专利名称:热带假丝酵母菌、其组合物和应用的制作方法
热带假丝酵母菌、其组合物和应用
发明所属领域
本发明属于酒糟资源化利用与发酵饲料领域，具体地说，本发明涉及热带假丝酵母菌、含该菌的组合菌剂，及该酵母菌和组合菌剂在酒糟处理及单细胞蛋白发酵饲料中的应用。 背景技术：
酵母菌具有蛋白质含量高、易于培养，并可利用氨态氮等无机氮源合成菌体蛋白等优点，国内外均有不少关于酵母菌利用食品加工或发酵废弃物发酵生产单细胞蛋白的报道，下列文献体现了这一点。Azoulay E, Jouanneau F，Bertrand J C，et al. Fermentation Methods forprotein enrichmemt of Cassava and Lorn with Lanai da tropicalis. Applied andEnvironmental Microbiology, 1980, 39(1):41-47.
张敏，侯先志，考桂兰，等.酵母菌发酵生产饲料酵母条件的优化，饲料エ业，2010，31(8) :28-30.
但用粮食等淀粉质原料发酵转化酵母蛋白在经济上并不合算。对エ业化生产而言，开发廉价的酵母菌培养基质，特别是廉价碳源，以及适应该基质生长的酵母菌株，是饲料酵母生产是否具有エ业应用价值的决定因素。
酒糟是常用于生产酵母蛋白饲料的廉价原料。有实验分析表明酒糟的主要成分为纤维素、半纤维素、有机酸、甘油等，同时还含有能抑制酿酒酵母cerevisiae)生长的有害物质。
利用酵母菌处理酒糟等高浓度有机废液及利用低蛋白原料发酵制备单细胞蛋白，既可解决发酵生产中产生的废除物，也可产生高质量的饲料蛋白。但在生产上能否成功应用并取得较好的经济效益，取决于发酵时间的长短、酵母菌株对高温、PH及有害物质的耐受性及对多种廉价碳源的利用能力、酵母菌的营养价值等。即在エ业化生产上要求菌种对酒糟废液的处理具有更高的BOD负荷、氨氮去除率的实际效果，和菌体固形物得率高和菌体蛋白含量高的经济性。
已有的实验证明，不同的酵母菌株对酒糟等废弃物中有害物质的耐受能力、生长速度、耐高温能力、耐酸能力、水处理负荷及氨氮吸收能力、蛋白质含量等方面存在明显差异。诚然，目前公开的菌种还没有同时具有耐高温、废水处理容积负荷高，耐酸，生长速度快，蛋白质含量高的菌株。如果筛选到这样菌种，就可以不经特别处理直接用于对酒糟的处理，提高COD及氨氮的去除效率，有效缩短发酵处理时间，降低废水处理运行成本，提高蛋白饲料的营养价值和售价。
由于热带假丝酵母菌{Candida抗逆性强，能够利用木糖等优点，已应用于处理酒糟等低蛋白、高纤维的废弃物发酵或污水处理中。
下列文献是热带假丝酵母菌应用实例。
丁重阳，吴天祥，张梁，等.利用浓醪酒糟培养单细胞蛋白的研究，酿酒科技，2007，162 (12) :95-98.[0014]李兆春，郑朔方，侯文华，等.玉米酒精糟液生产高蛋白饲料的清洁生产エ艺，エ业用水与废水，2005，36 (3) :27-29.
刘建龙，姚源明，杨连生.双株酵母混合培养处理酒精蒸馏废水生产饲料酵母的研究，粮食与饲料エ业，2005，11:30-31.
赵建国，钟世博，张明祥.热带假丝酵母固体发酵黄酒糟生产饲料的研究，粮食与饲料エ业，2002,2 :22-23.
刘继栋，付灿，王同阳.热带假丝酵母在木薯淀粉废液治理中的应用研究，中国酿造，2009. 208(7) :121-123.
