专利名称：：一种新型猪链球菌病四价灭活疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及兽医生物制品
技术领域：
，特别涉及一种猪链球菌病四价灭活疫苗。
背景技术：
：猪链球菌病是一种常见的传染病，是由多种不同群的链球菌引起的不同症状类型的总称。目前许多国家和地区都有猪链球菌病的报道，并且其流行呈明显上升趋势。该病以导致猪败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎、关节炎为主要特征，在某些特定诱因作用下，发病猪群死亡率可达80%左右，严重威胁着养猪业的发展。国内猪链球菌病自上世纪60年代以来，在广西、广东、福建、湖南、江西、安徽、江苏、四川等地陆续发生，该病流行范围广、发病率和死亡率高，造成了严重的经济损失。链球菌的血清群多，主要为兰氏C群，其次为兰氏D、E群。各血清群之间交互免疫能力不强，所以，有些猪场虽然进行了该病的免疫预防，但仍得不到有效控制，免疫失败现象时有发生。究其原因，主要是接种疫苗的菌株仅含1-2个血清群，与当时当地流行的猪链球菌病的病原血清群不相符所致。近年来，在我国各地发生的猪链球菌病，其病原血清群各有差异，不尽相同，给该病的预防和治疗带来了一定难度。目前用于猪链球菌病免疫预防的疫苗主要是以C群兽疫链球菌为疫苗株的灭活疫苗或弱毒疫苗，而该病的病原流行菌株已不局限于C群兽疫链球菌，D、E、L、R等血清群的链球菌在病原学调查中也占有一定比例。因此，需要发明一种新的猪链球菌病四价灭活疫苗以解决上述问题。
发明内容本发明的目的之一是提供一种安全、可靠的猪链球菌病四价灭活疫苗，所述疫苗可同时预防免疫由兰氏C群、D群、E群链球菌和猪链球菌2型引起的四种猪链球菌病。本发明的另一个目的是提供一种制备猪链球菌病四价灭活疫苗的方法。本发明提供一种猪链球菌病四价灭活疫苗，所述猪链球菌病四价灭活疫苗包含抗原和佐剂；其中，所述抗原包含已灭活的兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138抗原、兰氏D群链球菌C55914抗原、兰氏E群链球菌C55949抗原和猪链球菌2型HA9801抗原；所述佐剂为氢氧化铝胶。作为本发明猪链球菌病四价灭活疫苗的优选实施方式，所述四种抗原的比例为"兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138抗原兰氏D群链球菌C55914抗原兰氏E群链球菌C55949抗原猪链球菌2型HA9801抗原二5:5:5:2";所述四种抗原总体积为所述疫苗总体积的75%85%。作为本发明猪链球菌病四价灭活疫苗的优选实施方式，所述佐剂的体积为所述疫苗总体积的15%25%。作为本发明猪链球菌病四价灭活疫苗的优选实施方式，所述疫苗中还含有所述疫苗总量0.01%的硫柳荥。—种猪链球菌病四价灭活疫苗的制备方法，包含以下步骤3a.分别将C群C55138菌种、D群C55914菌种、E群C55949菌种和猪链球菌2型HA9801菌种增殖培养，得到C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液；b.分别向上述培养好C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液中按总量加入0.2%的甲醛溶液，放置于37。C灭活，其间搅拌35次。c.向上述已灭活的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液中加入适量的15%25%氢氧化铝胶摇匀，常温静置沉淀，氢氧化铝胶和所述菌液中的抗原结合形成颗粒状结合物，静置，在重力作用下沉降。除去上层清液后，以无菌生理盐水重悬沉淀物，从而得到已浓縮、去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液；d.分别将上述已去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液按照5:5:5:2的比例混合均匀，并加入一定量的疫苗防腐剂硫柳汞，从而得到新型猪链球菌病四价灭活疫苗；e.以适量体积分装猪链球菌病四价灭活疫苗，盖上瓶盖，并压铝盖。