本发明涉及一种红鳍东方鲀苗种筛选引物及方法，尤其是一种可节省人力物力、降低选种成本、确保子代性状良好的筛选红鳍东方鲀苗种的SNP引物及筛选方法。
背景技术：
红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是我国北方沿海重要的海水养殖经济鱼类。
传统的鱼类苗种选育方法是表型选择法，即选择体重、体长及体全长等生长性状良好的红鳍东方鲀为亲本，需要定期检测，逐级筛选，不仅耗费大量的人力物力，周期长、效率低，而且还会存在所选亲本遗传基因并不优良的问题。
分子标记辅助育种是快速获得理想家系、品系或品种的现代生物育种的最理想的方法之一。单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指基因组DNA上由单个核苷酸突变所引起的DNA序列多态性，通过确定SNP及基因型分型进行选种是成熟的分子生物技术。该技术已在畜禽育种及生产中得到了广泛的应用，但在水产动物育种和养殖中才刚刚涉及。与传统育种方法相比，分子标记辅助育种提高了选育效率。
技术实现要素：
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可节省人力物力、降低选种成本、确保子代性状良好的筛选红鳍东方鲀苗种的SNP引物及筛选方法。
本发明的技术解决方案是：一种筛选红鳍东方鲀苗种的SNP引物，其特征在于所述SNP引物DNA序列如下：
上游引物F：5′-aactcaagtcgaggcaatgc-3′；
下游引物R：5′-tccgaatagatgaccgatgc-3′。
一种以上述SNP引物筛选红鳍东方鲀苗种的方法，其特征在于按照如下步骤进行：
a. 提取待测红鳍东方鲀的基因组DNA；
b. 用所得到的基因组DNA为模板，以所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，获得PCR产物；
c. 对所得到的PCR产物进行测序、基因分型，筛选出具有如下DNA序列且自5′端起第145位点基因型为纯合TT的红鳍东方鲀：
aactcaagtcgaggcaatgcgggtggcagaaattacagaatgtaggcgaggagcgaatggacaaatgcccagcgacttgagaggagagaagggagtggccttacctggtacccctgtggaatggttcactgtaaaacaaaaggcnaacaatgccccgaaaagctcttcacaatgattgaaacaggagagctacctattgtttaagcgtttgatgagggatcttgttattattttatacactgcaccattccatactgggaggaattctttgttaatgcaatgtaaaagactagcttagctgctgagacacaaacaagagcttaatgtcacctccatatgggggggctgcagcagggggctccaggtgggacaaatccatctgggttgtagccaatcagagagctgcaagctggctttgcaaactaatggtccaccttgttccttgaggtttgtggaggtatcagccctttgaccccgagtggagtcattatgctccttcgctaggacaggatgttctgtcagaagtcgcgcataacagtaaaaattaactcgtttttatgctttatatccccttcattgactgagtgcagcatcggtcatctattcgga。
本发明发现了红鳍东方鲀与体重、体长及体全长相关的SNP遗传标记并设计出相关引物，能够快速、高效、准确的检测红鳍东方鲀的生长性状，确定红鳍东方鲀中属于生长速度快的个体，进而能够有效用于红鳍东方鲀的分子标记辅助育种。与现有技术相比，不但可节省人力物力、降低选种成本，而且可高准确性地选育红鳍东方鲀优良家系、品系或品种。
附图说明
图1是本发明实施例SNP标记位点处TT、TA 和AA三种基因型的测序峰图。
具体实施方式
1．与红鳍东方鲀生长性状相关的SNP标记的获得
1.1 红鳍东方鲀群体的获得
所采用的群体为大连某红鳍东方鲀养殖场孵化的其中一个家系的红鳍东方鲀，从该家系随机选出300个个体，先对这300个个体进行体重、体长和体全长等生长性状表型值进行测定和记录，然后剪取100个鱼体尾鳍鳍条于80%乙醇中，在-20℃冰箱中保存，用于基因组DNA的提取。
1.2 红鳍东方鲀基因组DNA提取
采用常规酚仿法抽提红鳍东方鲀鳍条中的基因组DNA，具体步骤如下：
（1）取红鳍东方鲀尾鳍组织100~120mg于1.5毫升的离心管中，并用眼科剪尽量将其剪碎（粉末状）；
（2）向已剪碎尾鳍的离心管中加入700μL DNA提取液；
（3）加蛋白酶K（20mg/ml） 5μL，轻轻混匀，放入55℃水浴中消化2~4小时；
（4）将溶液冷却至室温，加等体积苯酚，抽提10分钟，12000rpm离心10分钟；
（5）取上清加入一新的1.5ml离心管中，加等体积酚：仿抽提10分钟，12000rpm离心10分钟；
（6） 取上清加入一新的1.5ml离心管中，加等体积氯仿抽提10分钟，12000rpm离心10分钟；
（7）取上清加入一新的离心管中，加1/5体积3mol NaAc（PH5.2）和2倍体积无水乙醇，12000rpm离心5分钟；
（8）弃掉乙醇溶液，用70%乙醇洗沉淀2次，5000rpm离心5分钟；
（9）弃掉乙醇，室温放置10-20分钟，用100μL TE溶解沉淀DNA。
用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA， DNA溶液于-4℃或-20℃保存备用。
1.3 以类胰岛素生长因子-1（Insulin-like growth factor 1，IGF-1，GenBank：AB465576）基因为红鳍东方鲀生长性状的主效候选基因，采用对多个个体基因测序获得红鳍东方鲀生长性状相关的SNP标记：