王升厚，菌糠单细胞蛋白饲料生产方法，中国发明专利申请号200410020561. 4，公开号 CN1579197A.Zneng b fang M fang L. Biomass production of yeast isolate from saladoil manufacturing wastewater. Bioresour Technol. 2005, 96(10):1183-1187.
目前，热带假丝酵母菌在实际生产应用上存在的主要问题是(1)现有公开的热带假丝酵母菌株耐高温性能差，最适生长温度低于40°C，在高温条件下的发酵性能稳定性差，不适合应用于对高温酒糟液的处理；(2)现有公开的热带假丝酵母菌株对酒糟的絮凝性较差，发酵固形物得率偏低，处理废水的容积负荷和对氨氮的去除率不高，导致实际应用中生产运行成本高。(3)由于热带假丝酵母菌不能直接利用废弃物中粗纤维，仅采用酵母菌发酵酒糟，对其中的纤维素、半纤维素等有机物不能有效转化和利用，从而降低了其对高纤维原料的转化为菌体蛋白的效果。
黑曲霉、木霉等霉菌含有丰富的纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶等酶系，往往被用干与酵母菌混合培养，以克服酵母菌对粗纤维难以利用的缺点。这方面已有不少研究报道。
吴祖芳，翁佩芳.复合菌固态生物转化啤酒糟发酵条件优化的研究，饲料エ业，2002，23(5) :32-34.
陶敏，王维嘉，蔡俊.啤酒糟发酵产高蛋白饲料菌种的配伍，饲料エ业，2011，32(11) :58-61.
张建华.酒糟发酵蛋白质饲料菌种筛选的研究，粮食与饲料エ业，2010，8:46-48.
王沁，赵学慧.纤维素分解菌W25的筛选与鉴定，华中农业大学学报，1992，11(2)，198-200.
曾任森，石木标，骆世明，等.緑色木霉代谢产物的植物毒性研究，应用生态学报，1998,9 (I) :64-66.
刘忠元，热带假丝酵母和黑曲霉发酵玉米秸杆的条件优化，吉林大学硕士论文，2005.
酵母菌和黑曲霉、木霉等的组合菌剂中菌种组成及其比例是否合适，关系到发酵饲料产品的安全性和对酒糟等废弃物中纤维质原料的利用率，决定产品的质量和产品的最终生产成本。
目前利用含酵母和霉菌的组合菌剂发酵饲料存在的主要问题是(I)多数研究报道含有木霉菌，存在饲用安全性问题。木霉虽然纤维素酶活高，但许多研究还指出，木霉培养物中存在着多种毒素，包括木霉素、T2毒素、粘毒素等，不适合直接用于食品、饲料中。(2)目前利用组合菌剂进行发酵饲料的研究报道发酵处理时间过长，均超过3天，不适合于エ业化快速生产需要，生产效率不高。(3)由于酵母菌和霉菌之间的生长速率差别较大，组合菌剂中若无合适的菌数比例，进行混合菌种发酵时会导致各菌种之间菌数比例不协调，不便于发酵生产过程控制和组合菌剂达到最佳处理效果。
发明技术内容
本发明的ー个目的是提供ー种新的热带假丝酵母菌株，该菌株耐高温，抗逆性強，生长快，絮凝性好，废水处理容积负荷高，耐酸性好，蛋白质含量高；解决了利用酒糟液进行饲料酵母蛋白发酵エ艺过程中，由于酵母菌容积负荷和固形物得率低而带来的整个生产效率低，酒糟料温高及发酵过程产热带来的酵母菌耐热等不适于エ业化生产的问题。
本发明的另ー个目的是提供ー种含有热带假丝酵母菌的饲料发酵菌剂组合物。菌剂组合物中添加有能够降解酒糟中纤维素和半纤维素的黑曲霉，可以提高酒糟中粗纤维的利用率，同时具有较好的饲用安全性。本发明的再ー个目的是提供热带假丝酵母菌株及其菌剂组合物在酒糟液处理及木薯酒糟等单细胞蛋白发酵饲料中的应用。