在上述制备过程中，从步骤a培养好的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液中取样，进行纯粹检验和活菌计数；从步骤b已灭活的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液取样进行灭活检验和安检；对步骤d得到的猪链球菌病四价灭活疫苗进行无菌检验、安全检验和疫苗效力检验，以确保疫苗的安全性、可靠性。随着畜牧业的发展，生物技术在疫病防制方面得到广泛应用.并取得了显著成效。但近年来免疫猪群屡屡发生免疫失败的情况，造成了较大的经济损失。七、八十年代猪链球菌病在我国许多省(市)都有发生，由此研制出了猪链球菌病灭活疫苗和弱毒活疫苗，使该病曾一度得到控制。近年有关猪群暴发该病的报道很多，且常常和其他疾病合并发生，发病率、死亡率均很高。有的猪场虽然进行了预防该病的l-2个血清群疫苗免疫接种，但仍得不到有效控制。有关学者对各地猪链球菌病的流行病学调查表明，目前该病的流行株已不仅仅局限于C群兽疫链菌，D、E、L、R等血清群的链球菌也占有很大比例。目前，用于该病免疫预防的疫苗主要是以C群兽疫链球菌为疫苗株的灭活疫苗或弱毒活疫苗，而与当地的猪链球菌病流行株并不相符，这正是猪链球菌病不能得到有效控制的主要原因。本发明制备的新型猪链球菌病四价灭活疫苗，克服了目前市面上现有疫苗只能预防由链球菌兰氏C群引起的链球菌感染的不足。本发明采用了独特的毒素去除方法和适宜的配苗技术制备得到了猪链球菌病四价灭活疫苗，该疫苗可以同时预防由兰氏C群、D群、E群链球菌和猪链球菌2型引起的四种猪链球菌病。达到了一针多防的效果。本发明制备得到的疫苗具有以下特点(1)本发明的新型猪链球菌病四价灭活疫苗的菌种采用菌种库筛选的菌种并且菌种均经敏感猪体复壮，不仅免疫原性强、抗原谱广、遗传性能稳定，而且是近年来猪链球菌病的流行株，以其作为菌种对实际防疫更具有针对性。(2)本发明的新鲜猪链球菌病四价灭活疫苗，一次接种可同时预防由兰氏C群、D群、E群链球菌和猪链球菌2型引起的四种猪链球菌病。具有现用疫苗无法到达的便捷性和实用性。(3)本发明的新型猪链球菌病四价灭活疫苗中还含有0.01%体积比的硫柳汞。硫柳汞是一种可以抑制甚至杀灭霉菌的化学物质。在疫苗出厂前，加入硫柳汞，防止在疫苗的生产和使用过程中受到霉菌污染。(4)本发明的一种新型猪链球菌病四价灭活疫苗的制备过程中采用了独特的毒素去除技术。在细菌培养增殖过程中，细菌凋亡破裂后释放出毒素，对动物机体有毒害作用。本发明中采用独特的毒素去除技术，使用具有吸附作用的氢氧化铝胶吸附细菌菌体，氢氧化铝胶和细菌结合后形成颗粒，并在重力作用下，沉降于液体下面，而毒素等小物质则不能吸附，通过除去上层清液而达到了去除毒素的效果，从而得到去除毒素的菌液，大大减少了疫苗中由细菌毒素引起的副反应，提高了疫苗的安全性。(5)本发明的一种新型猪链球菌病四价灭活疫苗的制备过程中，经过了灭活检验、安检和无菌检验步骤，严格控制疫苗质量，提高了疫苗的可靠性和安全性。具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。本发明的具体实验方法可参见《中华人民共和国兽药典(二〇〇五年版)》及附录。其他未特别注明的试剂或原料均可由本领域技术人员根据现有技术获得。实施例1—种新型猪链球菌病四价灭活疫苗，由已灭活、浓縮并且安检合格，采用独特的毒素去除技术处理过的兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138抗原、兰氏D群链球菌C55914抗原、兰氏E群链球菌C55949抗原和猪链球菌2型HA9801抗原，与佐剂氢氧化铝胶混合配制得到。1.菌种a.兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138株中国兽医药品监察所鉴定、保管、供应。b.兰氏D群链球菌C55914株中国兽医药品监察所鉴定、保管、供应。c.兰氏E群链球菌C55949株中国兽医药品监察所鉴定、保管、供应。d.猪链球菌2型HA9801株中国兽医药品监察所鉴定、保管、供应。将上述兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138株、猪链球菌2型HA9801株经静脉注射13月龄的健康敏感猪，兰氏D群链球菌C55914株、兰氏E群链球菌C55949株经关节腔注射13月龄的健康敏感猪，在负压动物房经敏感猪体复壮并冻干保存。