对上述的100个个体的基因组DNA进行测序，经DNAMAN软件分析发现存在一个SNP位点，该SNP位点位于SEQ ID NO.3所示序列的145位点处，在SEQ ID NO.3序列中用n表示该处位点，且此处位点的碱基为T或A，SNP标记位点处TT、TA 和AA三种基因型的测序峰图如图1所示。经生物统计分析，发现这一SNP位点与红鳍东方鲀的生长性状紧密相关，该位点处基因型为纯合TT的红鳍东方鲀的体重、体长及体全长等生长性状显著高于此处基因型为纯合AA或杂合TA的红鳍东方鲀。
在SNP位点的两侧设计一对引物，对红鳍东方鲀基因组DNA进行PCR扩增，其引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示。
2．以所得SNP引物筛选红鳍东方鲀苗种
2.1 提取待测红鳍东方鲀鳍条中的基因组DNA
待测红鳍东方鲀来自上述红鳍东方鲀群体，随机选取51尾鱼，按照上述的DNA提取方法抽提基因组DNA；
2.2 以所得基因组DNA为模板进行PCR扩增
以提取获得的各待测红鳍东方鲀的基因组DNA为模板，利用所设计的上游引物（SEQ ID NO.1）和下游引物（SEQ ID NO.2）进行PCR扩增，得PCR产物（609bp）；
PCR反应体系为25μl，反应程序为：10pmol/L的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示的上下游引物各1μl，30-200ng/μl 的模板DNA 1μl， 10mmol/L 的dNTP mix 2.0μl，10×PCR 反应缓冲液2.5μl，5U/μl 的Taq DNA 聚合酶0.5μl，余量为双蒸水；该PCR 扩增的反应条件为：94℃ 4 分钟；94℃ 25 秒，58℃ 25 秒， 72℃ 30 秒，32个循环；72℃ 7分钟。
c. 按照现有技术的方法（如ABI3730 测序仪）对所得到的PCR产物进行测序、基因分型，均具有SEQ ID NO.3所示DNA序列且自5′端起第145位点处的碱基为T或A，选出SNP位点处基因型为纯合TT的红鳍东方鲀为苗种。
51个待测红鳍东方鲀个体该SNP位点的基因型及其生长性状如表1所示。
表1
从表1可以看出SNP位点处基因型为纯合TT的红鳍东方鲀的体重、体长及体全长生长性状高于此处基因型为纯合AA或杂合TA的红鳍东方鲀。
2.3 SNP位点基因型与红鳍东方鲀体重、体长和体全长等生长性状的关联分析
基于表1的结果，利用SPSS18.0 软件，对该SNP位点的基因型与生长性状（体重、体长和体全长）分别进行最小二乘的统计分析，计算该SNP位点的基因型与生长性状的关联性。
采用的模型如下：
Yij = μ + Gi + eij
其中 Yij 表示i基因型的第j个个体的生长性状测定值； µ 是测定值的均值； Gi 是基因型i的遗传效应；eij 表示随机误差效应。
结果见表2。
表2
注：同列中字母相同为差异不显著，相隔字母为差异极显著（P＜0.01）
由表2可知，基因型为TT纯合型个体的体重、体长和体全长等生长性状高于TA杂合型个体的对应值，显著高于AA纯合型个体的生长性状的表型值（P<0.01）。进而证明SEQ ID NO.3 所示核苷酸序列自5′端起第145位碱基T或A，与红鳍东方鲀生长性状显著相关，为红鳍东方鲀生长性状相关的SNP标记，该SNP标记的TT基因型个体的生长性状显著高于AA和TA 基因型个体。
序列表
<110> 大连海洋大学
<120> 筛选红鳍东方鲀苗种的SNP引物及筛选方法
<160> 3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物
<400> 1
aactcaagtcgaggcaatgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物
<400> 2
tccgaatagatgaccgatgc 20
<210> 3
<211> 609
<212> DNA
<213> 红鳍东方鲀
<220>
<221> 与红鳍东方鲀体重、体长和体全长相关的SNP分子标记
<222> （145）
<223> n=t或a
<400> 3
aactcaagtc gaggcaatgc gggtggcaga aattacagaa tgtaggcgag gagcgaatgg 60
acaaatgccc agcgacttga gaggagagaa gggagtggcc ttacctggta cccctgtgga 120
atggttcact gtaaaacaaa aggcnaacaa tgccccgaaa agctcttcac aatgattgaa 180
acaggagagc tacctattgt ttaagcgttt gatgagggat cttgttatta ttttatacac 240
tgcaccattc catactggga ggaattcttt gttaatgcaa tgtaaaagac tagcttagct 300
gctgagacac aaacaagagc ttaatgtcac ctccatatgg gggggctgca gcagggggct 360
ccaggtggga caaatccatc tgggttgtag ccaatcagag agctgcaagc tggctttgca 420
aactaatggt ccaccttgtt ccttgaggtt tgtggaggta tcagcccttt gaccccgagt 480
ggagtcatta tgctccttcg ctaggacagg atgttctgtc agaagtcgcg cataacagta 540
aaaattaact cgtttttatg ctttatatcc ccttcattga ctgagtgcag catcggtcat 600
ctattcgga 609