本发明公开了ー株新的热带假丝酵母菌，其特征在干，该菌株为热带假丝酵母WHCZ株tropicalis WHCZ)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2011355，保藏日期是2011年10月17日。热带假丝酵母WHCZ株从ー种传统白酒高温堆积料中分离经筛选获得。该菌株有如下特征热带假丝酵母WHCZ株最适生长温度40°C，并且在42°C高温下生长良好。该菌株能够利用木糖和甘油作为碳源。固体发酵条件下，与未发酵的木薯酒糟原料对照相比，接种菌株WHCZ对木薯酒糟粗蛋白含量达19. 12%，比对照提高56. 1%。液态发酵条件下，对高浓度的木薯酒糟液的BOD容积负荷达18. 5kg BOD/m3. d，对氨氮的去除率达76. 0%,固形物粗蛋白含量达45. 80%,分别比普通热带假丝酵母高56. 8%、29. 5%和13. 1%。WHCZ酵母处理高浓度小麦酒糟液的BOD容积负荷达18. 9kg BOD/m3. d，固形物得率为I. 75%，粗蛋白含量达36. 67%,分别比产朊假丝酵母提高62. 9%, 9. 4%和6. 6%。即热带假丝酵母WHCZ株具有耐高温，发酵酒糟饲料能力好，蛋白质含量高，对酒糟液的BOD容积负荷达高，COD及氨氮去除率高等特点。
热带假丝酵母WHCZ株形态特征是菌落乳白色、形状为规则圆形、表面较平坦、干燥，培养较长时间后，假菌丝分支分布，细胞呈圆形或椭圆形。
热带假丝酵母WHCZ株生化特征是可发酵利用果糖，蔗糖，D-半乳糖、D-木糖，甘油；不能发酵利用，纤维ニ糖，绵子糖，D-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖，D-海藻糖，L-鼠李糖。
热带假丝酵母WHCZ株耐高温及生长特征是YPD平板上划线接种，分别在33°C至42°C下培养均生长良好。
热带假丝酵母WHCZ株26S rDNA D1/D2区域基因序列分析显示热带假丝酵母WHCZ株与热带假丝酵母N02-2. I株的同源性超过98%。
本发明还公开了ー种含热带假丝酵母WHCZ株的菌剂组合物，该菌剂组合物对酒糟处理时间短，生产效率高，安全可靠，适合直接用于食品、饲料。
本发明还公开了ー种优化的发酵菌剂组合物，其特征在于它含有下列组份(重量百分比)
热带假丝酵母80%[0042]黑曲霉20%
其中热带酵母为CCTCC M2011355，黑曲霉为CICC 40613。
本发明中，热带酵母CCTCC M2011355按专利法要求进行了保藏；黑曲霉CICC40613可通过市售商业生物公司获得或菌种保藏机构获得，如中国エ业微生物菌种保藏管理中心保藏有该菌种，研究者可向该中心索取。黑曲霉{Aspergillus niger)在中国エ业微生物菌种保藏管理中心菌种目录中编号为CICC 40613，任何符合条件的研究者可向该保藏中心索取。
本发明公开的饲料发酵菌剂组合物为液态或固态。优先的，本发明公开的饲料发酵菌剂组合物为固态。
本发明还公开了制备固态发酵菌剂组合物的方法，包括如下步骤
I)菌种活化接种热带假丝酵母WHCZ CCTCC M2011355于灭菌的土豆汁 或米曲汁三角瓶培养基中，28 35°C摇床培养18-24小时；接种黑曲霉CICC 40613于灭菌的三角瓶麸皮固体培养基中，28 35°C恒温培养箱中培养70-80小时；
2)扩大培养固体培养的配料是麸皮80%、玉米面20%，用玉米糖化液润料，加I %浓硫酸，蒸煮冷散后，将活化后的酵母菌液和黑曲霉孢子按5%接种量分别接种后装盒，保持室温30°C左右，品温35°C左右，培养发酵40-60小时；
3)真空干燥对发酵后的各固体样品在45°C下进行真空干燥处理，使各样品含水率低于10% ；
4)混合包装按照热带假丝酵母黑曲霉重量比为4 1的比例混合后真空包装。