2.菌种的繁殖a.—级种子的繁殖上述冻干菌种，用马丁肉汤稀释，划线接种于鲜血平皿上，置37t:培养1824小时，选取符合要求的菌落，接种于含有羊鲜血琼脂斜面上，37t:培养1824小时，作为一级种子。b.二级种子的繁殖用少量缓冲肉汤洗上述一级种子的血琼脂斜面培养物，接种于加有1%4%血清和0.2%葡萄糖的缓冲肉汤大管中，置37t:培养1824小时取出，经检验纯粹后作为二级种子。3.菌液的培养在链球菌培养基(商售)中加入血清2%、葡萄糖0.2X，将C群C55138菌种、D群C55914菌种、E群C55949菌种和猪链球菌2型HA9801菌种分别按5%的量加进培养基中分别培养，混匀后置37t:中培养；当菌液pH降低到6以下时停止培养。得到四种菌液。4.纯粹检验从上述培养好的四种菌液中取样，用马丁琼脂依《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。5.活菌计数从上述培养好的四种菌液中取样，用血琼脂平皿培养进行活菌计数，以确定培养菌数。6.灭活向上述四种培养好的菌液中，按总量加入0.2X的甲醛溶液，放置于37t:灭活，其间搅拌35次。7.灭活检验灭活后，取上述四种已灭活的菌液5mL接种于100mL含2X血清、0.2%的葡萄糖的链球菌培养基中37t:培养24小时，再移植于上述100mL培养基中37。C培养24小时。取灭活菌液0.5mL接种于血琼脂平皿上，37t:培养24小时。两种方法培养后，均应无菌生长。8.毒素检验取上述四种已灭活的菌液静脉注射1822g的SPF小鼠5只，每只0.2mL，三天内5/5健活。9.沉淀浓縮向上述四种已灭活并安检合格的菌液中加入适量的氢氧化铝胶摇匀，常温静置沉淀进行沉淀浓縮。10.去毒素向上述四种已灭活、安检合格并浓縮的菌液中加入1525%的氢氧化铝胶，摇匀，所述氢氧化铝胶和所述灭活后的菌液中的抗原结合形成颗粒状结合物，在重力作用下沉降。静置，除去上层清液后，以无菌生理盐水重悬沉淀物，从而得到去除了毒素的菌液。11.疫苗配制将按照上述步骤处理过的四种菌液根据活菌计数的结果，按照每头份所述疫苗含C55138株50亿、C55914株50亿、C55949株50亿、猪链球菌2型HA9801株20亿混合，并加入疫苗总量0.01%的疫苗防腐剂硫柳汞，从而得到猪链球菌病四价灭活疫苗。12.疫苗的无菌检验取上述疫苗，按照《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。13.疫苗的安全检验取上述疫苗肌肉注射健康易感猪4头，每头4mL，10天内4/4健活，方为合格。14.分装以20m1/瓶100m1/瓶分装，盖上瓶盖，并压铝盖。实施例2疫苗的效力检验用健康易感猪20头，各肌肉注射上述疫苗2ml，含1个使用剂量，21天后，将注射了疫苗的免疫试验猪等分为四组，分别用所述C群C55138、D群C55914、E群C55949链球菌强毒株攻击和猪链球菌2型HA9801株。对照组猪20头，等分为四组，分别用所述四种C群C55138、D群C55914、E群C55949链球菌强毒株和猪链球菌2型HA9801株攻击。链球菌C群C55138株选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，注射致死量的C群C55138株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上死亡为合格。链球菌D群C55914株取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，注射致死量的D群C55914株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护，对照猪5/5发病为合格。链球菌E群C55949株取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，注射致死量的E群C55949株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护，对照猪5/5发病为合格。