本发明属于植物分子遗传学领域，涉及一种水稻3号染色体上与结实率相连锁的SSR引物对及其在选育水稻品种中的应用。
背景技术：
SSR标记又称为simple sequence repeat，是目前最常用的微卫星标记之一。核心结构是由2-6个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸序列，通常都是保守性较强的单一序列，其两侧是相对保守和特异的单拷贝序列。根据特异保守的序列，可以人工合成引物进行PCR扩增，由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。因此，PCR产物产生了长度的多态性。SSR标记建立在PCR技术上，由于具有共显性、含量丰富、多态性高的特点，因此广泛运用在动植物的遗传育种研究上。
水稻结实率是影响产量的重要因子，利用SSR和各类标记，群体进行水稻结实率的定位与克隆的工作一直方兴未艾。陈庆全等利用低结实率的籼稻材料和高结实率的籼稻品种T226为亲本构建重组自交系，对重组自交系的结实率进行基因型和环境互作分析、QTL定位分析，结果发现17个与结实率相关的QTL，其中大部分QTL均只在1个或2个特定的环境中发现，而位于第3染色体MRG5959-MRG2180区间的qSSR3-1,共在6个环境中一致检测到,贡献率分别在各环境中均为最大(15.6-35.7％)、其增效的等位基因来源于亲本T226(陈庆全，2007)。周勇等利用染色体单片段代换系定位水稻结实率QTLs，以广陆矮4号和Japonica的85个染色体单片段代换系为研究材料，通过单因素方差分析和多重比较，对与结实率相关的QTLs进行检测。结果发现9个结实率QTLs，分布于水稻12条染色体中的7条染色体上(周勇，2013)。高云等利用染色体单片段代换系定位水稻结实率QTL，以籼稻品种扬稻6号为受体、粳稻品种Japonica为供体构建的一套染色体片段代换系为材料，利用多元回归分析方法，结合Bin图谱，对代换系上的结实率QTL进行鉴定，结果表明，14个控制水稻结实率性状的QTL，分别位于3-11染色体。贡献率最大的QTL为qSSR5.1，贡献率为49.76％，被定位在第5染色体上731482bp区间内(高云，2014)。
目前，国内研究对结实率的研究集中在QTL定位和基因克隆方面，在分子标记辅助选择育种和对育种材料中结实率相关位点的检测较少。
大量的水稻结实率的相关QTL定位为水稻高结实率的育种奠定了理论基础，然而多数QTL是基于两种结实率有显著差异的材料组配群体进行研究，在后代群体中鉴定获得。仅仅停留在定位的阶段。他们具有以下缺点：
(1)仅在两个亲本材料中具有多态性，筛选到的与结实率相关的SSR标记在特定群体中有相关关系。
(2)定位群体中与结实率相关的SSR标记，尚未在育种材料中进行检测，尚未见到结实率相关SSR引物对不同结实率的水稻种质进行鉴定和联系。因此利用率并不高。
技术实现要素：
为了解决水稻育种中对育种材料结实率的早期检测问题，以及解决与结实率相关QTL的聚合问题，本发明提供一种水稻3号染色体上与结实率相连锁的SSR引物对，用于检测育种材料中结实率相关的本QTL是否存在。能够快速判断植株是否携带高结实率基因。利用传统技术判断水稻结实率要等到结实后肉眼观察，如果差异小，要等到种子成熟以后计算，周期较长。利用分子标记辅助选择，可以直接在苗期判断是否含有高结实率QTL，快速方便。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种水稻3号染色体上与结实率相连锁的SSR引物对，所述的引物对的上游引物为Seq ID NO.1所示的序列，所述引物对的下游引物为Seq ID NO.2所示的序列。
本发明还提供了所述的水稻3号染色体上与结实率相连锁的SSR引物对用于筛选水稻是否携带高结实率基因的方法，包括步骤：以待检测的水稻基因组DNA为模板，以权利要求1所述的SSR引物对进行PCR扩增，与低结实率的Japonica的条带进行对比，从而鉴定材料中是否含有高结实率的相关基因。
本发明还提供了所述的水稻3号染色体上与结实率相连锁的SSR引物对在水稻辅助育种中的用途。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
(1)本发明提供的水稻3号染色体上与结实率相连锁的SSR引物对，是与结实率QTL相关的连锁SSR标记，能够在36份核心种质中较为准确鉴定高结实率材料和低结实率材料的特异条带。能够在育种材料中进行早期的结实率的预测和对是否含有与结实率相关基因的判断。可以快速鉴定育种材料是否含有结实率相关的QTL。成本低廉，鉴定简单，指向性明确。
(2)本发明提供的水稻3号染色体上与结实率相连锁的SSR引物对与结实率高度相关，是一个与结实率相关的QTL，贡献率为11.90％，是一个新的未报道过的与结实率相关的QTL。
(3)本发明提供的水稻3号染色体上与结实率相连锁的SSR引物对在36份结实率不同的核心种质中检测，能够有效检测高结实率的特异条带和低结实率的特异条带，快速高效在水稻植株幼苗前期确定水稻材料是否含有结实率相关QTL或是否含有高结实率基因。因此，利用本发明，可以快速高效鉴定水稻育种材料是否含有结实率相关QTL。
附图说明
图1为为本发明的水稻3号染色体上与结实率相连锁的SSR引物对在36份核心水稻种质中扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带；
有关附图标记的说明：