本发明还公开了新的热带假丝酵母菌WHCZ株在酒糟液处理中的应用。本发明的菌株单独使用时可有效的对小麦酒糟液，木薯酒糟液发酵，产生高质量的酵母菌蛋白。菌株耐高温，抗逆性強，生长快，絮凝性好，废水处理容积负荷高，耐酸性好，蛋白质含量高。有效地解决了现有技术中，由于酵母菌容积负荷和固形物得率低而带来的整个生产效率低，酒糟料温高及发酵过程产热带来的酵母菌耐热等不适于エ业化生产的问题。
本发明还公开了发酵菌剂组合物在单细胞蛋白发酵饲料上的应用。
本发明还公开了饲料发酵菌剂组合物在酒糟蛋白饲料发酵中的应用。组合菌剂可提高对酒糟等废弃物中纤维素和半纤维素的利用效率，饲料产品安全性好，并使酵母菌株发挥最大的生产潜力，最終降低生产成本，提高生产效率。
本发明与现有技术相比，优点表现在
I、本发明提供的热带假丝酵母WHCZ株是ー株新的菌株，处理酒糟液具有很高的BOD容积负荷和酵母泥负荷，其容积负荷达到18.9 kg B0D/m3.d，远远超过了现有公开的酵母菌株只有8-12kg BOD /m3. d的容积负荷；其酵母泥负荷达到2. 8 kg BOD/kg SS. d，也明显高于一般的酵母菌株只有I. 0-2. 0 kg BOD/kg SS. d的酵母泥负荷。热带假丝酵母WHCZ株絮凝性好，并可利用酒糟液中木糖、甘油等多种成分。使用该株酵母处理酒糟液效率高，运行成本低。
2、热带假丝酵母WHCZ株发酵酒糟饲料能力好，蛋白质含量高，对酒糟液的BOD容积负荷达高，COD及氨氮去除率高等特点。固体发酵条件下，与未发酵的木薯酒糟原料对照相比，接种菌株WHCZ对木薯酒糟粗蛋白含量达19. 12%，比对照提高56. 1%。液态发酵条件下，对高浓度的木薯酒糟液的BOD容积负荷达18. 5kg BOD/m3. d，对氨氮的去除率达76. 0%,固形物粗蛋白含量达45. 80%,分别比普通热带假丝酵母高56. 8%,29. 5%和13. 1%。WHCZ酵母处理高浓度小麦酒糟液的BOD容积负荷达18. 9kg BOD/m3. d，固形物得率为I. 75%，粗蛋白含量达36. 67%,分别比产朊假丝酵母提高62. 9%，9. 4%和6. 6%。
3、热带假丝酵母WHCZ株抗逆性好，生长速度快，可耐42°C高温，最适温度达40°C，在40°C高温下处理酒糟液效果比35°C更好；该菌株耐酸性好，可在pH3. 0酒糟液中生长，这些特性使得该菌株更适合应用于高温、酸性酒糟液的处理中，可降低处理工艺成本。使用本单ー菌株和组合菌剂，发酵时间短，液体和固体发酵时间均不超过24小吋。
4、热带假丝酵母WHCZ菌体蛋白质含量高，具有很高的吸收利用氨氮转化为菌体蛋白的能力。对酒糟液的COD和氨氮去除率高。热带假丝酵母WHCZ株与黑曲霉混合处理木薯酒糟液，与不添加菌剂的对照组相比COD降低了 72%，氨氮下降了 80%，固形物粗蛋白提高了 50%以上。
5、根据酵母菌和黑曲霉生长速度和培养条件存在较大差异，对这2种菌进行分别培养，然后按照能发挥组合菌剂最大效率的合适比例复合而成。本发明复合菌剂按4:1比例混合含酵母菌和黑曲霉2种菌剂，具有糖化和酵母菌体蛋白发酵双重功能，充分考虑到酒糟等原料含粗纤维的特点，黑曲霉可降解纤维素和木聚糖，提供给WHCZ作为可利用的碳源。复合菌剂单独培养并按所需的比例混合制备而成，可保证各菌按照最佳菌数比例混合，制备的活性干菌粉使用方便。
6、本发明的酵母细胞可以长时间反复利用。酒糟无需灭菌可连续发酵5个批次。
图I是热带假丝酵母菌WHCZ株26S rDNA D1/D2区序列系统发育树图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进ー步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。特别说明的是在本发明中涉及的菌种未公开的进行了专利程序寄存，其它菌种处于公开状态，科学工作者可向其保藏机构索取，具体信息如下
