球、肾间质、肾小管均可见炎性细胞浸润。图4C是两组动物肾脏的HE染色光镜下病理观察，病理切片显示免疫组感染仅累 及肾小球，肾小球体积增大，细胞数增多，炎性细胞浸润；对照组病变除累及肾小球外，还波 及肾间质、肾小管。肾小球、肾间质、肾小管均可见炎性细胞浸润(200倍放大)。用酿酒酵母作为攻击菌，获得了类似结果。2. 2白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌苗免疫对家兔抗体效价的影响表1免疫组及空白对照组抗体效价
结果显示免疫组家兔的抗体效价明显高于对照组。2. 3白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌苗免疫后对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能 的影响根据公式 计算小白鼠的吞噬百分率和吞噬指数，经统计学处理后如表2所示表2实验组与对照组吞噬百分率与吞噬指数比较动物分组小鼠数目吞噬百分率(％) 吞噬指数对照组 0Κ 61.8 + 3.261.220 + 0.551 免疫组 10 只 78.4±5.38女 3.932±1.079女★为(P <0.01)经统计学计算后，可见免疫组和对照组的结果有明显差异，免疫组的吞噬百分率 和吞噬指数明显高于对照组。正如对于本领域的技术人员显而易见的，可以做出本发明的许多修改和变化而不 背离其精神和范围。本文中所描述的具体实施方案仅以例子的方式给出，并且仅以所附权 利要求连同这些权利要求被授予的等效物的整个范围限制本发明。
权利要求
一种白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株，保藏号为CGMCC No.3604。
2.如权利要求1所述的白假丝酵母菌毛株，其特征在于具有周身的甘露糖蛋白质复合体。
3.如权利要求1或2所述的白假丝酵母菌毛株的死菌体、菌体制备物或菌体提取物。
4.用如权利要求1或2所述的白假丝酵母菌毛株或其死菌体、菌体制备物或菌体提取 物所制备的制品。
5.一种组合物，包括有如权利要求1或2所述的白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛 株的成分或者死菌体。
6.一种疫苗或免疫调节剂，包括有如权利要求1或2所述的白假丝酵母甘露糖蛋白质 复合体菌毛株的成分或者死菌体，所述成分或者死菌体是所述疫苗或免疫调节剂的活性成 分。
7.一种疫苗制备方法，所述方法包括培养如权利要求1或2所述的白假丝酵母菌毛 株，将菌体制成疫苗。
8.如权利要求1或2所述的白假丝酵母菌毛株或其死菌体、菌体制备物或菌体提取物 在制备用于激活调控人体的细胞免疫和体液免疫系统的药物中的用途。
9.如权利要求1或2所述的白假丝酵母菌毛株或其死菌体、菌体制备物或菌体提取物 在制备用于预防和/或治疗真菌感染和/或细菌感染的药物中的用途。
10.如权利要求1或2所述的白假丝酵母菌毛株或其死菌体、菌体制备物或菌体提取物 在制备用于抗肿瘤的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株。本发明也涉及该白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株的培养、处理、用途和使用方法。本发明还涉及利用该白假丝酵母甘露糖蛋白质复合体菌毛株制备的医疗产品。
文档编号C12N1/16GK101914458SQ201010108660
公开日2010年12月15日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者朱洁, 牟希亚, 牟心赤, 郭雁群 申请人:北京万特尔生物制药有限公司