猪链球菌2型HA9801株取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，注射致死量的猪链球菌2型HA9801株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上死亡为合格。检验结果如表l所示。表1疫苗效力检验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。权利要求一种猪链球菌病四价灭活疫苗，其特征是，所述猪链球菌病四价灭活疫苗包含抗原和佐剂；所述抗原包含已灭活的兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138抗原、兰氏D群链球菌C55914抗原、兰氏E群链球菌C55949抗原和猪链球菌2型HA9801抗原；所述佐剂为氢氧化铝胶。2.如权利要求1所述的一种猪链球菌病四价灭活疫苗，其特征是，所述四种抗原的比例为"兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138抗原兰氏D群链球菌C55914抗原兰氏E群链球菌C55949抗原猪链球菌2型HA9801抗原二5:5:5:2";所述四种抗原总体积为所述疫苗总体积的75%85%。3.如权利要求1所述的一种猪链球菌病四价灭活疫苗，其特征是，所述佐剂的体积为所述疫苗总体积的15%25%。4.如权利要求1所述的一种猪链球菌病四价灭活疫苗，其特征是，所述猪链球菌病四价灭活疫苗中还含有疫苗总量0.01%的硫柳汞。5.—种猪链球菌病四价灭活疫苗的制备方法，其特征是，包含如下步骤a.分别将C群C55138菌种、D群C55914菌种、E群C55949菌种和猪链球菌2型HA9801菌种增殖培养，得到C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液；b.分别将步骤a培养得到的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液进行灭活；c.分别向已灭活的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型说9801菌液中加入15%25%氢氧化铝胶，摇匀，常温静置沉淀除去上层清液后，以无菌生理盐水重悬沉淀物，得到已浓縮、去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液；d.将上述已灭活、浓縮并且已去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液按照5:5:5:2的比例混合均匀，并加入疫苗总量0.01%的硫柳汞，得到猪链球菌病四价灭活疫苗；e.对步骤d得到的猪链球菌病四价灭活疫苗进行分装。6.如权利要求5所述的一种新型猪链球菌病四价灭活疫苗的制备方法，其特征是，对步骤a得到的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液进行纯粹检验和活菌计数。7.如权利要求5所述的一种新型猪链球菌病四价灭活疫苗的制备方法，其特征是，步骤b灭活后分别对C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和猪链球菌2型HA9801菌液进行灭活检验和安检。8.如权利要求5所述的一种新型猪链球菌病四价灭活疫苗的制备方法，其特征是，对步骤d配制得到的猪链球菌病四价灭活疫苗进行无菌检验、安全检验和效力检验。全文摘要一种新型猪链球菌病四价灭活疫苗，采用兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138抗原、兰氏D群链球菌C55914抗原、兰氏E群链球菌C55949抗原和猪链球菌2型HA9801抗原，经过菌种繁殖、菌液培养、纯粹检验、活菌计数、灭活、灭活检验、沉淀浓缩、去毒素、混合配苗、疫苗无菌检验、疫苗安全检验、效力检验和分装步骤制备而成。本发明制备得到的新型猪链球菌病四价灭活疫苗，通过一次接种可以同时预防由兰氏C群、D群、E群链球菌和猪链球菌2型引起的四种猪链球菌病，具有广阔的应用前景。文档编号A61K39/116GK101703769SQ200910193899公开日2010年5月12日申请日期2009年11月13日优先权日2009年11月13日发明者以体强,张毓金,杨球,林旭埜,游启有,王少英,郭沈涛申请人:广东永顺生物制药有限公司