本发明属于生物技术领域；具体说来，本发明确立了猪链球菌9个血清型（3、4、5、8、10、16、19、23、25型）用分子生物学检测方法，用于猪链球菌这9个血清型菌株的鉴定与检测，在科学研究、医学临床诊断和兽医临床诊断上有较大的使用价值。
背景技术：
猪链球菌能引起猪和其他家畜多种临床疾病，早期按照荚膜抗原的差异可分为35个血清型（1-34，1/2）；2005年，Nill等从基因水平证实其中的32及34型为鼠口腔链球菌（Streptococcus orisratti）。猪链球菌的血清型鉴定一直沿用耗时且不易观察的血清凝集或协同凝集方法，除Smith等建立了猪链球菌1（14）型、2（1/2）型、7型和9型的分子生物学检测方法，其余血清型均尚未建立简单快速的分子生物学检测方法。
近年的研究发现，虽然猪链球菌2型仍是引起猪发病的主要血清型，但其余血清型也在发病猪中经常分离到，尤其是猪链球菌3型、4型和8型，在多个国家的发病猪分离的猪链球菌中比例较高。Zigong Wei等，曾对2003-2007年在中国发病猪分离的407株猪链球菌进行分析，发现其血清型主要为2型（43.2%），其次是3、4、5、7、8型和1/2型，也存在6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、25和28型。对加拿大2001年-2007年临床发病猪中分离的猪链球菌进行血清定型发现，引起猪发病的主要血清型为2型、3型，其次是1/2、4、7、8型。意大利发病猪分离的猪链球菌主要为2型，其次是1型、1/2型和8型，而在丹麦最常见的也是2型，其次是7型、3型、4型和8型[9]。从日本发病猪分离的猪链球菌主要为2型，其次是7型、1/2型和3型[10]。2010年，在朝鲜对引起猪多浆膜炎的猪链球菌分析发现，其主要血清型是3型和4型。并且人畜共患的血清型有逐渐增多的趋势，猪链球菌4型、16性均有感染人并发病的报道。这些数据显示，建立除猪链球菌1(14)型、2(1/2) 型、7型和9型之外其他血清型的分子生物学检测方法是十分必要的。
技术实现要素：
本发明针对上述现有猪链球菌检测技术的不足，开展了深入研究和测试，
建立了猪链球菌9种血清型（3、4、5、8、10、16、19、23、25型）的PCR检测方法。
（一）确立了核酸检测所需要的引物序列，针对猪链球菌3、4、5、8、10、16、19、23、25型的血清型特异性基因，分别设计引物序列（即序列表中SEQ ID NO.1- NO.18），引物序列见图1。
（二）确立了检测反应种类，可以采用多种检测反应，包括普通的聚合酶链式反应（通常，这类反应产物用核酸电泳进行检测）、荧光聚合酶链式反应（通常，这类反应产物用荧光物质进行检测）或依赖核酸序列扩增反应（通常，这类反应产物用电化学发光物质进行检测）；目前，聚合酶链式反应和荧光聚合酶链式反应最有推广价值。
（三）确立了检测反应体系和反应条件，以普通聚合酶链式反应为例，在聚合酶链式反应管中依次加入纯水11微升、2倍聚合酶链式反应预混液12.5微升（含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四种核苷酸，Taq酶）、上下游引物各0.5微升（浓度为10微摩尔每升）、需要检测的猪链球菌核酸0.5微升（从分离菌株或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的）；然后将聚合酶链式反应体系密闭，置于聚合酶链式反应仪器（PCR仪）上进行聚合酶链式反应，9个血清型的反应条件见图1；反应结束后，在反应产物中加入核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现目的条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：
图1 是猪链球菌3、4、5、8、10、16、19、23、25型检测PCR的引物和反应条件。
具体实施方式
下面通过实施例，说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于这个实施例。
本实施例用聚合酶链式反应，对199株猪链球菌临床分离株进行血清型检测，包括如下步骤：
第一步（合成引物）：按照本发明指定的核酸序列（即序列表中SEQ ID NO.1- NO.18），人工合成聚合酶链式反应所需要的上游引物和下游引物；
第二步（配置聚合酶链式反应体系）：分别配制猪链球菌3、4、5、8、10、16、19、23、25型的反应体系，在聚合酶链式反应管中依次加入纯水11微升、2倍聚合酶链式反应预混液12.5微升（含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四种核苷酸，Taq酶）、上下游引物各0.5微升（浓度为10微摩尔每升）、需要检测的猪链球菌核酸0.5微升（从分离菌株或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的）；
第三步（聚合酶链式反应）：然后将聚合酶链式反应体系密闭，置于聚合酶链式反应仪器（PCR仪）上进行聚合酶链式反应，依据9个血清型的反应条件分别进行聚合酶链式反应；
第四步（聚合酶链式反应结果检测）：反应结束后，在反应产物中加入核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现目的条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
实际应用结果：199株猪链球菌临床分离株中，用PCR方法共检测到3型13株，4型4株，5型5株，8型1株，10型4株，16型11株，19型1株，23型3株，25型1株。除有1株多重凝集菌株（HN153）定为3型；2株自凝菌株（HuN6和ZJXS046），1株多重凝集菌株（SS39）和1株不能与全部33个血清型定型血清反应的菌株（HN144）定为5型；1株不能与全部33个血清型定型血清反应的菌株（WZ61-2）定为16型；1株自凝菌株（31622）定为23型，其余菌株的血清学与PCR方法的定型结果一致。经荚膜染色发现HN144 和WZ61-2无荚膜。
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 猪链球菌3、4、5、8、10、16、19、23、25型血清型的分子生物学检测方法
<160> 18
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 根据猪链球菌3型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌3型检测所需要的上游引物
<400> 1
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<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>根据猪链球菌3型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌3型检测所需要的下游引物
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 根据猪链球菌4型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌4型检测所需要的上游引物
<400> 3
tacttcagtt aggttcctcg ca 22
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>根据猪链球菌4型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌4型检测所需要的下游引物
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 根据猪链球菌5型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌5型检测所需要的上游引物
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>根据猪链球菌5型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌5型检测所需要的下游引物
<400> 6
tccaaacatt atcccctatt 20
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 根据猪链球菌8型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌8型检测所需要的上游引物
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atctgttgta atggtcgc 18
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<212> DNA
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<223>根据猪链球菌8型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌8型检测所需要的下游引物
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ctattcctct tggtgtga 18
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<223> 根据猪链球菌10型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌10型检测所需要的上游引物
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<212> DNA
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<223>根据猪链球菌10型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌10型检测所需要的下游引物
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<212> DNA
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<223> 根据猪链球菌16型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌16型检测所需要的上游引物
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atgatttttg taactgtagg 20
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<212> DNA
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<223>根据猪链球菌16型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌16型检测所需要的下游引物
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ccagcttttc tatttctttc 20
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<212> DNA
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<223> 根据猪链球菌19型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌19型检测所需要的上游引物
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aggctacaaa gcgatagaac t 21
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<212> DNA
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<223>根据猪链球菌19型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌19型检测所需要的下游引物
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<212> DNA
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<223> 根据猪链球菌23型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌23型检测所需要的上游引物
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<223>根据猪链球菌23型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌23型检测所需要的下游引物
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<212> DNA
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<223> 根据猪链球菌25型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌25型检测所需要的上游引物
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<223>根据猪链球菌3型的血清型特异性基因的核酸序列而设计，作为猪链球菌3型检测所需要的下游引物
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