专利名称：一株近平滑假丝酵母菌菌株及其用于降解棉酚生产饲料蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一株近平滑假丝酵母菌菌株，特别是涉及一株可降解棉酚的近平滑假 丝酵母菌菌株，尤其涉及一种将其用于棉籽饼粕发酵降解棉酚生产饲料蛋白的方法，属于 生物技术领域。
背景技术：
我国棉花产量居世界第一位，每年棉籽饼粕产量约40(Γ500万吨，占各类植物饼 粕总产量的30%。棉籽饼粕不仅资源丰富、分布广泛，而且营养价值也很高，蛋白质含量约 为40%，氨基酸组成也较好，但因棉籽仁和棉籽饼粕中含有棉酚等有毒物质，其用途受到很 大限制，多年来我国的棉籽饼粕资源有80%左右都用作肥料还田，用作饲料蛋白资源的不 足30%，造成了蛋白质的极大浪费。特别是近年来随着畜牧业的发展，世界范围内蛋白质饲 料的缺乏日益突出。棉籽饼(粕)是当前形势下理想的替代豆粕的植物蛋白质源，而且棉 籽饼粕价格低廉，现时售价不到大豆饼粕价格的一半，对棉籽饼粕的开发利用，无疑会给我 国畜牧业带来显著的经济效益。棉酚，又叫棉毒素或棉籽醇，化学名为1，1，6，6，7，7-六羟基_5，5-二异丙基-3， 3- 二甲基-(2，2-联二萘)-8，8- 二醛基，分子式为C3tlH3tlO8,分子量518. 5，是棉属植物体内 形成的一种黄色多酚型物质。棉酚在生物体内与酶和蛋白质结合，破坏蛋白质的可消化性， 破坏胃粘膜组织并引起消化功能紊乱，当含量超过安全界限时会导致畜禽生长迟缓、中毒 及死亡。目前常用物理化学的方法对棉籽饼粕进行脱毒处理，游离棉酚的含量经处理后虽 可降低，但处理后产品的营养成分遭到了严重破坏，动物的适口性和采食量也降低了。生物 发酵法是目前最具有发展前途的脱毒方法，生产成本低、脱毒效果也好，该方法在利用微生 物发酵降解棉酚的同时，也提高了粗饲料的营养价值。如何更好的处理棉籽饼粕，使棉粕这 一丰富的饲料蛋白资源更好地应用于畜牧业生产成为人们广为关注的技术问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一株近平滑假丝酵母 菌菌株以及将其用于降解棉酚生产饲料蛋白的方法，以便使棉粕更好地应用于畜牧业生 产。本发明的目的是提供一株能降解棉酚的近平滑假丝酵母。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是，一株近平滑假丝酵母菌菌 株，其具有序列表1所列RNA序列的16S rRNA基因，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，编号为CGMCC No. 3555。命名为Candida parapsilosis KDNOl 18 该近平滑假丝酵母菌菌株CGMCC No. 3555，其单细胞为卵圆形，不规则排列，细胞 大小为Ιμπι 3.0μπιΧ2.0μπι 5μπι，电镜下可见有明显的诞生痕和出芽痕，有芽体，兼 性厌氧。其生长最适温度为28°C 30°C，不耐热，适宜ρΗ在7.0左右。能利用葡萄糖产酸产气。上述的近平滑假丝酵母从棉粕堆下土样中分离得到，种子培养基可用PDA或麦氏 培养基，在MRS培养基上生长良好，最适生长温度为30°C。本发明采取的技术方案之二是，将上述的近平滑假丝酵母菌菌株CGMCCNo. 3555 用于棉籽饼粕发酵降解棉酚。该近平滑假丝酵母能降解棉酚，在棉籽饼粕发酵培养基中发 酵72h，可使棉籽饼粕中游离棉酚含量降低60%。一种近平滑假丝酵母菌菌株CGMCC No. 3555用于降解棉酚生产饲料蛋白的方法， 包括下列内容a、制备发酵菌种，制备过程如下1)斜面菌种将近平滑假丝酵母菌菌株划线接种于加2%琼脂的马铃薯葡萄糖琼 脂培养基(PDA)，在30°C条件下培养12小时；斜面菌种在4°C冰箱中可保存3个月；2) 一级种子从斜面保藏菌种接种至新鲜PDA斜面培养基，37°C培养12h ；3) 二级种子从一级种子接种至液体麦氏培养基，30°C通风培养12h，装液量 30ml/250ml,回旋式摇床 160r/min。b、将二级种子以添加葡萄糖和玉米浆的棉籽饼粕为发酵底物，在30°C条件下进行 72h的厌氧发酵对棉籽饼粕进行脱毒，然后再65°C下烘干培养物，得到优质的棉籽饼粕饲 料蛋白。在该棉籽饼粕中游离棉酚含量降低60%，同时菌体生长产生大量代谢产物，能提高 发酵底料棉籽饼粕的品质，从而使之成为优质的饲料蛋白原料。上述的近平滑假丝酵母菌菌株CGMCC No. 3555用于降解棉酚生产饲料蛋白的方 法，其b步骤的具体内容如下(1)配制发酵培养基取一定量经细粉碎的棉籽饼粕，在每100份棉籽饼粕中加入 4份的葡萄糖、2份的玉米浆、0. 2份的KH2PO4和40 100份的水，混勻作为发酵培养基；发