1，热带假丝酵母WHCZ株专利寄存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号=CCTCCM2011355 ；
2，产朊假丝酵母CICC 1807，中国エ业微生物菌种保藏管理中心，已上目录，公开状态；
3，热带假丝酵母CICC 1254，中国エ业微生物菌种保藏管理中心，已上目录，公开状态；
4，黑曲霉CICC 40613，中国エ业微生物菌种保藏管理中心，已上目录，公开状态。实施例
实施例I 热带假丝酵母WHCZ的分离与鉴定
I. I热带假丝酵母WHCZ株的分离从白酒及酒精厂环境采集堆积发酵料、废弃的酒糟、废水作为分离样品，按来源不同分别接入液体木糖富集培养基中。250毫升三角瓶装量50毫升，接入固体或液体分离样品约I克，将样品活化后加入到的含木糖的酸性液体富集培养基中，培养基配方是木糖30克，蛋白胨15克，酵母膏15克，pH4. 0-4. 5水1000毫升。转速200 rpm，温度35°C时富集培养48小时，然后取100 经过一定梯度稀释后的培养液涂布到YPD培养基固体平板上，42°C培养48小时后，挑取典型酵母形态的单菌落，再在相同培养基固体平板上重复划线纯化三次后，4°C保存。然后通过木薯酒糟液和稻草酸水解液发酵实验检验这些分离出来的菌株在发酵过程中对COD的去除率、对糖的利用、发酵酒糟离心分离固形物的得率及粗蛋白含量，最后根据发酵试验结果筛选出COD去除率和粗蛋白含量均较高的菌株。本发明人将分离的一株新的热带假丝酵母菌WHCZ株tropicalis WHCZ)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011355。保藏日为2011年10月17日。
热带假丝酵母菌WHCZ株的鉴定通过形态特征观察、生理生化测定及26S rDNAD1/D2区域基因序列分析结果对WHCZ进行鉴定。在鉴定中，本实验选择热带假丝酵母Candida tropicalis CGMCC 2. 1775，产朊假丝酵母util is CGMCC 2. 1028 和酿 酒酵母焊Ce1S cerevisiae CCTCC AY92003菌株作为对照菌株。热带假丝酵母Candida tropicalis CGMCC 2. 1775 和SaccAaro焊ces cerevisiae CCTCC AY92003 为常用普通微生物菌种，分别登载于中国普通微生物菌种保藏管理中心和中国典型培养物保藏中心目录，处于公开状态，科学工作者可向保藏中心索取。
热带假丝酵母菌WHCZ株形态特征观察菌落乳白色、形状为规则圆形、表面较平坦、干燥，培养较长时间后，假菌丝分支分布，细胞呈圆形或椭圆形。
通过26S rDNA D1/D2区域序列分析进行系统发育地位鉴定
用酵母菌基因组DNA提取试剂盒(BioFlux杭州博日科技有限公司提供)提取热带假丝酵母菌WHCZ株的全DNA，然后以提取出来的全DNA为模板，进行PCR扩增，正向引物NLl 5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3，，反向引物 NL4 :5’- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，。按以下的反应条件共进行30个循环94°C预变性5 min,94°C变性I min,59°C退火I min,72°C延伸I min，30个循环后，72°C延伸5 min。所得PCR产物由北京奥科生物技术公司进行纯化及序列測定。将测定出来的热带假丝酵母菌WHCZ株的26S rDNA D1/D2区域与GenBank核酸序列数据库中的序列进行比对，采用ClustalX软件进行匹配排列(align)，用MEGA4. 0软件中的neighbor-joining分析法构建系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验,最后用TreeView软件显示系统树。