1-DOZIANCLOUA::IRGC 56877-1；2-STG 556011::IRGC 4059-1；3-VILLAGUAY P A::IRGC 117259-1；4-RATHAL::IRGC 31524-1；5-CANELLA DE FERRO；6-VARY MADINIKA 3566::GERVEX 8448-C1；7-SULTANI；8-KERITING TINGGI；9-KU 115；10-SUTHUWEE::IRGC 8915-1；11-ORYZICA SABANA 10::IRGC 117018-1；12-WAS 198-B-3-1-3::C1；13-ANAYANSI::IRGC 77474-1；14-IR 5::IRGC 10321-1；15-PERUM KARUPPAN::IRGC 15524-1；16-LAL BAGDAR::IRGC 77272-1；17-TOKAMBANY 669::GERVEX 8406-C1；18-SALUMPIKIT::IRTP 4777-C1；19-E 5168::IRGC 68021-1；20-Japonica；21-TSIPALA FOTSY::IRGC 69973-1；22-YE TI ZHAN::IRGC 68296-1；23-PICONEGRO::IRGC 117022-1；24-NCS 130::IRGC 51879-1；25-YAKADA::IRGC 51096-1；26-GBUAPU 1::IRGC 63265-1；27-MANDRIRAVINA::IRGC 69960-1；28-BAKUNG(H)::IRGC 60220-1；29-ZALCHA::IRGC 62190-1；30-PAWHTUN::IRGC 33562-1；31-ATHKANDIRAM::IRGC 36507-1；32-PURBIA(KALANSAR)::IRGC 59189-1；33-SUDUWEE::IRGC 8972-1；34-IR 31917-45-3-2::IRGC 78132-1；35-PEH-KUH-TSAO-TU；36-XI NUO ZAO::IRGC 68279-1。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
以下实施例中使用的仪器、试剂、试剂盒均可由市售得到；RM523为实施例中所述分子标记。
实施例1：引物筛选
SSR引物下载于www.genomene.org；RM523 SSR引物序列如表1所示。表6中SSR的序列本身来自于公开的网络资源。
表1 RM523序列
实施例2：CTAB法提取水稻的总DNA，步骤如下：
(1)每一材料称取0.4-0.5g的新鲜叶片，在研钵中加入液氮迅速研磨粉碎，然后转入2.0mL的无菌离心管中；干材料则在此之前先用粉碎器粉碎，并取粉末；
(2)每管加入预热65℃的CTAB提取缓冲液(pH8.0)700μL，65℃水浴45min，每隔5min取出摇匀1次；
(3)加入700μL氯仿/异戊醇(24:1)轻柔混摇8min，然后12000r/min离心10min；
(4)取上清液转入另一1.5mL的无菌离心管中，加入600μL预冷的异丙醇，颠倒混匀，置于-20℃冰箱冷冻30min以上；
(5)将离心管以12000r/min离心10min，取沉淀；
(6)无水乙醇漂洗1次，离心后，小心去掉乙醇；
(7)晾干或风干后加入灭菌水溶解，使终浓度达到20ng/μL，备用。
表2 CTAB提取液(1000ml)的配方pH＝8.0
表3 PCR反应体系
然后采用东胜创新公司的ETC-811PCR扩增仪，15μLPCR反应体系，扩增程序为：
预变性，95℃，5分钟；
变性，95℃，40秒；
退火，55℃，30秒；
延伸，72℃，50秒；
重复2-4步骤，35个循环；
72℃延伸10分钟，产物4℃保存。
PCR产物加2％溴酚蓝3μL，95℃变性5分钟，8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，参照Panaud等(1996)银染和显色方法改良的快速染显技术进行染色和读带，根据PCR产物的大小记录标记。
8％丙烯酰胺变性胶溶液由40％的丙烯酰胺母液(4℃保存)配置而来，配方如下表4、表5和表6。
表4 40％丙烯酰胺母液
表5 5×TBE缓冲液
表6 8％丙烯酰胺变性溶液
电泳步骤：
加入1×TBE电泳缓冲液700mL，插入48孔梳子，点样1μL，恒功率80W，电泳45min。
染色方法(快速法)：
扩增产物用8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离后，染色方法和步骤如下：
染色8-12min(1200mL染液中含硝酸银1.5g，酒精100mL)；
去离子水迅速漂洗5-10秒；
显影10min(1300mL显液中含氢氧化钠11g，37％的甲醛6mL)；
去离子水漂洗3-5min后取出晾干。
表7 36份核心种质信息与结实率
如表7所示，利用SSR引物对结实率相关的QTL进行检测，检测到一个与结实率高度相关的QTL位于3号染色体上，相关的SSR引物为RM523，该QTL贡献率为11.90％。对36份均来自国家种质库的水稻品种按实例中的方法进行水稻结实率鉴定，并进行SSR标记分析。结果分析，核心种质的基因型和Japonica一样的记为A，基因型与高结实率亲本一样的记为B。结实率在95％以上的品种有19份，其中18份为高结实率的带型，占全部种质的94.73％，结实率在80％以下的品种有15份，其中11份为Japonica带型(参照图1)，占全部种质的73.33％。
综上所述，本发明的水稻3号染色体上与结实率相连锁的SSR引物对RM523可以较明显地区分同一环境条件下结实率高低的品种。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。