酵培养基无需灭菌；(2)发酵培养在棉籽饼粕发酵培养基中接入5 15份的二级种子，30°C条件下 厌氧培养72hr ；(3)发酵结束，65°C烘干培养物，得到棉籽饼粕饲料蛋白。本发明利用筛选培养的近平滑假丝酵母菌菌株CGMCC No. 3555，通过微生物发酵 的方法对棉籽饼粕进行发酵脱毒，相比以往的物理化学脱毒法，生物发酵的方法没有破坏 棉籽饼粕的营养成分，同时菌体在生长过程中产生大量的代谢产物，提高了棉籽饼粕的品 质；由于采用固态厌氧发酵，生产设备和发酵工艺简单；发酵底料不需要灭菌，生产成本低 廉
MTv ο我国是世界产棉大国，拥有丰富的棉籽饼粕资源，这是制备优质棉籽饲料蛋白的 原料。本发明可促进棉粕在饲料行业中的应用，提高棉粕的利用率，缓解目前世界范围内蛋 白质饲料原料缺乏的问题，对于提高资源利用率，降低饲料行业生产成本意义显著。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例1将棉粕堆下土样中大量菌株接种在MRS平板中，经多次筛选、培养，分离得到一株
4保藏编号为CGMCC No. 3555的近平滑假丝酵母菌菌株，其单细胞为卵圆形，不规则排列，细 胞大小为1 μ m 3. 0 μ mX 2. 0 μ m 5 μ m，电镜下可见有明显的诞生痕和出芽痕，有芽体， 兼性厌氧。其生长最适温度为28°C 30°C，不耐热，适宜pH在7.0左右。能利用葡萄糖 产酸产气。菌株降解棉酚效果显著，遗传稳定，经其发酵后棉籽饼粕中游离棉酚含量降低 60%，不超过 0. 5g/kg。实施例2制备棉籽饼粕发酵菌种。1)斜面菌种使用PDA培养基，加2%琼脂，划线接种菌株CGMCCNo. 3555，在30°C 条件下培养12小时，斜面菌种可在4°C冰箱中保存3个月内；2) 一级种子从斜面保藏菌种中转接至新鲜PDA斜面培养基，30°C培养12小时；3) 二级种子从一级种子取一环接种至液体麦氏培养基，装液量30ml/250ml，回 旋式摇床160r/min，在30°C条件下通风培养12小时，即制成发酵菌种。实施例3 用固态厌氧发酵方法发酵棉粕。使用的发酵培养基配制方法为取40g经细粉碎的棉籽饼粕，加入1. 6g的葡萄糖、 0. Sg的玉米浆、0. 08g的KH2PO4和24mL的水，混勻即可，发酵培养基无需灭菌。菌种的接种 量为4mL，30°C条件下厌氧培养72小时。发酵结束，65°C烘干培养物，经粉碎后得到的优质 棉籽饲料蛋白可用作饲料添加剂。棉酚的检测方法参照国标GB13086-91“饲料中游离棉酚的测定方法”，发酵结束后 测得干燥后棉籽饼粕中残余的游离棉酚小于0. 5g/kg。实施例4本实施例与实施例2的区别在于发酵培养基的配制不同，其余步骤一样。本实施例的发酵培养基配制取40g经细粉碎的棉籽饼粕，加入1. 6g的葡萄糖、 0. Sg的玉米浆、0. 04g的FeSO4和24mL的水，混勻发酵。发酵结束后测得干燥后棉籽饼粕 中残余的游离棉酚小于0. 5g/kg。序列表<110>青岛康地恩生物科技有限公司<120> 一株近平滑假丝酵母菌菌株及其用于降解棉酚生产饲料蛋白的方法<160>1<211>1112<212>16S rRNA<223> 近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)<400>1CAATTCCTTT AAGTTTCAGC CTTGCGACCA TACTCCCCCC AGAACCCAAA 50GACTTTGATT TCTCGTAAGG TGCCGATTGC GTCAATAAAA GAACAACAAC 100CGATCCCTAG TCAGCATAGT TTATGGTTAA GACTACGACG GTATCTGATC 150ATCTTCGATC CCCTAACTTT CGTTCTTGAT TAATGAAAAC GTCCTTGGTA 200AATGCTTTCG CAGTAGTTAG TCTTCAGTAA ATCCAAGAAT TTCACCTCTG 250
ACTACTGAATACTGATACCCCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGT300
CCTAGAAACCAACAAAATAGAACCATAACGTCCTATTCTATTATTCCATG350
CTAATATATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCAAAG400
TAAAAGTCCTGGTTCGCCAAAAAGGCTAGCCAGAAGGAAAGGCTCGGCTG450
GGTCCAGTACGCATCAAAAAAGATGGACCGGCCAGCCAAGCCCAAGGTTC500
AACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTTTTGGAGCTG550
GAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTT600
AAGGTATTTACATTGTACTCATTCCAATTACAAGACCCGAAAGGGCCCTG650
TATCGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGC700
GCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTC750
CGGAATCGAACCCTTATTCCCCGTTACCCGTTGAAACCATGGTAGGCCAC800
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GAAGGCATTGATTTTTTATCTAATAAATACATCCCTTCCAAACAGTCGGG950
ATTTTAAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAA1000
GGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCA1050
CTGTATAATTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAG1100
CATATGACTACA1112
权利要求
一株近平滑假丝酵母菌菌株，其具有ID NO1所示的16S rRNA基因，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNo.3555。
2.将权利要求1所述的近平滑假丝酵母菌菌株用于棉籽饼粕发酵降解棉酚。
3. 一种将权利要求1所述的近平滑假丝酵母菌菌株用于降解棉酚生产饲料蛋白的方 法，包括下列内容a、制备发酵菌种，制备过程如下1)斜面菌种将近平滑假丝酵母菌菌株划线接种于加2%琼脂的马铃薯葡萄糖琼脂培 养基(PDA)，在30°C条件下培养12小时；斜面菌种在4°C冰箱中可保存3个月；2)一级种子从斜面保藏菌种接种至新鲜PDA斜面培养基，37°C培养12h ；3)二级种子从一级种子接种至液体麦氏培养基，30°C通风培养12h，装液量 30ml/250ml,回旋式摇床 160r/min ；b、将二级种子以添加葡萄糖和玉米浆的棉籽饼粕为发酵底物，在30°C条件下进行72h 的厌氧发酵对棉籽饼粕进行脱毒，然后再65°C下烘干培养物，得到棉籽饼粕饲料蛋白。
4.根据权利要求4所述的近平滑假丝酵母菌菌株用于降解棉酚生产饲料蛋白的方法， 其b步骤的具体内容如下(1)配制发酵培养基取一定量经细粉碎的棉籽饼粕，在每100份棉籽饼粕中加入4份 的葡萄糖、2份的玉米浆、0. 2份的KH2PO4和40 100份的水，混勻作为发酵培养基；发酵培 养基无需灭菌；(2)发酵培养在棉籽饼粕发酵培养基中接入5 15份的二级种子，30°C条件下厌氧 培养72hr ；(3)发酵结束，65°C烘干培养物，得到棉籽饼粕饲料蛋白。
全文摘要
一株近平滑假丝酵母菌菌株，其具有ID NO1所示的16S rRNA基因，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.3555。一种将该近平滑假丝酵母菌菌株用于降解棉酚生产饲料蛋白的方法，包括a、制备种子；b、将种子以添加葡萄糖和玉米浆的棉籽饼粕为发酵底物，30℃条件下进行72h的厌氧发酵，再65℃下烘干得到棉籽饼粕饲料蛋白。本发明可促进棉粕在饲料行业中的应用，提高棉粕的利用率，对于提高资源利用率，降低饲料行业生产成本意义显著。
文档编号C12N1/16GK101892166SQ20091021720
公开日2010年11月24日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者于俊尧, 周生飞, 柳红艳, 蔡冬梅, 马立周 申请人:青岛康地恩生物科技有限公司