实验得到571bp的基因序列，在Genbank核酸序列数据库中进行同源序列捜索，W￡Z 与 Candida tropicalis N02-2. I 的同源性超过 98%,符合 Kuttzman&Robnett 所定的同种内不同菌株见差异不超过3%的标准。图I是根据26S rDNA D1/D2区域序列所做的系统发育树。
:热带假丝酵母菌WHCZ株的生理生化实验结果
1.2.3.1按照中国科学院微生物研究所《菌种保藏手册》(科学出版社.北京。1980，p368-370)提供的方法，对所分离的酵母菌株WHCZ进行碳源利用及生理生化实验，结果如下
表I.酵母菌WHCZ菌株生理生化实验结果
权利要求
1.一株新的热带假丝酵母菌，其特征在于，该菌株为热带假丝酵母WHCZ株tropicalis WHCZ)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011355。
2.一种含权利要求
I中所述菌株的发酵菌剂组合物，其特征在于它含有下列组份，以重量百分比计
热带假丝酵母80% 黑曲霉20% 其中热带酵母为CCTCC M2011355，黑曲霉为CICC 40613。
3.根据权利要求
2中所述的发酵饲料菌剂组合物，其特征在于所述的发酵菌剂组合物为固态菌剂。
4.制备权利要求
3中所述的菌剂组合物的方法，该方法包括如下步骤 菌种活化接种热带假丝酵母WHCZ，CCTCC M2011355于灭菌的土豆汁或米曲汁三角瓶培养基中，28 35°C摇床培养18-24小时；接种黑曲霉CICC 40613于灭菌的三角瓶麸皮固体培养基中，28 35°C恒温培养箱中培养70-80小时； 扩大培养固体培养的配料是麸皮80%、玉米面20%，用玉米糖化液润料，加1%浓硫酸，蒸煮冷散后，将活化后的酵母菌液和黑曲霉孢子按5%接种量分别接种后装盒，保持室温30°C左右，品温35°C左右，培养发酵40-60小时； 真空干燥对发酵后的各固体样品在45°C下进行真空干燥处理，使各样品含水率低于10% ； 混合包装按照热带假丝酵母黑曲霉重量比为4 1的比例混合后真空包装。
5.权利要求
I所述的热带假丝酵母WHCZ株在酒糟处理上的应用。
6.权利要求
2或3中所述的任何一种菌剂组合物在单细胞蛋白发酵饲料上的应用。
专利摘要
本发明提供了一株新的热带假丝酵母菌，以及热带假丝酵母菌与黑曲霉菌剂组合物在酒糟处理和单细胞蛋白发酵饲料中的应用。本发明还提供制备固体发酵菌剂的方法。本发明所分离的热带假丝酵母菌，具有能够利用多种碳源、抗逆性强，耐高温性和絮凝性好，蛋白含量高等特点，用于处理酒糟液具有很高的负荷，对酒糟液的COD和氨氮去除率高，并能够增加酒糟离心后的固形物得率和蛋白质含量。采用该菌株发酵可提高酒糟饲料蛋白质含量。
文档编号A23K1/16GKCN102433266 B发布类型授权 专利申请号CN 201110380117
公开日2013年1月9日 申请日期2011年11月25日
发明者缪礼鸿, 曾驰, 励飞, 梅雪臣 申请人:武汉工业学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan